該非臨時專利申請要求于2013年12月18日提交的題為“用作下游蛋白質(zhì)糖重構(gòu)的底物的去糖基化的重組蛋白質(zhì)的體內(nèi)制備的方法”的第61/917,793系列號美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，以引用方式將其全部內(nèi)容并入本文。

發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般地涉及翻譯后蛋白質(zhì)修飾的領(lǐng)域，更具體地，涉及在體內(nèi)制備具有降低的糖基化的蛋白質(zhì)。

引入光盤上提交的材料作為參考

無。

發(fā)明背景

在不限制本發(fā)明的范圍的情況下，結(jié)合蛋白質(zhì)糖基化描述其背景。

連接到治療性蛋白質(zhì)的N-糖基化的性質(zhì)是蛋白質(zhì)同一性的關(guān)鍵屬性，因為該性質(zhì)可以影響其治療活性、穩(wěn)定性和免疫原特性。重組蛋白質(zhì)的N-聚糖圖譜取決于用于其制備的宿主和宿主培養(yǎng)條件。對導(dǎo)致理想地由一種單一的最佳糖型構(gòu)成的均質(zhì)和一致的治療性糖蛋白的產(chǎn)生的生產(chǎn)方法存在日益增加的需求。例如，無巖藻糖基化的單克隆抗體具有升高的細(xì)胞毒活性。此外，用作治療劑的人血清蛋白通常需要人類特異性唾液酸化，這仍然是在異源表達(dá)系統(tǒng)中均勻地產(chǎn)生的一個挑戰(zhàn)。

已由他人提出體外治療學(xué)糖重構(gòu)技術(shù)來滿足糖工程化治療學(xué)的需求(Huang,W.,Giddens,J.,Fan,S.,Toonstra,C.,&Wang,L.(2012).Chemoen zymaticglycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions.Journal of the American Chemical Society,134,12308–12318；和Wang,L.,&Lomino,J.V.(2012).Emerging technologies for making glycan-defined glycoproteins.ACS chemical biology,7(1),110–22)。教導(dǎo)的方法需要提取和純化關(guān)注的糖蛋白，以第一N-乙酰氨基葡萄糖((GlcNAc)和巖藻糖如果連接的化仍然連接到蛋白質(zhì)的天冬酰胺的方式的蛋白質(zhì)的去糖基化，和使用專用內(nèi)切糖苷酶S(EndoS)突變體，用選擇的純化的或合成的激活的N-聚糖給體蛋白質(zhì)的再糖基化。去糖基化和再糖基化步驟之前和之后是純化步驟，這使得糖重構(gòu)過程費力和昂貴的(參見圖1選項A，和圖2A，標(biāo)記為現(xiàn)有技術(shù))。

糖重構(gòu)方法教導(dǎo)于例如授予DeFrees等人的第8,361,961號、第7,956,032號、第7,696,163號和第7,338,933號美國專利，包括用于重構(gòu)肽分子的方法和組合物，包括向肽添加或刪除一個或多個糖基，和/或向肽添加修飾基團，肽的O-連接的糖基化和蛋白質(zhì)的糖聚乙二醇化。

另一種方法教導(dǎo)于Wang等人提交的題為Transglycosylation Activity Of Glycosynthase Mutants Of An Endo-Beta-N-Acetylglucosaminidase(Endo-D)From Streptococcus Pneumoniae的第20130137857號美國專利申請。簡言之，認(rèn)為該發(fā)明包括顯示針對糖蛋白合成的降低的水解活性和升高的轉(zhuǎn)糖基活性的重組Endo-D和選擇的突變體，其中通過轉(zhuǎn)糖基化將希望的糖鏈添加到核心無巖藻糖基化的或非無巖藻糖基化的GlcNAc-蛋白質(zhì)受體。認(rèn)為這樣的重組Endo-D和選擇的突變體對于有效的IgG1-Fc結(jié)構(gòu)域的糖基化重構(gòu)是有用的。

又一種方法教導(dǎo)于Strome等人提交的題為Glycosylation Engineered Antibody Therapy的第20100173323號美國專利申請。簡言之，認(rèn)為該申請教導(dǎo)了產(chǎn)生糖基化工程化的抗體的方法，以及使用糖基化-工程化的抗體治療患者的方法，特別是癌癥患者或患有免疫疾病或障礙的患者。該發(fā)明還包括產(chǎn)生糖基化-工程化的抗體以用于治療不響應(yīng)常規(guī)抗體療法的具有多態(tài)性的患者的方法，通過糖基化工程化改善生物活性的方法，和使用糖基化-工程化的抗體調(diào)節(jié)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的方法。

發(fā)明概述

在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種降低蛋白質(zhì)的糖基化的方法，包括：獲得表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，所述蛋白質(zhì)包括一個或多個糖基化位點并且被糖基化；在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種糖苷酶，所述糖苷酶切割一個或多個來自所述一種或多種蛋白質(zhì)的糖基以降低蛋白質(zhì)的糖基化，其中所述糖苷酶；和分離來自細(xì)胞的具有降低的糖基化的一種或多種蛋白質(zhì)。在一個方面中，一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種，或一種或多種糖苷酶中的一種或多種是瞬時表達(dá)的。在另一個方面中，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞。在另一個方面中，所述一種或多種蛋白質(zhì)為抗體、抗體片段、生長因子、淋巴因子、酶、受體、受體結(jié)合蛋白、核酸結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶被重組修飾以進(jìn)一步包括使一種或多種糖苷酶靶向進(jìn)入引起蛋白質(zhì)的糖基化的蛋白質(zhì)加工的特定細(xì)胞區(qū)室的部分。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶被序列重組修飾，所述序列使得糖苷酶靶向進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向進(jìn)入囊泡。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶選自葡糖苷酶、木聚糖酶、唾液酸酶、乳糖酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、神經(jīng)氨酸苷酶、轉(zhuǎn)化酶、透明質(zhì)酸酶和溶菌酶。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶選自以下至少一種：內(nèi)切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2巖藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶、N糖苷肽酶F,N糖苷肽酶A,胎球蛋白、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。在另一個方面中，所述方法還包括在體外或體內(nèi)分離后將新的糖基化添加到一種或多種蛋白質(zhì)的步驟。在另一個方面中，所述細(xì)胞組成性表達(dá)所述一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種糖苷酶或兩者。

在另一個實施方案中，本發(fā)明包括降低蛋白質(zhì)的糖基化的方法，包括：共表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含一個或多個糖基化位點并且在細(xì)胞中被一種或多種糖苷酶糖基化，其中所述一種或多種糖苷酶起到降低或消除細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)的糖基化的作用；和純化來自細(xì)胞的一種或多種蛋白質(zhì)，其中所述糖苷酶對一種或多種蛋白質(zhì)上的糖基化起作用。在另一個方面中，一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種，或一種或多種糖苷酶中的一種或多種是瞬時表達(dá)的。在另一個方面中，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞。在另一個方面中，所述關(guān)注的蛋白質(zhì)為抗體、抗體片段、生長因子、淋巴因子、酶、受體、受體結(jié)合蛋白、核酸結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶被重組修飾以進(jìn)一步包括使一種或多種糖苷酶靶向進(jìn)入引起蛋白質(zhì)的糖基化的蛋白質(zhì)加工的特定細(xì)胞區(qū)室的部分。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶被序列重組修飾，所述序列使得糖苷酶靶向進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向進(jìn)入囊泡。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶選自葡糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、神經(jīng)氨酸苷酶、轉(zhuǎn)化酶、透明質(zhì)酸酶和溶菌酶。在另一個方面中，所述一種或多種糖苷酶選自以下至少一種：內(nèi)切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2巖藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、N糖苷肽酶A、胎球蛋白、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。在另一個方面中，所述方法還包括在體外或體內(nèi)純化后將新的糖基化添加到一種或多種蛋白質(zhì)的步驟。在另一個方面中，所述方法還包括在純化后將新的糖基化添加到一種或多種蛋白質(zhì)的步驟，所述蛋白為Endo H、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2巖藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、胎球蛋白、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的突變體，以及具有糖苷合成酶活性的那些。在另一個方面中，所述細(xì)胞組成性表達(dá)所述一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種糖苷酶或兩者。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括降低蛋白質(zhì)的糖基化的方法，包括：共表達(dá)一種或多種包含一個或多個糖基化位點并且被糖基化的蛋白質(zhì)，和一種或多種切割來自細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)的一個或多個糖基化的糖苷酶；和純化來自細(xì)胞的一種或多種蛋白質(zhì)，其中所述糖苷酶作用于所述一種或多種蛋白質(zhì)上的糖基化；和使用突變糖苷酶再糖基化所述一種或多種蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括評價被認(rèn)為對于治療疾病狀態(tài)有用的候選藥物的方法，所述方法包括：a)測量來自從疑似具有疾病狀態(tài)的一組患者獲得的一種或多種組織的疾病狀態(tài)的水平；b)將如上所述修飾的候選蛋白質(zhì)給予第一亞組的患者，并且將未修飾的比較蛋白質(zhì)給予第二亞組的患者；c)在給予候選藥物或比較蛋白質(zhì)后重復(fù)步驟a)；和d)測定候選藥物是否具有改進(jìn)的疾病的醫(yī)學(xué)結(jié)果，與第二亞組的患者中發(fā)生的任何降低或等同相比，所述改進(jìn)的疾病的醫(yī)學(xué)結(jié)果在第一亞組的患者中是統(tǒng)計學(xué)顯著的或等同的，其中統(tǒng)計學(xué)顯著的降低或等同表明候選藥物對治療疾病狀態(tài)是有用的。在一個方面中，所述一種或多種蛋白質(zhì)選自抗體、抗體片段、生長因子、淋巴因子、酶、受體、受體結(jié)合蛋白、核酸結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括糖蛋白，由包括以下的方法制備：獲得表達(dá)一種或多種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，所述蛋白質(zhì)包括一個或多個糖基化位點并且被糖基化；在細(xì)胞中表達(dá)一種或多種糖苷酶，所述糖苷酶切割一個或多個來自所述一種或多種蛋白質(zhì)的糖基以降低蛋白質(zhì)的糖基化；和分離來自細(xì)胞的一種或多種蛋白質(zhì)，其中所述糖苷酶作用于細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)上的糖基化，以降低一種或多種蛋白質(zhì)的糖基化。在另一個方面中，一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種，或一種或多種糖苷酶中的一種或多種是瞬時表達(dá)的。在另一個方面中，所述細(xì)胞為植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞。在另一個方面中，所述一種或多種蛋白質(zhì)為抗體、抗體片段、生長因子、淋巴因子、酶、受體、受體結(jié)合蛋白、核酸結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、孔、通道、激酶、磷酸酶或G-蛋白。在另一個方面中，一種或多種糖苷酶被重組修飾以進(jìn)一步包括使一種或多種糖苷酶靶向進(jìn)入引起蛋白質(zhì)的糖基化的蛋白質(zhì)加工的特定細(xì)胞區(qū)室的部分。在另一個方面中，一種或多種糖苷酶被序列重組修飾，所述序列使糖苷酶靶向進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向進(jìn)入囊泡。在另一個方面中，一種或多種糖苷酶選自葡糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、蔗糖酶、麥芽糖酶、神經(jīng)氨酸苷酶、轉(zhuǎn)化酶、透明質(zhì)酸酶和溶菌酶。在另一個方面中，一種或多種糖苷酶選自以下至少一種：內(nèi)切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2巖藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、N糖苷肽酶A、胎球蛋白、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。在另一個方面中，糖蛋白還包括在分離后將新的糖基化添加到一種或多種蛋白質(zhì)。在另一個方面中，細(xì)胞組成性表達(dá)所述一種或多種蛋白質(zhì)、一種或多種糖苷酶或兩者。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括由包括以下的方法制備的糖蛋白：在被重組修飾以表達(dá)糖苷酶的植物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)；分離在細(xì)胞中表達(dá)和去糖基化的蛋白質(zhì)；在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)中至少一種中，在一種或多種糖的存在下再糖基化蛋白質(zhì)；和分離糖基化的蛋白質(zhì)。

附圖的簡要說明

為了更完整地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，現(xiàn)在參照本發(fā)明的詳述以及附圖，其中：

圖1A和1B分別顯示在糖重構(gòu)策略下的重組蛋白質(zhì)的體內(nèi)和體外N-聚糖加工。圖1A顯示選項A，其為他人使用的現(xiàn)有技術(shù)。圖1B顯示本發(fā)明的選項B途徑，其涉及關(guān)注的蛋白質(zhì)(例如，利妥昔單抗)的體內(nèi)去糖基化。在選項B中，連接到關(guān)注的蛋白質(zhì)的高甘露糖聚糖被切下，留下去糖基化的底物用于體外再糖基化。

圖2A顯示了現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體糖重構(gòu)的示意圖，其使用體外方法用于去糖基化和再糖基化。相反地，圖2B顯示使用體內(nèi)去糖基化接著體外再糖基化的本發(fā)明的單克隆抗體糖重構(gòu)的示意圖。

圖3顯示源自僅表達(dá)hIgG1(-)或與EndoH一起表達(dá)(+)的植物組織的純hIgG1的SDS-PAGE。注意到當(dāng)與EndoH一起表達(dá)時，抗體重鏈由于植物原位去糖基化而導(dǎo)致分子量移位。

圖4顯示從僅表達(dá)hIgG1的植物組織獲得的hIgG1的去卷積的ESI-MS譜。在非還原條件下分析樣品。大多數(shù)蛋白質(zhì)在兩條重鏈上均被糖基化，少數(shù)的hIgG1半糖基化(兩條重鏈中僅有一條被糖基化)。

圖5顯示從表達(dá)hIgG1與EndoH的植物組織獲得的hIgG1的去卷積的ESI-MS譜。在非還原條件下分析樣品。注意到來自糖基化形式的分子量移位到蛋白質(zhì)的去糖基化形式。去糖基化的hIgG1，質(zhì)量為143,268Da，相當(dāng)于每條重鏈上連接兩個N-乙酰己糖胺(GlcNAc)的蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量。

圖6顯示在使用β-巰基乙醇還原后的標(biāo)準(zhǔn)的MALDI-TOF質(zhì)譜，顯示m/z 40,000至80,000的質(zhì)量范圍。

圖7顯示在使用β-巰基乙醇還原后的植物制備的利妥昔單抗的MALDI-TOF質(zhì)譜，顯示m/z 40,000至80,000的質(zhì)量范圍。

圖8顯示用EndoH植物原位去糖基化并且使用β-巰基乙醇還原的植物制備的利妥昔單抗的MALDI-TOF質(zhì)譜，顯示m/z 40,000至80,000的質(zhì)量范圍。

圖9顯示植物原位EndoH去糖基化的利妥昔單抗接著胰蛋白酶消化的縮放的(m/z 1100-1500)MALDI-TOF質(zhì)譜。

圖10顯示源自僅表達(dá)E2(-)或與EndoH一起表達(dá)(+)的植物組織的Ni²⁺-NTA純化的E2的SDS-PAGE。注意到當(dāng)與EndoH一起表達(dá)時，蛋白質(zhì)(二聚體以及單體)由于植物原位去糖基化而導(dǎo)致分子量移位。

圖11顯示了單獨表達(dá)或與EndoH一起植物原位表達(dá)的CSFV E2的MALDI-TOF質(zhì)譜的比較，顯示m/z 25,000至120,000的質(zhì)量范圍。如果考慮六個保留在蛋白質(zhì)上的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，糖基化的E2二聚體的質(zhì)量預(yù)期為～92kDa(單體預(yù)期為46kDa)。去糖基化的二聚體預(yù)期為80kDa(單體預(yù)期為40kDa)。

發(fā)明詳述

雖然制備和使用本發(fā)明的各種實施方案在以下更詳細(xì)地討論，但應(yīng)理解本發(fā)明提供了可以在各種特定背景下實施的許多適用的發(fā)明性構(gòu)思。本文討論的具體實施方案僅說明制備和使用本發(fā)明的具體方式，不限制本發(fā)明的范圍。

為了易于理解本發(fā)明，以下定義了許多術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語如“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”不旨在僅指代單數(shù)實體，而且包括具體實例可以用于說明的一般類別。本文的術(shù)語用于描述本發(fā)明的具體實施方案，但其使用不限定本發(fā)明，除非在權(quán)利要求中指出。

如本文所使用，術(shù)語“糖類”、“多糖”、或“糖”可以互換地用來指氧化或未氧化的L-或D-異構(gòu)體的單糖、二糖、三糖、寡糖或多糖，包括但不限于例如甘露糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸)、葡萄糖、果糖、巖藻糖、山梨糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、N-乙酰半乳糖胺、二羥基丙酮、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘油醛、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖或其任意組合。術(shù)語“糖類”、“多糖”、“糖”包括天然、重組、合成和/或半合成制備的分子，其可以是直鏈和/或支鏈的。

一種或多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，根據(jù)制造商的說明書或如本領(lǐng)域通常實現(xiàn)的或如本文所述進(jìn)行酶反應(yīng)和純化技術(shù)。前述技術(shù)和程序如一般地根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，以及如貫穿本說明書引用和討論的各種一般的和更具體的參考文獻(xiàn)中所描述地進(jìn)行。參見Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989),Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),and Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，出于所有目的將其全文引入本文作為參考。本文結(jié)合本文描述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)和藥物和制藥化學(xué)使用的命名法，以及本文描述的分析化學(xué)、合成有機化學(xué)和藥物和制藥化學(xué)的實驗室程序和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知且常用的。

用于使用本發(fā)明制備有用的劑型的技術(shù)和組合物描述在以下參考文獻(xiàn)的一個或多個中：Anderson,Philip O.；Knoben,James E.；Troutman,William G編,Handbook of Clinical Drug Data,第10版,McGraw-Hill,2002；Pratt和Taylor編,Principles of Drug Action,第3版,Churchill Livingston,New York,1990；Katzung編,Basic and Clinical Pharmacology,第9版,McGraw Hill,20037ybg；Goodman和Gilman編,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw Hill,2001；Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,Lippincott Williams&Wilkins.,2000；Martindale,The Extra Pharmacopoeia,第32版(The Pharmaceutical Press,London,1999)；等等，將其全部引入本文作為參考，將其相關(guān)部分引入本文作為參考。

如本文所使用，術(shù)語“基因”是指功能蛋白質(zhì),多肽或肽編碼單元。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，該功能術(shù)語包括基因組序列，cDNA序列或其片段或組合，以及基因產(chǎn)物，包括已經(jīng)人工改變的那些。純化的基因、核酸、蛋白質(zhì)等用來指當(dāng)確定并從其通常相關(guān)的至少一種污染的核酸或蛋白質(zhì)分離時的這些實體。

如本文所使用，使用的術(shù)語“載體”涉及將DNA片段從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的核酸分子。載體可以進(jìn)一步定義為設(shè)計以傳播具體序列的載體，或定義為包括可操作地連接到具體序列的啟動子的表達(dá)盒，或設(shè)計以導(dǎo)致這樣的啟動子被引入的載體。載體可以以獨立于宿主細(xì)胞染色體的狀態(tài)存在，或可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。

如本文所使用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)被工程化或操縱以包含核酸片段或改變的片段的細(xì)胞，該細(xì)胞是古細(xì)胞、原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。因此，工程化或重組細(xì)胞與天然存在的細(xì)胞是可以區(qū)分的，所述天然存在的細(xì)胞不包含通過人工重組引入的基因。操縱的非限定實例包括轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染。

如本文所使用，術(shù)語“同源性”是指兩個核酸互補的程度?？梢杂胁糠只蛲耆葱?。部分互補序列是至少部分抑制完全互補序列與靶核酸雜交的序列，并且是指使用功能術(shù)語“基本上同源”。雜交的度或程度可以使用雜交或其他分析(如競爭性PCR分析)檢查，并且如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，旨在包括即使在低嚴(yán)格性下的特異性相互作用。

如本文所使用，術(shù)語“抗體”是指可以與完整抗體競爭特異性結(jié)合于靶抗原的任意同種型的完整免疫球蛋白或其片段，并且包括嵌合、人源化、全人源和雙特異性抗體。完整抗體一般將包含至少兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈，但在一些情況下可以包括更少重組制備或天然發(fā)現(xiàn)的鏈。抗體可以僅源自單一來源，或可以是“嵌合的”，即，抗體的不同部分可以源自兩個不同的抗體。例如，互補性決定區(qū)(CDR)可以源自大鼠、小鼠或倉鼠來源，而V區(qū)的框架區(qū)源自不同的動物來源，例如人類。抗體或結(jié)合片段可以使用噬菌體展示通過重組技術(shù)在雜交瘤中制備，或通過酶或化學(xué)切割完整抗體制備。除非另有說明，術(shù)語“抗體”除了包含兩條全長重鏈和兩條全長輕鏈的抗體以外，包括其衍生物、變體、融合蛋白、片段和突變體。

如本文所使用，術(shù)語“輕鏈”是指具有足夠的可變區(qū)序列以賦予結(jié)合特異性的全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫為V_L)，和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫為C_L)。輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在多肽的氨基末端。輕鏈包括κ鏈和λ鏈。

如本文所使用，術(shù)語“重鏈”是指具有足夠的可變區(qū)序列以賦予結(jié)合特異性的全長重鏈及其片段。全長重鏈包括可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫為V_H)，和三個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(本文縮寫為C_H1、C_H2和C_H3)。V_H結(jié)構(gòu)域在多肽的氨基末端，并且C_H結(jié)構(gòu)域在羧基末端，其中C_H3最接近-COOH端。重鏈可以具有任何同種型，包括IgG(包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄亞型)，IgA(包括IgA₁和IgA₂亞型)，IgM和IgE或其在其他動物中的等同物。

如本文所使用，術(shù)語“Fab'”是指包含以下的多肽抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域的異源二聚體的，加上抗體輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域，加上在包括一個或多個半胱氨酸殘基的重鏈C_H1結(jié)構(gòu)域的羧基末端的至少一個另外的氨基酸殘基。F(ab')₂抗體片段是Fab'抗體片段對，其通過共價鍵連接。Fab'重鏈可以包括鉸鏈區(qū)。這可以是任何希望的鉸鏈氨基酸序列。供選擇地，鉸鏈可以被完全省去以有利于單個半胱氨酸殘基或短(約1-10個殘基)的包含半胱氨酸的多肽。在某些應(yīng)用中，使用常見的天然存在的抗體鉸鏈序列(半胱氨酸接著兩個脯氨酸然后另一個半胱氨酸)；該序列見于人IgG₁分子的鉸鏈中(E.A.Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest第3版(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987))。在其它實施方案中，鉸鏈區(qū)選自另一個期望的抗體類型或同種型。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)ab'的C_H1的C-末端融合到序列Cys X X。X可以是Ala，但其可以是其它殘基，如Arg、Asp或Pro?？梢詣h除一個或兩個X氨基酸。

如本文所使用，術(shù)語“鉸鏈區(qū)”是指位于天然免疫球蛋白或其任意序列變體中的C_H1和C_H2之間的氨基酸序列。將采用其它免疫球蛋白的類似區(qū)域，但將理解的是，鉸鏈區(qū)的尺寸和序列可以廣泛地變化。例如，人IgG₁的鉸鏈區(qū)僅為約10個殘基，而人IgG₃的鉸鏈區(qū)為約60個殘基。

如本文所使用，術(shù)語“Fv”是指共價或非共價相關(guān)的重鏈和輕鏈異源二聚體，其未包含恒定結(jié)構(gòu)域。

如本文所使用，術(shù)語“Fv-SH”或“Fab'-SH”在本文中定義為具有半胱氨酰游離巰基的Fv或Fab'多肽。游離巰基在鉸鏈區(qū)中，其中輕鏈和重鏈半胱氨酸殘基通常參與鏈間鍵合存在于它們的天然形式中。在本發(fā)明的最優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)ab'-SH多肽組合物不含異源蛋白降解片段，并且基本上(大于約90mol％)不含F(xiàn)ab'片段，其中重鏈和輕鏈被還原或以另外的方式衍生化，以便于不以其天然狀態(tài)存在，例如，通過形成異常二硫化物或巰基加成產(chǎn)物。

如本文所使用，術(shù)語“糖苷酶”、“糖苷水解酶”或“糖基水解酶”是指協(xié)助在復(fù)合糖例如多糖中的糖苷鍵的水解的酶。在本發(fā)明的非限定性實例中，多糖連接到糖蛋白，即，一個或多個多糖鏈連接的蛋白質(zhì)或多肽。用于本發(fā)明的糖苷酶的非限定性實例包括內(nèi)切糖苷酶(例如，EndoA、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoD、EndoH、EndoM、EndoS)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α1-2巖藻糖苷酶、α1-2,3甘露糖苷酶、α1-3,6半乳糖苷酶、α2-3神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰己糖胺酶f、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β1-3半乳糖苷酶、β1-4半乳糖苷酶、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸苷酶、N糖苷肽酶F、N糖苷肽酶A、胎球蛋白、O-糖苷酶、神經(jīng)氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶和/或β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。

如本文所使用，術(shù)語“糖基化”是指將糖或糖基添加到多肽，其通常是N-連接或O-連接的。N-連接的糖基化是指將糖類部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列的非限定性實例包括天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸，其為用于將糖類部分酶促連接到天冬酰胺側(cè)鏈的典型的識別序列。在多肽中存在三肽序列產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化是指將一個糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖)連接到羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。對于在本發(fā)明中的使用，蛋白質(zhì)的再糖基化可以在體外和/或在細(xì)胞中。

如本文所使用，術(shù)語“人源化抗體”是指免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段，其能夠結(jié)合于預(yù)定的抗原，并且包括基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的FR區(qū)域和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列或工程化以結(jié)合于預(yù)選抗原的序列的CDR。

如本文所使用，術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用并且所有這樣的名稱包括子代。因此，單詞“轉(zhuǎn)化株”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞及源自其的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)量。還理解的是所有子代的DNA含量由于有意或無意的突變而可以不精確地相同。包括具有與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的相同功能或生物活性的突變體子代。

如本文所使用，術(shù)語“質(zhì)?！笔侵感戵wp在前和/或接著大寫字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)粒是可商購的，在不受限的基礎(chǔ)上是公眾可得的，或可以根據(jù)公開的程序由這樣的可得的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，其他等價的質(zhì)粒在本領(lǐng)域是已知的，并且將對普通技術(shù)人員是顯而易見的。

如本文所使用，術(shù)語“回收”或“分離”來自限制性酶切消化的給定的DNA片段是指通過電泳在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上分離消化物，通過將其遷移率與具有已知分子量的標(biāo)記DNA片段的遷移率相比來確定關(guān)注的片段，移出包含希望的片段的凝膠部分，和分離凝膠和DNA。該程序是公知的。例如，參見Lawn等人(Nucleic Acids Res.1981.9:6103-6114)，和Goeddel等人(Nucleic Acids Res.1980.8:4057)。

如本文所使用，術(shù)語DNA的“制備”是指分離來自宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物的質(zhì)粒DNA。通常用于DNA制備的方法是Sambrook等人的第1.25-1.33節(jié)中(Molecular Cloning:A Laboratory Manual New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)描述的大規(guī)模和小規(guī)模質(zhì)粒制備。DNA制備通過本領(lǐng)域熟知的方法純化(Sambrook等人的第1.40節(jié)，同上)。

如本文所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指外源DNA借助其進(jìn)入并改變受體細(xì)胞的方法。其可以在天然或人工條件下使用本領(lǐng)域熟知的各種方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化可以依賴于任何已知的用于將外來核酸序列插入到原核或真核宿主細(xì)胞中的方法基于被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞選擇方法，并且可以包括但不限于，病毒感染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和粒子轟擊。這樣的“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中插入的DNA能夠作為自主復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w的一部分進(jìn)行復(fù)制。

如本文所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將外源DNA引入真核細(xì)胞。轉(zhuǎn)染可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法實現(xiàn)，包括例如磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電泳、顯微注射、脂質(zhì)體融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合和基因槍。因此，術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的”是指將外源DNA引入并整合到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組中。術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子”是指外源DNA已經(jīng)穩(wěn)定整合到基因組DNA中的細(xì)胞。術(shù)語還包括在有限的時間段內(nèi)瞬時表達(dá)插入的DNA或RNA的細(xì)胞。因此，術(shù)語“瞬時轉(zhuǎn)染”或“瞬時轉(zhuǎn)染的”是指將外來DNA引入細(xì)胞，在該細(xì)胞中所述外源DNA未能整合到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組中。外來DNA存留在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞核中數(shù)日。在該期間，外來DNA經(jīng)受支配染色體中的內(nèi)源基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)控制。術(shù)語“瞬時轉(zhuǎn)染子”是指已經(jīng)攝取了外來DNA但未能整合該DNA的細(xì)胞。

如本文所使用，術(shù)語“載體”是指將DNA片段從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的核酸分子。術(shù)語“載體(vehicle)”有時與“載體”互換使用。如本文使用的術(shù)語“載體”還包括與重組DNA分子有關(guān)的表達(dá)載體，所述重組DNA分子包含在特定宿主生物體中可操作地連接的編碼序列的表達(dá)所需的希望的編碼序列和適宜的核酸序列。在原核生物中表達(dá)所需的核酸序列通常包括啟動子、操作子(任選的)和核糖體結(jié)合位點，通常與其他序列一起。已知真核細(xì)胞；利用啟動子、增強子以及終止和多腺苷酸化信號。

本發(fā)明還包括修飾蛋白質(zhì)序列以改變、刪除和/或添加糖基化或糖類連接位點。例如，還可以制備相對于母體蛋白質(zhì)具有修飾的糖基化模式的蛋白質(zhì)變體，例如，刪除一個或多個在特異性結(jié)合劑或抗體中發(fā)現(xiàn)的糖類部分，和/或添加一個或多個不存在于特異性結(jié)合劑或抗體中的糖基化位點。

蛋白質(zhì)的糖基化(例如，抗體)將通常包括至少一種N-連接的或O-連接的糖類基團。如本文所使用，“N-連接的”糖基化是指糖類部分連接到天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。例如，三肽序列天冬酰胺-Xaa-蘇氨酸或天冬酰胺-Xaa-絲氨酸，其中Xaa為除脯氨酸以外的任何氨基酸，通常是用于將糖類部分酶促連接到天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。多肽中的這些三肽序列中任一個的存在產(chǎn)生潛在的糖基化位點。因此，可以通過改變氨基酸序列以包括一個或多個這些三肽序列將N-連接的糖基化位點添加到蛋白質(zhì)。如本文所使用，“O-連接的”糖基化是指將糖類基團(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖連接到羥基氨基酸)連接到絲氨酸、蘇氨酸、羥基脯氨酸或羥基賴氨酸。

本發(fā)明通過縮短過程(以及潛在地升高產(chǎn)率)克服了現(xiàn)有的體外糖重構(gòu)的問題，最終降低了糖重構(gòu)過程的成本和時間，并且使其更易于大規(guī)模生產(chǎn)。去糖基化步驟在體內(nèi)通過使用特異性內(nèi)切糖苷酶共表達(dá)關(guān)注的蛋白質(zhì)進(jìn)行。在第一GlcNAc殘基產(chǎn)生用于再糖基化的去糖基化的蛋白質(zhì)后，內(nèi)切糖苷酶切割連接到蛋白質(zhì)的N-聚糖底物(本發(fā)明，圖1，選項B)。內(nèi)切糖苷酶的選擇將取決于其中關(guān)注的蛋白質(zhì)聚集的細(xì)胞區(qū)室以及待切去的N-聚糖的性質(zhì)。例如，特異性內(nèi)切糖苷酶(例如，EndoH)可以被靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)以在N-聚糖核心的巖藻糖基化發(fā)生之前切割連接到關(guān)注的蛋白質(zhì)的高甘露糖殘基(圖1，選項B)。在提取來自表達(dá)組織或培養(yǎng)物的關(guān)注的蛋白質(zhì)時，去糖基化的蛋白質(zhì)將被純化并進(jìn)行體外再糖基化步驟。

圖2A顯示了現(xiàn)有技術(shù)的單克隆抗體糖重構(gòu)的示意圖，其使用去糖基化和再糖基化的體外方法?，F(xiàn)有技術(shù)方法10，從步驟10的單克隆抗體(mAb)在植物中的表達(dá)開始，接著是步驟14的提取mAb。接下來，在步驟16中，將mAb施加到蛋白質(zhì)A柱，并且在步驟18交換結(jié)合緩沖液一次或多次。平行地，大腸桿菌(E.coli)用于在步驟20產(chǎn)生野生型(WT)EndoS，接著在步驟22對其進(jìn)行親和純化。獲得自親和純化的EndoS隨后在步驟24添加到在步驟18分離的蛋白質(zhì)，并且mAb在一定的時間內(nèi)在特定的溫度下去糖基化。接下來，在步驟30中使用第二蛋白質(zhì)A柱再次純化mAb，再接著緩沖液交換步驟32。平行地，在步驟34中在大腸桿菌中產(chǎn)生突變體EndoS，并在步驟36中親和純化以產(chǎn)生突變體EndoS。由此制備的突變體EndoS隨后與來自步驟32的去糖基化的mAb在步驟38中組合。在該階段，再糖基化的mAb可以隨后在步驟40中在第三蛋白質(zhì)A柱上再分離，或mAb可以在步驟42使用CEX柱親和純化，接著在步驟44中分離終產(chǎn)物。

相反地，圖2B顯示本發(fā)明的使用體內(nèi)去糖基化接著體外再糖基化的單克隆抗體糖重構(gòu)的示意圖。本發(fā)明的方法50從使用酶共表達(dá)關(guān)注的蛋白質(zhì)例如mAb的步驟52開始，所述酶在體內(nèi)使關(guān)注的蛋白質(zhì)去糖基化。接下來，在步驟54中提取關(guān)注的蛋白質(zhì)，并在步驟56中使用例如親和柱分離，其隨后可以通過緩沖液交換在步驟58中洗滌。平行地，大腸桿菌用于在步驟60表達(dá)突變糖苷酶，例如EndoS突變體，接著在步驟62分離EndoS突變體。在步驟64中，分離的去糖基化的關(guān)注的蛋白質(zhì)與突變糖苷酶組合以再糖基化關(guān)注的蛋白質(zhì)。再糖基化的關(guān)注的蛋白質(zhì)可以隨后使用第二蛋白質(zhì)A柱在步驟66中進(jìn)一步分離，或可以在步驟68中使用例如分離不同的糖型的CEX柱親和分離，接著在步驟70中分離終產(chǎn)物。

植物載體系統(tǒng)的構(gòu)建：將利妥昔單抗重鏈和輕鏈(GenBank:AX556949.1)、人IgG1、豬瘟病毒(CSFV)E2外殼蛋白(GenBank:ACL98470.1)和內(nèi)切糖苷酶H(GenBank:AAA26738.1)的基因序列融合到大麥α-淀粉酶信號肽序列(GenBank:CAX51374.1)中。對應(yīng)于CSFV E2蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域的序列被移除以生成編碼可溶性CSFV E2蛋白質(zhì)的基因。重組CSFV E2序列還被融合到6x組氨酸標(biāo)簽以促進(jìn)純化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)滯留HDEL標(biāo)簽以允許蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集。使用普通煙草(Nicotianatabaccum)密碼子使用表密碼子所有基因的植物表達(dá)，并通過Eurofins MWG/操縱子(Huntsville,AL)合成。密碼子使用優(yōu)化在本領(lǐng)域是熟知的，例如使用Christianson,M.,Codon usage patterns distort phylogenies from or of DNA sequences,Am.J.Bot.August 2005,Vol.92,No.8,pp.1221-1233,Puigbo等人,OPTIMIZER:a web server for optimizing the codonusage of DNA sequences,Nucleic Acids Res.2007July；35(Web Server issue):W126–W131教導(dǎo)的表格，以引用方式將相關(guān)表格并入本文并且可以自由地得自例如www.jcat.de或genomes.urv.es/OPTIMIZER。利妥昔單抗、hIgG1和E2基因被克隆到基于植物病毒的表達(dá)載體中。EndoH基因首先融合到ER-滯留肽SEKDEL的序列(SEQ ID NO.:1)和在3’端的3X肽Flag標(biāo)簽，然后被克隆到二元載體pGREENII中以產(chǎn)生pFlag-EndoH。EndoH基因的表達(dá)由重復(fù)的CaMV 35S啟動子驅(qū)動。所有植物表達(dá)載體隨后遷移到根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriatumefaciens)菌株GV3101中。

植物生長。本生煙草(N.benthamiana)種子在～25℃下在恒定的專有紅/藍(lán)LED燈下發(fā)芽三周，相對濕度為～60％。對于前兩周，光強度為30-50μmol/m²/s，對于第三周，光強度升高至50-70μmol/m²/s。三周后，將幼小植物轉(zhuǎn)移到新的托盤中以進(jìn)行另外兩周的生長擴張。對于第一周的生長擴張，將植物放置在～25℃下，相對濕度為～65％并且在16h亮(50-70μmol/m²/s)/8h暗的光周期下。對于第二周生長擴張，將植物放置在～27℃下，相對濕度為～45％并且在持續(xù)光照(70-130μmol/m²/s)下。

農(nóng)桿菌浸潤。農(nóng)桿菌克隆在含有補充50mg/卡那霉素和25mg/L利福平的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的培養(yǎng)燒瓶中在225rpm的振搖下在28℃下單獨生長。收集OD_600nm達(dá)到～1.5的培養(yǎng)物并在包含2mM MES緩沖液pH 5.6的浸潤溶液中稀釋。1小時農(nóng)桿菌誘導(dǎo)時間后，對5周齡植物如下所述進(jìn)行真空浸潤。將植物進(jìn)入包含農(nóng)桿菌的浸潤溶液中，施加23英寸Hg的真空并保持3分鐘。農(nóng)桿菌浸潤的植物在持續(xù)光照(70-130μmol/m²/s)下在～22℃下在新的生長室中孵育，相對濕度為～50％。

蛋白質(zhì)提取和純化。生在長后浸潤(DPI)6-7天后，收獲植物葉片并在3體積(w:v)的提取緩沖液(50mM磷酸鈉,pH 8.0)中提取總可溶性蛋白質(zhì)。將氯化鈉(150mM)和EDTA(5mM)補充到提取緩沖液中以回收利妥昔單抗和hIgG1。旋轉(zhuǎn)沉降提取物10分鐘以沉淀植物組織?；厥丈锨逡河糜诩兓偷鞍踪|(zhì)表征。使用抗-Flag抗體(Rockland Antibodies and Assays,Gilbersville,PA)，通過免疫印跡分析確證Flag-EndoH的表達(dá)。使用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)，從總可溶性蛋白質(zhì)中純化植物制備的利妥昔單抗和hIgG1。根據(jù)制造商的說明，使用裝入鎳的螯合瓊脂糖凝膠Fast-Flow(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)通過固定化金屬離子親和色譜(IMAC)純化蛋白質(zhì)E2。

重組蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測定。

植物制備的CSFV E2，植物制備的且市售的利妥昔單抗通過MALDI-TOF-MS(Applied Biosystems)分析。在5％β-巰基乙醇中還原的樣品在57℃下孵育20分鐘。完全組裝的單克隆抗體的還原產(chǎn)生游離重鏈和輕鏈用于直接分子量測定。將樣品以1:20和/或1:200稀釋在芥子酸的飽和溶液(10.0mg/mL:75％ACN:25％H₂O)中，并將1μL點施加到100點樣品板上。在正離子模式下使用優(yōu)化的儀器參數(shù)分析干燥的液滴。

胰蛋白酶肽質(zhì)量指紋圖譜。將稀釋到1.0mg/mL的樣品在DTT的存在下在57℃下孵育20分鐘。在還原后，通過與碘乙酰胺在黑暗中在室溫下樣品孵育20分鐘進(jìn)行脲基甲基化。在0.1％ProteaseMax表面活性劑(Promega)的存在下在57℃下進(jìn)行2小時的測序級的胰蛋白酶(Promega)消化。通過在溫和的氮氣流下蒸發(fā)樣品至干，并重懸于65％ACN:0.1％TFA總共三次來純化肽。將樣品重懸于一定體積的0.1％TFA，然后以1:20和/或1:200稀釋在α-氰基-4-羥基肉桂酸的飽和溶液(10.0mg/mL:75％ACN:25％H₂O)中，并將1μL點施加到100-點樣品板用于MALDI-TOF-MS分析。在正離子模式下使用優(yōu)化的儀器參數(shù)分析干燥的液滴。

實施例1：單克隆抗體(人IgG1)的體內(nèi)去糖基化。

在實施例1中，發(fā)明人在本生煙草植物中制備了人IgG1(hIgG1)并在第一GlcNAc后植物原位移除來自重鏈的N-連接的寡糖，最終目標(biāo)是工程化無巖藻糖基化的和唾液酸化的單一糖型抗體產(chǎn)物。為了達(dá)到該目標(biāo)，我們使用植物真空農(nóng)桿菌浸潤瞬時表達(dá)hIgG1的輕鏈和重鏈以及融合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號SEKDEL(SEQ ID NO.:1)的內(nèi)切糖苷酶H。內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)特異性切割高甘露糖聚糖，所述高甘露糖聚糖是在真核細(xì)胞(例如，植物和哺乳動物細(xì)胞)的ER中發(fā)現(xiàn)的糖型。在植物N-糖基化加工的該階段(蛋白質(zhì)在ER中定位)，巖藻糖殘基尚未添加到蛋白質(zhì)的N-聚糖核心。因此，高甘露糖聚糖的切割將允許產(chǎn)生去糖基化的和無巖藻糖基化的hIgG1。一旦植物在有EndoH的情況下瞬時表達(dá)hIgG1，從表達(dá)組織中提取總可溶性蛋白質(zhì)，并且使用蛋白質(zhì)A柱從粗提取物中純化hIgG1。在有或沒有EndoH的情況下表達(dá)的純化的產(chǎn)物在還原狀態(tài)下被裝載到蛋白質(zhì)凝膠上，其中可以可視化兩條重鏈之間的尺寸差異，表明蛋白質(zhì)當(dāng)與EndoH共表達(dá)時的植物原位去糖基化(圖3)。純化的hIgG1的糖基化性質(zhì)進(jìn)一步通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)評價，以表征完全糖基化的hIgG1(圖4)和去糖基化的hIgG1(圖5)。hIgG1作為完全和半糖基化的抗體在植物中表達(dá)，分子量分別為～145,756Da和144,312Da，顯示在半糖基化形式中，僅有一條重鏈?zhǔn)翘腔?圖4)。半糖基化和完全糖基化的蛋白質(zhì)之間的差為約1,444Da，這是一個N-聚糖的平均質(zhì)量。相反，當(dāng)hIgG1在植物中與EndoH共表達(dá)時，組裝的抗體的質(zhì)量降低至～143,048Da和～143,268Da(圖5)，代表具有一條(半)或兩條(完全)錨定單一N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc，質(zhì)量為203Da)的鏈的兩種抗體，但比質(zhì)量為142,928Da的非糖基化的hIgG1更大。

實施例2：單克隆抗體(利妥昔單抗)的體內(nèi)去糖基化。

在實施例2中，發(fā)明人重復(fù)另一個單克隆抗體的體內(nèi)去糖基化：嵌合抗-CD20抗體利妥昔單抗。利妥昔單抗重鏈和輕鏈在植物中單獨表達(dá)或與EndoH一起表達(dá)。一旦從植物總提取物中純化，通過基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)植物制備的利妥昔單抗樣品分析樣品以測定通過EndoH的植物原位去糖基化是否與體外去糖基化過程一致，在體外去糖基化過程中錨定的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)仍然具有蛋白質(zhì)和/或胰蛋白酶肽片段的天冬酰胺殘基。為了證實該過程，針對(1)創(chuàng)新分子(2)植物制備的利妥昔單抗和(3)使用EndoH ss植物原位去糖基化的植物制備的利妥昔單抗獲得全長和胰蛋白酶肽MALDI-TOF譜兩者。

圖6顯示使用β-巰基乙醇(BME)還原的標(biāo)準(zhǔn)的MALDI-TOF譜，其中重鏈(m/z 50,942Da)被完全糖基化。此外，組裝的利妥昔單抗重鏈和輕鏈顯示在m/z 74,178Da下，以及輕鏈的二聚體在46,196Da下。在所有MALDI譜中針對三種樣品均觀察到該二聚體。圖7顯示單獨表達(dá)的植物制備的利妥昔單抗的MALDI譜，其描繪了糖基化的重鏈(m/z 50,698Da)以及非糖基化的重鏈(m/z 49,253Da)。此外，觀察到組裝的利妥昔單抗重鏈和輕鏈。圖8顯示了通過EndoH植物原位去糖基化的植物制備的利妥昔單抗，其具有降低的糖基化的重鏈(m/z 50,687Da)以及在m/z 49,406Da下的植物原位去糖基化的重鏈，所述去糖基化的重鏈比在圖7中觀察到的非糖基化的重鏈高約203Da(GlcNAc的分子量)。獲得使用EndoH植物原位去糖基化的胰蛋白酶消化的植物制備的利妥昔單抗的MALDI-TOF質(zhì)譜以確證該非糖基化和去糖基化理論。在1100至1500Da的質(zhì)量范圍之間的譜圖的放大顯示在圖9中，其中在1190Da下檢測到峰，如通過理論胰蛋白酶消化針對包含N-糖基化位點的肽(如果沒有被聚糖占據(jù))所預(yù)測的。重要地，在1393Da下檢測到峰，其為仍然具有一個屬于該蛋白的GlcNAc的該肽片段的預(yù)期質(zhì)量，證實了和預(yù)期一樣，仍然有一個GlcNAc連接到植物原位去糖基化的植物制備的利妥昔單抗。

實施例3：多糖基化的亞單位疫苗候選物的體內(nèi)去糖基化。

來自豬瘟病毒(CSFV)的糖蛋白E2的體內(nèi)去糖基化通過與靶蛋白質(zhì)共表達(dá)EndoH來測定。The CSFV E2蛋白質(zhì)由于其高度糖基化的保留的七(7)個潛在的N-糖基化位點而代表不同的蛋白質(zhì)模型，但有一個一個N-糖基化位點不可能使用，因為其緊鄰另一個N-糖基化位點。使用在感染的宿主中發(fā)現(xiàn)的天然N-聚糖重構(gòu)亞單位疫苗蛋白質(zhì)候選物可以提供更高的抗原免疫原性，因此提供更有效的接種。為了促進(jìn)靶蛋白質(zhì)的純化，將E2融合到6x組氨酸標(biāo)簽。E2當(dāng)在植物中表達(dá)時形成二聚體，并且糖基化的和潛在去糖基化的E2二聚體之間的尺寸差異可以容易地在蛋白質(zhì)凝膠上檢測。當(dāng)E2在植物中表達(dá)時，以預(yù)期的約92kDa的分子量產(chǎn)生二聚體糖型。然而，當(dāng)E2與EndoH共表達(dá)時，在約80kDa的分子質(zhì)量下提取單一二聚體產(chǎn)物。差異是對應(yīng)于脫離的寡糖的質(zhì)量(12kDa)(圖10)。顯示糖基化和去糖基化的E2的MM的SDS-PAGE的結(jié)果(圖10)表明靶蛋白質(zhì)的體內(nèi)去糖基化是完全的。

為了證實E2的去糖基化，糖基化和去糖基化的E2的質(zhì)量通過MALDITOF質(zhì)譜分析(圖11)。E2蛋白質(zhì)使用鎳螯合的瓊脂糖凝膠純化。非糖基化的E2二聚體質(zhì)量計算為77,400Da(單體為38,700Da)。具有高甘露糖聚糖的完全糖基化的E2二聚體的質(zhì)量計算為介于90和95kDa(單體介于45和47.5kDa)。在每個N-糖基化位點上僅具有一個GlcNAc的去糖基化的蛋白質(zhì)的質(zhì)量計算為約79,836Da(單體為39,918Da)。圖11示出了單獨表達(dá)的E2(頂部圖；二聚體m/z 90-92kDa，單體m/z 45-47kDa)和與EndoH一起表達(dá)的E2(底部圖；二聚體m/z 79-82kDa,單體m/z～40kDa)之間的二聚體質(zhì)量的約12kDa(單體質(zhì)量的6kDa)的移位。該差異相當(dāng)于六個存在于原始蛋白質(zhì)上的預(yù)期的糖類結(jié)構(gòu)—Man₅至Man₇的理論質(zhì)量(每個E2單體6,084Da至6,804Da)。

本發(fā)明人成功地制備了體內(nèi)去糖基化的hIgG1、利妥昔單抗和CSFV E2，其隨后可以用于體外再糖基化。雖然植物原位去糖基化似乎僅為hIgG1和利妥昔單抗的部分，然而，可以實施若干策略來優(yōu)化該體內(nèi)蛋白質(zhì)去糖基化步驟。例如，不同的表達(dá)載體組合或其中選擇的內(nèi)切糖苷酶在組成型或誘導(dǎo)型啟動子下表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的生成可以幫助比關(guān)注的蛋白質(zhì)更多或/和更早地表達(dá)選擇的內(nèi)切糖苷酶，確保完全去糖基化。

本發(fā)明可以用于其它異源性表達(dá)系統(tǒng)(例如，哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞)和其它重組蛋白質(zhì)候選物的體內(nèi)去糖基化技術(shù)。

本發(fā)明可以在具有希望的糖基化曲線的治療劑的生產(chǎn)中用于例如多種質(zhì)量源于設(shè)計(QbD)的方法發(fā)展，包括但不限于：(1)制備容納人唾液酸的治療性糖蛋白；(2)制備容納天然糖基化模式的治療性糖蛋白；(3)制備具有抗炎特性的人唾液酸化的IgG；(4)制備具有升高的細(xì)胞毒性活性的無巖藻糖基化的單克隆抗體；(5)通過制備信號糖型治療性蛋白質(zhì)提高產(chǎn)物同質(zhì)性和一致；(6)制備不在現(xiàn)有的異源性表達(dá)系統(tǒng)中組裝的稀有或特定糖型；或(7)去除不想要的宿主特異性、潛在免疫原性的糖型。

可以設(shè)想，在本說明書中討論的任何實施方案可以針對本發(fā)明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物實施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于實現(xiàn)本發(fā)明的方法。

將理解的是，本文描述的具體實施方案以說明的方式顯示，而不作為對本發(fā)明的限制。在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到或僅使用常規(guī)實驗就能夠確定本文所述的具體程序的許多等價方式。這樣的等價方式將被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)并由權(quán)利要求書涵蓋。

說明書中提及的所有出版物和專利申請表示本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有出版物和專利申請被引入本文作為參考，其程度如同具體地和單獨地表明將各出版物和專利申請引入本文作為參考。

單詞“一個(a)”或“一個(an)”當(dāng)與權(quán)利要求中的術(shù)語“包括(comprising)”聯(lián)合使用時，可以指“一個”，但其還符合“一個或多個”、“至少一個”和“一個或多于一個”的含義。術(shù)語“或”在權(quán)利要求中的使用是用來指“和/或”，除非明確指出僅指代供選擇的方案或供選擇的方案是互相排斥的，但本公開支持僅指代供選擇的方案和“和/或”。貫穿本申請，術(shù)語“約”用于表示數(shù)值包括裝置的誤差、用于測定該數(shù)值的方法的固有變化，或研究受試者之間存在的變化。

如本說明書和權(quán)利要求中所使用的，單詞“包括(comprising)”(和包括的任何形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)，“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”，“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)，或“包含(containing)”(和包含的任何形式，如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包括性的或開放式的，不排除另外的未列舉的要素或方法步驟。在本文提供的任何組合物和方法的實施方案中，“包括(comprising)”可以被“基本上由……組成”或“由……組成”替代。如本文所使用，短語“基本上由……組成”需要規(guī)定的整數(shù)或步驟，以及不實質(zhì)上影響要求保護(hù)的發(fā)明的特征或功能的那些。如本文所使用，術(shù)語“由……組成”僅用來表示列舉的整數(shù)的存在(例如，元件、特征、性質(zhì)、方法/工藝步驟或限度)或整數(shù)組(例如，特征(或多個特征)、元件(或多個元件)、性質(zhì)(或多個性質(zhì))、特性(或多個特性)、方法/工藝步驟或限度(或多個限度))。

如本文使用的術(shù)語“或其組合”是指所有在術(shù)語之前的所列項目的所有排列和組合。例如，“A、B、C或其組合”旨在包括以下至少一種：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具體上下文中當(dāng)順序是重要的時，還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)該實例，明確包括的是包含一個或多個項目或條款的重復(fù)的組合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技術(shù)人員將理解通常對任意組合中的項目或條款的數(shù)量沒有限制，除非上下文另有說明。

如本文所使用，例如但不限于“約”、“基本上”或“基本上地”是指當(dāng)如此修飾時理解為并不一定是絕對或完善的，而是將被視為與本領(lǐng)域技術(shù)人員的那些足夠接近以保證指定該條件存在的條件。描述可以變化的程度將取決于變化程度，該變化可以實施并且由于仍然具有未改變的特征的特征和能力而使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員仍能識別改變的特征。通常，但限于之前的討論，由近似的單詞如“約”修飾的本文的數(shù)值可以從規(guī)定的值變化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％.

根據(jù)本發(fā)明，本文公開的和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法可以在無需過度實驗的情況下進(jìn)行和執(zhí)行。雖然根據(jù)優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，變化可以適用于本文所述的組合物和/或方法以及適用于步驟或方法的步驟的順序。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有這樣的類似替代和修改被視為如所附權(quán)利要求限定的在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)。