本申請要求名稱為“AnalysisofNucleicAcidsAssociatedwithSingleCellsusingNucleicAcidBarcodes”并且在2013年12月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/922,012的權(quán)益，所述臨時申請的完整內(nèi)容出于所有目的以引用的方式并入本文。作為ASCII文本文件遞交的“序列表”、表格或計算機程序列表附件的引用在2014年12月30日創(chuàng)建(18,227,200字節(jié)，機器格式IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng))的文件97519-920777.txt中寫出的序列表出于所有目的以引用的方式整體并入本文。在文件表18中寫出的表18.[條形碼_部分1].[條形碼_部分1].txt,2,039,808字節(jié)；在文件表18中寫出的表18.[條形碼_部分2].[條形碼_部分2].txt,90,112字節(jié)；在文件表22中寫出的表22.[i5指數(shù)引物].[i5指數(shù)引物].txt,4,096字節(jié)；在文件表32中寫出的表32.[孔-條形碼].[孔-條形碼].txt,4,096字節(jié)；在文件表32中寫出的表32.[板-條形碼].[板-條形碼].txt,4,096字節(jié)(均在2014年12月24日創(chuàng)建，機器格式IBM-PC，MS-Windows操作系統(tǒng))出于所有目的以引用的方式整體并入本文。發(fā)明背景如免疫球蛋白(Ig)和T細(xì)胞受體(TCR)基因的可變基因由接合點之間具有P/N核苷酸添加的V(D)J基因區(qū)段的重排形成。完全功能Ig或TCR蛋白通過兩種基因(對于Ig為重鏈和輕鏈基因，對于αβTCR為α和β基因并且對于γδTCR為γ和δ基因)的締合形成。這種組合方法產(chǎn)生各種各樣的不同的可能序列。這種譜系使免疫系統(tǒng)能夠回應(yīng)于生物體尚未遇到的新穎免疫損傷。免疫球蛋白基因還經(jīng)歷體細(xì)胞超突變，其進(jìn)一步增加譜系大小。對應(yīng)地，允許天然Ig或TCR蛋白的表達(dá)以研究其功能特性的對可變基因的任何核酸分析不僅需要對個別B(對于Ig基因)或T細(xì)胞(對于TCR基因)測序，而且需要構(gòu)成蛋白的兩種基因的天然配對。這可通過單細(xì)胞克隆和Sanger測序進(jìn)行，但為緩慢并且費力的(參看例如Wrammert等人,Nature,2008,453:667-671)。已經(jīng)開發(fā)了高通量方法來對天然配對基因進(jìn)行高通量測序，并且分為兩種方法。第一種方法是使獨特核酸條形碼識別符連接于來自細(xì)胞的核酸，并且如果基因共享所述相同條形碼并且因此起源于相同細(xì)胞，那么經(jīng)由使所述基因以生物信息學(xué)方式連接在一起來實現(xiàn)配對(PCT/US2012/000221)。第二種方法是使來自兩種基因的核酸以物理方式連接在一起(參看例如美國專利號7,749,697)。所述第一種方法是優(yōu)良的，因為其允許多種基因的配對(如鑒別特異性T細(xì)胞或B細(xì)胞子集的B或T細(xì)胞共同表達(dá)基因)，而所述第二種方法限于以物理方式連接一些核酸。迄今，實驗數(shù)據(jù)僅關(guān)于其中已經(jīng)以物理方式連接不超過兩種核酸的情形存在。使核酸明確地締合至單細(xì)胞(所述第一種方法)而非使其經(jīng)由連接彼此締合(所述第二種方法)具有優(yōu)勢。當(dāng)核酸彼此締合時，可難以區(qū)別PCR和測序誤差與真實生物變異。必須關(guān)于測序平臺的精確性進(jìn)行假設(shè)并且讀數(shù)基于百分比相似性截止值任意地被指定為不同序列，即具有>95％相似性的所有讀數(shù)被指定為序列并且其間的任何差異均假定是歸因于測序誤差。這不能區(qū)別彼此非常相似的序列(參看Zhu等人,FrontiersinMicrobiology,2012,3:315)。此外，使用被指定為序列的讀數(shù)的相對頻率關(guān)于多少細(xì)胞共享所述同一序列進(jìn)行假定。這是近似量度并且受到PCR擴(kuò)增偏差影響，如本領(lǐng)域中眾所周知。因此，使Ig或TCR核酸彼此締合可僅產(chǎn)生近似值，而非進(jìn)行測序的譜系的真實表示(參看Zhu等人,FrontiersinMicrobiology,2012,3:315)。然而，使用核酸條形碼使核酸締合至單細(xì)胞允許明確區(qū)別來自單B或T細(xì)胞的相似或甚至同一序列，因為各讀數(shù)可被指定為細(xì)胞。此外，通過用所有與細(xì)胞締合的讀數(shù)創(chuàng)建共有序列，可獲得非常精確并且?guī)缀跬耆珶o誤差序列并且可獲得進(jìn)行測序的譜系的精確表示。這也可普及至細(xì)胞中所有核酸的分析。另外，遞送獨特條形碼至各單細(xì)胞的技術(shù)困難仍存在。連接核酸條形碼至可變基因的目前最佳技術(shù)在水溶液中具有獨特條形碼并且各條形碼甚至在連接條形碼至可變基因核酸的反應(yīng)之前存在于獨立存儲容器中(PCT/US2012/000221)，否則所述核酸條形碼將在使用之前混合。這產(chǎn)生了對數(shù)千種細(xì)胞編條形碼的邏輯困難，因為需要大量容器含有個別條形碼。對于大量存儲容器的需求也使這種方法與其中獨特條形碼無法個別地吸移至各個別反應(yīng)容器(其也將含有單細(xì)胞)中的任一種方法不可相容。一個實例為納升大小的反應(yīng)容器，如納米孔方法，其中將獨特條形碼個別地吸移至各納米孔中為不切實際的，因為存在數(shù)千至數(shù)十萬個納米孔。這在其中使用油包水乳液產(chǎn)生液滴的納米液滴方法中也是不可行的，因為數(shù)十萬個納米液滴僅由一些水流產(chǎn)生(參看例如DolomiteMicrofluidics或RaindanceTechnologies的產(chǎn)品)，并且在遞送至納米液滴之前不可能在個別存儲容器中具有獨特條形碼。一種遞送獨特條形碼至個別反應(yīng)容器的方法是使用有限稀釋來將獨特條形碼沉積于大多數(shù)反應(yīng)容器中?？蓤?zhí)行連接于可操縱物體(如珠粒)的條形碼的有限稀釋，所述可操縱物體各自具有所連接的一種特定條形碼的多個拷貝，或可執(zhí)行溶液中條形碼的有限稀釋。在稀釋所述珠粒后，一種特定核酸條形碼的多個拷貝存在于反應(yīng)容器中，而在溶液中稀釋條形碼后，特定核酸條形碼的僅單一拷貝存在于反應(yīng)容器中。此外，添加核酸條形碼至存在于反應(yīng)容器中的所關(guān)注的樣品源性核酸中將在所引入的條形碼擴(kuò)增以確保其足量存在于反應(yīng)腔室中的情況下更完全。例如，典型哺乳動物細(xì)胞含有mRNA的大致400,000個拷貝。為了最大化總體單細(xì)胞分析的效率，應(yīng)對盡可能多的這些mRNA拷貝編條形碼。因此，至少特定核酸條形碼的大致相同數(shù)目的拷貝，因為mRNA拷貝需要存在于反應(yīng)容器中。溶液中條形碼的有限稀釋導(dǎo)致反應(yīng)容器中僅有特定條形碼的單一拷貝，而具有條形碼的小(例如1-2μm直徑)珠粒的稀釋將預(yù)期提供最大數(shù)萬個拷貝。因此，在任一情形中所述條形碼的擴(kuò)增均為重要的以在反應(yīng)容器中產(chǎn)生足量的特定核酸條形碼，使得所述條形碼成功添加至最大數(shù)目的樣品源性核酸中。然而，預(yù)期珠粒提供顯著更多的起始物質(zhì)并且因此提供顯著更佳的條形碼擴(kuò)增。另外，充分大的珠?？珊袛?shù)十萬個核酸條形碼分子。在這種情形中，核酸條形碼從所述珠粒裂解可足以在反應(yīng)容器中產(chǎn)生足量的特定核酸條形碼。此外，如果核酸連接于固體表面，那么其將不會如溶液中的核酸般自由地到處移動。對于核酸互補堿基配對，固相動力學(xué)比液相動力學(xué)慢得多，并且可使得條形碼以低得多的效率添加至所關(guān)注的核酸中。優(yōu)選地，核酸條形碼應(yīng)在參與條形碼反應(yīng)之前存在于液相中。本發(fā)明比先前發(fā)明(PCT/US2012/000221)在連接獨特條形碼至各樣品方面有所改進(jìn)，其中各樣品通常為單細(xì)胞，但可普及至任何類型的樣品。本發(fā)明使得獨特條形碼能夠遞送至任何類型的反應(yīng)容器，并且還適用于納升大小的反應(yīng)容器并且不需要使獨特核酸條形碼保持于獨立存儲容器中。其經(jīng)得起但無需手動地吸移獨特條形碼至各反應(yīng)容器中。其遞送獨特條形碼或獨特條形碼集合的一個或多個拷貝至各反應(yīng)容器中并且所述條形碼在以快速液相動力學(xué)發(fā)生于液相中的反應(yīng)中連接于所關(guān)注的核酸。由于所述反應(yīng)連接條形碼至細(xì)胞中的所有所關(guān)注的核酸，即細(xì)胞中所有反轉(zhuǎn)錄的RNA，本發(fā)明使得能夠進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并且不限于使免疫球蛋白可變基因締合至特異性樣品。此外，所述擴(kuò)增反應(yīng)可在充分低的溫度下發(fā)生使得其可與中溫酶(其在其它情況下在高溫下失活)相容以添加條形碼至所關(guān)注的核酸中。發(fā)明概述本文公開使用核酸條形碼來分析與單細(xì)胞締合的核酸的方法和組合物。本文公開的一種用于制造一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸的方法包括獲得多種與一種或多種樣品締合的核酸，其中所述樣品獲自一個或多個受試者，并且所述與樣品締合的核酸存在于獨立反應(yīng)容積中。所述核酸可為RNA或DNA分子(例如cDNA分子)。在一些實施方案中，銜接分子添加至與樣品締合的核酸中。在一些實施方案中，所述銜接分子使用酶反應(yīng)產(chǎn)生并且包含通用引發(fā)序列、條形碼序列和結(jié)合位點。在一些實施方案中，所述條形碼序列并入至與樣品締合的一種或多種聚核苷酸中，由此制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。在一些實施方案中，所述方法包括添加銜接分子至與樣品締合的核酸中，其中所述銜接分子使用酶反應(yīng)產(chǎn)生并且包含通用引發(fā)序列、條形碼序列和結(jié)合位點；和將所述條形碼序列并入與樣品締合的一種或多種聚核苷酸中，由此制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。本文公開一種用于制造一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸的方法。所述方法包括獲得多種與一種或多種樣品締合的RNA，其中所述樣品獲自一個或多個受試者，并且與樣品締合的RNA存在于獨立反應(yīng)容積中；添加銜接分子至與樣品締合的RNA中，其中所述銜接分子使用酶反應(yīng)產(chǎn)生并且包含通用引發(fā)序列、條形碼序列和結(jié)合位點；以及將所述條形碼序列并入一種或多種與樣品締合的聚核苷酸中，由此制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。在一些實施方案中，各RNA或所述多種RNA中的至少一者與來自所述一種或多種樣品的單一樣品締合。所述方法的一些實施方案進(jìn)一步包括使用所述酶反應(yīng)產(chǎn)生所述銜接分子。在一些實施方案中，所述銜接分子通過使模板分子與一種或多種酶接觸而產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述模板分子為包含RNA聚合酶(RNAP)啟動子的DNA分子，并且所述一種或多種酶包括RNA聚合酶。所述RNAP啟動子可選自由T7、T3和SP6組成的組。在一些實施方案中，所述模板分子為包含切口核酸內(nèi)切酶限制位點的DNA分子，并且所述一種或多種酶包括切口核酸內(nèi)切酶和鏈置換DNA聚合酶。所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點可選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。所述鏈置換DNA聚合酶可選自由Klenowexo-、Bst大片段和Bst大片段的工程改造的變體組成的組。所述DNA分子可為雙鏈分子或單鏈分子，所述單鏈分子適用作用于產(chǎn)生雙鏈分子的模板。在一些實施方案中，所述模板分子結(jié)合于固體支撐物，所述固體支撐物與水溶液接觸，并且所述銜接分子在其產(chǎn)生時釋放至所述水溶液中。在一些實施方案中，添加所述銜接分子至所述與一種樣品締合的RNA中包括組合所述水溶液與其中存在所述RNA的所述反應(yīng)容積。在一些實施方案中，所述水溶液與所述與一種樣品締合的RNA存在于相同反應(yīng)容積中。在一些實施方案中，所述模板分子包含核酸內(nèi)切酶限制位點，所述一種或多種酶包含限制核酸內(nèi)切酶，并且所述銜接分子包含所述模板分子的一部分，所述部分在所述模板分子與所述限制核酸內(nèi)切酶接觸后產(chǎn)生并且釋放至所述水溶液中。在一些實施方案中，所述固體支撐物為珠?；虮砻?例如微量滴定孔或管的表面)。在所述方法的一些實施方案中，所述銜接分子在添加所述銜接分子至所述與一種樣品締合的RNA中之前以游離形式處于溶液中。在一些實施方案中，所述銜接分子在隔室中產(chǎn)生，并且添加所述銜接分子至所述與一種樣品締合的RNA中包括組合所述隔室與其中存在所述RNA的所述反應(yīng)容積。在一些實施方案中，所述銜接分子在其中存在添加有所述銜接分子的所述RNA的所述反應(yīng)容積中產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述銜接分子不在其中存在添加有所述銜接分子的所述RNA的所述反應(yīng)容積中產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述酶反應(yīng)為等溫反應(yīng)。在一些實施方案中，所述銜接分子進(jìn)一步包含獨特分子識別符(UMI)序列。在一些實施方案中，所述銜接分子為RNA分子。所述銜接分子可使用RNAP產(chǎn)生。在所述方法的一些實施方案中，所述銜接分子為DNA分子。所述銜接分子可使用DNAP產(chǎn)生。在一些實施方案中，制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸包括反轉(zhuǎn)錄與所述樣品締合的所述RNA，由此合成多種第一鏈cDNA，與所述樣品締合的所述RNA中的至少一些包含與所述銜接分子的所述結(jié)合位點互補的序列區(qū)，并且所述銜接分子用作反轉(zhuǎn)錄的引物，使得所述條形碼序列并入與所述樣品締合的第一鏈cDNA中。在這些實施方案中，所述結(jié)合位點可包含聚T區(qū)或隨機區(qū)。所述結(jié)合位點可出現(xiàn)于所述銜接分子的3’端。所述銜接分子可在隔室中產(chǎn)生，并且反轉(zhuǎn)錄與樣品締合的所述RNA可在組合所述隔室與其中存在所述RNA的所述反應(yīng)容積之后發(fā)生。反轉(zhuǎn)錄與樣品締合的所述RNA可在其中產(chǎn)生添加至所述RNA中的銜接分子的相同反應(yīng)容積中發(fā)生。所述方法的一些實施方案進(jìn)一步包括反轉(zhuǎn)錄與樣品締合的所述RNA以獲得多種cDNA，其中反轉(zhuǎn)錄RNA包括使用反轉(zhuǎn)錄酶和第一鏈引物合成cDNA的第一鏈。在這些實施方案中，反轉(zhuǎn)錄酶可為MMLVH-反轉(zhuǎn)錄酶。所述銜接分子可在隔室中產(chǎn)生，并且添加所述銜接分子至所述與一種樣品締合的RNA中包括組合所述隔室與其中存在所述RNA的所述反應(yīng)容積。cDNA的第一鏈可在組合所述隔室與所述反應(yīng)容積之前或之后合成。在一些實施方案中，反轉(zhuǎn)錄與樣品締合的所述RNA在其中產(chǎn)生添加至所述RNA中的銜接分子的相同反應(yīng)容積中發(fā)生。在這些實施方案中，所述反應(yīng)容積中的緩沖液可包含在pH8.0至pH8.8的pH范圍內(nèi)的Tris、鉀離子、氯離子、硫酸根離子、銨離子、乙酸離子或鎂離子中的至少一者。在一些實施方案中，所述反轉(zhuǎn)錄酶具有模板轉(zhuǎn)換活性，與所述樣品締合的cDNA的至少一些第一鏈包含3’懸垂物，所述銜接分子的所述結(jié)合位點包含與所述3’懸垂物互補的3’部分，并且所述銜接分子用作所述反轉(zhuǎn)錄酶的模板，使得所述條形碼序列并入與所述樣品締合的cDNA的第一鏈中。在這些實施方案中，所述3’懸垂物可包含一個或多個C核苷酸并且所述結(jié)合位點的所述3’部分可包含一個或多個G核苷酸。所述第一鏈引物可包含聚T區(qū)或隨機序列。在一些實施方案中，制造所關(guān)注的聚核苷酸包括使用第一(例如正向)引物和第二(例如反向)引物擴(kuò)增用于各樣品的cDNA的所述第一鏈，所述第二引物具有與所述第一鏈引物的至少一部分相同的序列，其中所述第一引物或所述第二引物為所述銜接分子。在這些實施方案中，所述第一引物或所述第二引物可為所述銜接分子。所述第一鏈引物可包含聚T區(qū)或隨機序列。在所述方法的一些實施方案中，各樣品包含細(xì)胞。所述細(xì)胞可為血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞為B細(xì)胞或T細(xì)胞。所述B細(xì)胞可為成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞。在一些實施方案中，與各樣品締合的所述RNA包含mRNA，例如至少1、3、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000種mRNA。在一些實施方案中，與各樣品締合的所述RNA包含細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組或細(xì)胞的總RNA。在一些實施方案中，每種樣品制造至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000種所關(guān)注的聚核苷酸。在一些實施方案中，所述一種或多種樣品包含至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000個細(xì)胞。在一些實施方案中，所述一種或多種樣品獲自相同受試者。一些實施方案進(jìn)一步包括使所述樣品與溶解緩沖液接觸。一些實施方案進(jìn)一步包括使所述樣品與核酸標(biāo)記物接觸，由此允許所述核酸標(biāo)記物結(jié)合于所述樣品的子集；和洗滌所述樣品，由此從所述核酸標(biāo)記物不結(jié)合的樣品去除所述核酸標(biāo)記物，其中關(guān)于所述子集內(nèi)的樣品，添加至與所述樣品締合的所述RNA中的所述銜接分子也添加至所述核酸標(biāo)記物中，并且使用所述標(biāo)記的核酸標(biāo)記物制造一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。在這些實施方案中，所述核酸標(biāo)記物可包含偶聯(lián)于分子標(biāo)記的核酸。所述分子標(biāo)記可為抗體、抗原或蛋白。所述分子標(biāo)記可對一種或多種細(xì)胞表面部分具有親和力。在一些實施方案中，所述核酸為RNA。在一些實施方案中，所述核酸為DNA并且可包含RNAP啟動子。在一些實施方案中，所述樣品與第一核酸標(biāo)記物和第二核酸標(biāo)記物接觸，其中所述第一核酸標(biāo)記物包含偶聯(lián)于第一分子標(biāo)記的第一核酸，并且所述第二核酸標(biāo)記物包含偶聯(lián)于第二分子標(biāo)記的第二核酸。所述第一核酸和第二核酸可包含不同的序列區(qū)。在一些實施方案中，所述第一和第二分子標(biāo)記為不同的(例如，不同的細(xì)胞表面抗原的兩種不同抗體)。因此，所述方法允許用包含銜接分子的核酸標(biāo)記物多重標(biāo)記如單細(xì)胞的樣品，并且制造一種或多種與所述樣品締合的所關(guān)注的聚核苷酸。在所述方法的一些實施方案中，所述一種或多種樣品獲自相同受試者。在一些實施方案中，所述一種或多種樣品獲自至少3、10、30或100個不同受試者。本文還公開條形碼銜接構(gòu)建體。一些所述條形碼銜接構(gòu)建體包含RNAP啟動子序列、通用引發(fā)序列、條形碼序列和結(jié)合位點。所述RNAP啟動子可選自由T7、T3和SP6組成的組。其它條形碼銜接構(gòu)建體包含切口核酸內(nèi)切酶限制位點、通用引發(fā)序列、條形碼序列和結(jié)合位點。所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點可選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。本文進(jìn)一步公開一種固體支撐物，其包含如上文所述的條形碼銜接構(gòu)建體。在一些實施方案中，所述條形碼銜接構(gòu)建體經(jīng)由共價鍵結(jié)合于所述固體支撐物。在一些實施方案中，所述條形碼銜接構(gòu)建體的多個拷貝結(jié)合于所述固體支撐物。例如，所述條形碼銜接構(gòu)建體的至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000個拷貝可結(jié)合于所述固體支撐物。在一些實施方案中，所述條形碼銜接構(gòu)建體的各拷貝包含所述相同條形碼序列。本文還公開一種銜接模板文庫，其包含多種偶聯(lián)于所述銜接構(gòu)建體的多個拷貝的固體支撐物。在一些實施方案中，所述多種固體支撐物包含至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000種固體支撐物。在一些實施方案中，所述固體支撐物中的至少兩者包含具有不同條形碼序列或UMI序列的銜接構(gòu)建體。在一些實施方案中，所述多種固體支撐物中的每一種固體支撐物均包含具有不同條形碼序列或不同UMI序列的銜接構(gòu)建體。本文還公開一種核酸標(biāo)記物，其包含偶聯(lián)于分子標(biāo)記的核酸。在一些實施方案中，所述分子標(biāo)記為抗體、抗原或蛋白。在一些實施方案中，所述分子標(biāo)記對一種或多種細(xì)胞表面部分具有親和力。在一些實施方案中，所述核酸為RNA。在一些實施方案中，所述核酸為DNA。所述DNA可包含RNAP啟動子序列。在一些實施方案中，描述多種核酸標(biāo)記物，其中所述多種中的至少一者包含第一分子標(biāo)記(即，第一抗體)并且所述多種中的至少一者包含第二分子標(biāo)記(即，第二抗體)。在一些實施方案中，所述第一和第二分子標(biāo)記為不同的，因此提供適用于用本文所述的核酸標(biāo)記物多重標(biāo)記不同的細(xì)胞表面部分(例如不同的細(xì)胞表面抗原)的組合物。本文進(jìn)一步公開包含本文所述的銜接構(gòu)建體的試劑盒。所述試劑盒可包含多種偶聯(lián)于本文所述的銜接構(gòu)建體的固體支撐物。在一些實施方案中，所述試劑盒包含銜接模板文庫，所述文庫包含多種銜接構(gòu)建體。在一些實施方案中，所述試劑盒包含銜接模板文庫，所述文庫包含多種偶聯(lián)于多種固體支撐物的銜接構(gòu)建體。所述試劑盒可進(jìn)一步包含用于通過酶反應(yīng)由所述銜接構(gòu)建體產(chǎn)生本文所述的銜接分子的酶。在一些實施方案中，所述試劑盒包含本文所述的細(xì)胞懸浮緩沖液。本文進(jìn)一步公開一種包含滲透保護(hù)劑的細(xì)胞懸浮緩沖液。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為甜菜堿或其密切結(jié)構(gòu)類似物。例如，所述滲透保護(hù)劑可為甘氨酸甜菜堿。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為糖或多元醇。例如，所述滲透保護(hù)劑可為海藻糖。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為氨基酸。例如，所述滲透保護(hù)劑可為脯氨酸。在所述細(xì)胞懸浮緩沖液的一些實施方案中，所述緩沖液的摩爾滲透壓濃度為約250-350mOsm/L。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑貢獻(xiàn)所述緩沖液的所述摩爾滲透壓濃度的多達(dá)10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些實施方案中，所述緩沖液包含約230-330mM甜菜堿和約10mMNaCl。本文還公開一種使聚核苷酸連接于固體支撐物的方法，其中所述聚核苷酸含有條形碼序列。所述方法包括以下步驟：a)產(chǎn)生反相乳液的親水性隔室，所述親水性隔室含有：固體支撐物、包含條形碼序列的條形碼寡核苷酸和經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的表面的寡核苷酸，其中所述結(jié)合的寡核苷酸包含與所述條形碼寡核苷酸的3’序列互補的3’序列；和b)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)以將所述條形碼序列并入所述固體支撐物上的所述結(jié)合的寡核苷酸中。在一些實施方案中，所述條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含與PCR反向引物序列同一或互補的5’序列。這些實施方案可進(jìn)一步包括使用熒光團(tuán)標(biāo)記的反向引物執(zhí)行PCR反應(yīng)。在一些實施方案中，所述固體支撐物為珠粒。在一些實施方案中，所述捕獲部分為抗生蛋白鏈菌素。在一些實施方案中，所述捕獲部分包含羧基、環(huán)氧基或羥基。在一些實施方案中，所述捕獲部分包含金以捕獲硫醇化寡核苷酸。在一些實施方案中，所述條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含通用引發(fā)序列和結(jié)合位點。所述條形碼寡核苷酸可進(jìn)一步包含選自由T7、T3和SP6組成的組的RNAP啟動子?；蛘呋蛄硗?，所述條形碼寡核苷酸可進(jìn)一步包含選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組的切口核酸內(nèi)切酶限制位點。所述結(jié)合位點可為一個或多個G核苷酸。還公開另一種使聚核苷酸連接于固體支撐物的方法，其中所述聚核苷酸含有條形碼序列。所述方法包括以下步驟：a)提供：固體支撐物、包含W序列的第一條形碼寡核苷酸和經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的表面的寡核苷酸，其中所述結(jié)合的寡核苷酸包含(i)S1x序列和(ii)與所述第一條形碼寡核苷酸的3’序列互補的序列；b)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)以將所述W序列并入所述結(jié)合的寡核苷酸中；c)提供第二條形碼寡核苷酸，其包含(i)S2y序列和(ii)與由步驟b)產(chǎn)生的所述結(jié)合的寡核苷酸的3’端互補的3’序列；以及d)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)以將所述S2y序列并入所述結(jié)合的寡核苷酸中，由此使聚核苷酸連接于所述固體支撐物，其中所述聚核苷酸含有條形碼序列，并且所述條形碼序列包含所述S1x、W和S2y序列。在這種方法的一些實施方案中，所述固體支撐物為珠粒。在一些實施方案中，所述捕獲部分為抗生蛋白鏈菌素。在一些實施方案中，所述捕獲部分包含羧基、環(huán)氧基或羥基。在一些實施方案中，所述捕獲部分包含金以捕獲硫醇化寡核苷酸。在一些實施方案中，選擇的條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含通用引發(fā)序列和結(jié)合位點，所述選擇的條形碼寡核苷酸為所述第一條形碼寡核苷酸或所述第二條形碼寡核苷酸。所述選擇的條形碼寡核苷酸可進(jìn)一步包含選自由T7、T3和SP6組成的組的RNAP啟動子。或者或另外，所述選擇的條形碼寡核苷酸可進(jìn)一步包含選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組的切口核酸內(nèi)切酶限制位點。所述結(jié)合位點可為一個或多個G核苷酸。本文進(jìn)一步公開一種通過前述方法的任何實施方案制備的固體支撐物，其中所述固體支撐物連接于聚核苷酸并且所述聚核苷酸含有條形碼序列。還公開一種條形碼文庫，其包含多種這些固體支撐物。另外，本文公開一種用于封裝細(xì)胞、條形碼銜接模板和用于制造所關(guān)注的聚核苷酸的試劑的微流體液滴器件。所述器件包括(a)三個獨立控制的壓力源、(b)三個微流體途徑、(c)三個流量傳感器、(d)兩個樣品環(huán)管、(e)微流體液滴芯片和(f)樣品收集容器，其中：各壓力源通過所述微流體途徑之一耦合于并且驅(qū)動流體，所述流量傳感器之一沿著各微流體途徑安置于所述個別壓力源的下游，第一微流體途徑穿過第一樣品環(huán)管，第二微流體途徑穿過第二樣品環(huán)管，所述第一和第二樣品環(huán)管與熱冷卻單元接觸，所述第一和第二微流體途徑在第一接合點合并以形成組合途徑，所述組合途徑和第三微流體途徑在第二接合點合并以形成樣品途徑，所述第二接合點出現(xiàn)于所述微流體液滴芯片內(nèi)和所述第一接合點的下游，并且所述樣品途徑進(jìn)入所述第二接合點的下游的所述樣品收集容器中，使得(a)-(f)流體連接。在所述器件的一些實施方案中，各壓力源包括壓力泵。在一些實施方案中，各壓力源包括注射泵。在一些實施方案中，所述第一樣品環(huán)管經(jīng)過配置以計量朝向所述微流體液滴芯片的水溶液的流量，其中所述水溶液包含細(xì)胞和條形碼銜接模板。在一些實施方案中，所述第二樣品環(huán)管經(jīng)過配置以計量朝向所述微流體液滴芯片的反應(yīng)混合物的流量，其中所述反應(yīng)混合物包含用于細(xì)胞溶解的試劑和用于制造所關(guān)注的聚核苷酸的試劑。在一些實施方案中，所述第三微流體途徑經(jīng)過配置以遞送油/表面活性劑混合物至所述微流體液滴芯片。在一些實施方案中，所述熱冷卻單元包括珀耳帖器件。在一些實施方案中，所述熱冷卻單元包括冰箱。在一些實施方案中，所述第一接合點出現(xiàn)于所述液滴芯片內(nèi)。在一些實施方案中，所述第三微流體途徑分成所述微流體液滴芯片的上游的兩個子途徑，所述兩個子途徑在所述第二接合點與所述組合途徑合并，并且所述第二接合點具有流動聚焦幾何形狀。在一些實施方案中，所述第二接合點具有t形接合幾何形狀。在一些實施方案中，所述第一微流體途徑經(jīng)過配置以容納細(xì)胞，并且所述第二微流體途徑經(jīng)過配置以容納結(jié)合于固體支撐物的條形碼銜接模板。本文公開一種用于制造一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸的方法，所述方法包括獲得cDNA文庫，所述文庫包含多種與一種或多種獲自一個或多個受試者的樣品締合的cDNA，其中各cDNA與所述一種或多種樣品中的單一樣品締合，并且其中與各樣品締合的所述cDNA存在于獨立容器或隔室中。在一些實施方案中，銜接分子添加至與各樣品締合的所述cDNA中以制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。在一些實施方案中，所述銜接分子由包含通用引發(fā)序列、條形碼和cDNA結(jié)合位點的銜接構(gòu)建體產(chǎn)生。在一些方面，所述銜接分子使用等溫反應(yīng)產(chǎn)生。在一些方面，所述銜接構(gòu)建體進(jìn)一步包含RNA聚合酶(RNAP)啟動子。在一些方面，所述RNAP啟動子選自由T7、T3和SP6組成的組。在一些方面，所述銜接構(gòu)建體進(jìn)一步包含切口核酸內(nèi)切酶限制位點。在一些方面，所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。在一些方面，所述銜接子為通過RNAP產(chǎn)生的RNA銜接子。在一些方面，所述銜接子為通過切口核酸內(nèi)切酶和鏈置換DNA聚合酶產(chǎn)生的DNA銜接子。在一些方面，所述鏈置換DNA聚合酶選自由Klenowexo-和Bst大片段和其工程改造的變體(如Bst2.0)組成的組。在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括使所述銜接分子的3’端連接于所述文庫中的各cDNA的3’端以制造所述一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸。在一些方面，所述銜接子通過使所述銜接子退火至在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)期間產(chǎn)生的cDNA的‘3尾來添加。在一些方面，各cDNA包含至少一個C核苷酸，其中C位于各cDNA的3’端，其中所述銜接區(qū)包含至少一個G核苷酸，其中G位于所述銜接區(qū)的3’端，并且其中所述銜接區(qū)經(jīng)由所述G與C之間的結(jié)合連接于各cDNA。在一些方面，所述銜接分子為單鏈的，并且進(jìn)一步包括通過允許酶使所述銜接分子呈雙鏈而將所述銜接分子的互補序列并入各cDNA中。在一些方面，所述銜接分子的互補序列通過MMLVH-反轉(zhuǎn)錄酶并入各cDNA中以制造所關(guān)注的聚核苷酸。在一些方面，各樣品包含細(xì)胞。在一些方面，所述細(xì)胞為血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。在一些實施方案中，所述細(xì)胞為B細(xì)胞或T細(xì)胞。在一些方面，所述B細(xì)胞為成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞。本文還公開一種使條形碼連接于固體支撐物的方法，所述方法包括以下步驟：a)產(chǎn)生反相乳液的親水性隔室，所述親水性隔室包含：其中所含的固體支撐物，其中所述固體支撐物包含經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于表面的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含與條形碼寡核苷酸上的3’序列互補的3’序列；條形碼寡核苷酸，其包含與所述結(jié)合的寡核苷酸的3’端互補的3’序列；及條形碼序列；和b)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)以將所述條形碼的序列添加至所述固體支撐物上的所述結(jié)合的寡核苷酸中。在一些方面，所述條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含與反向PCR引物同一或互補的5’序列。在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括使用熒光團(tuán)標(biāo)記的反向引物執(zhí)行PCR反應(yīng)。在一些方面，所述固體支撐物為珠?；虮砻?。在一些方面，所述捕獲部分為抗生蛋白鏈菌素。在一些方面，所述條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含RNA聚合酶(RNAP)啟動子和/或核酸內(nèi)切酶限制位點、通用引發(fā)序列、cDNA結(jié)合位點。在一些方面，所述RNAP啟動子選自由T7、T3和SP6組成的組。在一些方面，所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。在一些方面，所述cDNA結(jié)合位點為一個或多個G核苷酸。本文還公開一種使條形碼連接于固體支撐物的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供固體支撐物，具有經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含S1x序列和與第一條形碼寡核苷酸上的3’序列互補的序列；第一條形碼寡核苷酸，其包含與所述結(jié)合的寡核苷酸的序列互補的3’序列，和W序列；和b)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)以將所述W序列添加至所述固體支撐物上的所述結(jié)合的寡核苷酸的所述S1x序列中；c)提供具有S2y序列的第二條形碼寡核苷酸，其包含與在步驟b)中延伸的所述寡核苷酸的3’端互補的3’序列；d)執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)以將所述S2y序列添加至所述固體支撐物上的所述結(jié)合的寡核苷酸的所述S1x和W序列中，其中所述條形碼序列包含所述S1x、W和S2y序列。在一些方面，所述固體支撐物為珠粒。在一些方面，所述捕獲部分為抗生蛋白鏈菌素。在一些方面，所述第一或第二條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含RNA聚合酶(RNAP)啟動子和/或切口核酸內(nèi)切酶限制位點、通用引發(fā)序列、cDNA結(jié)合位點。在一些方面，所述RNAP啟動子選自由T7、T3和SP6組成的組。在一些方面，所述核酸內(nèi)切酶限制位點選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。在一些方面，所述cDNA結(jié)合位點為一個或多個G核苷酸。本文還公開一種通過上文所公開的方法中的任一者產(chǎn)生的具有連接的條形碼的固體支撐物。本文還公開一種珠粒條形碼文庫，其包含多種具有連接的條形碼的所述固體支撐物。本文還公開一種條形碼銜接構(gòu)建體，其包含通用引發(fā)序列、條形碼和cDNA結(jié)合位點。在一些方面，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包含RNAP啟動子。在一些方面，所述RNAP啟動子選自由T7、T3和SP6組成的組。在一些方面，所述構(gòu)建體進(jìn)一步包含切口核酸內(nèi)切酶限制位點。在一些方面，所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI組成的組。本文還公開一種條形碼銜接模板珠粒，其包含固體支撐物和經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的條形碼銜接分子，其中所述條形碼銜接分子包含條形碼序列和cDNA結(jié)合位點。在一些方面，所述cDNA結(jié)合位點包含一個或多個G核苷酸。在一些方面，所述條形碼序列包含序列S1x-W-S2y。本文還公開一種珠粒條形碼文庫，其包含多種如上文所公開的條形碼銜接模板珠粒。本文還公開一種聚核苷酸文庫，其包含多種條形碼銜接模板珠粒，所述珠粒包含固體支撐物和經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的條形碼銜接分子，其中所述條形碼銜接分子包含條形碼序列和cDNA結(jié)合位點，其中cDNA區(qū)偶聯(lián)于所述銜接子的3’端。在一些方面，所述cDNA結(jié)合位點包含一個或多個G核苷酸。在一些方面，所述條形碼序列包含序列S1x-W-S2y。在一些方面，所述cDNA源于B細(xì)胞。在一些方面，所述B細(xì)胞為成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞。在一些方面，所述cDNA源于B細(xì)胞源性可變免疫球蛋白區(qū)。本文還公開如圖17-19所示的微流體液滴器件。附圖簡述這些和其它特征、方面和優(yōu)勢關(guān)于以下描述和附圖將變得更好理解，在附圖中：圖1為根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的銜接分子或用于產(chǎn)生銜接分子的模板分子的圖。銜接分子的序列可包括RNA聚合酶啟動子和/或切口核酸內(nèi)切酶位點，隨后為通用引發(fā)序列(用于后續(xù)用于使引物退火的PCR步驟中)，隨后為條形碼序列和核酸結(jié)合序列。圖2A和2B顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案擴(kuò)增或產(chǎn)生銜接分子的方法。在圖2A中，RNA條形碼銜接子在線性擴(kuò)增反應(yīng)中通過RNAP(如T7)合成，所述RNAP結(jié)合于DNA模板上的啟動子序列并且合成單鏈條形碼銜接子RNA。在圖2B中，如Nt.BbvCI(NEB)的切口核酸內(nèi)切酶用于在DNA模板的有義鏈上引入切口。DNA條形碼銜接子接著在擴(kuò)增反應(yīng)中通過如Klenowexo-的鏈置換酶合成，所述鏈置換酶延伸切口并且置換所述單鏈條形碼銜接子。圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案將條形碼序列并入第一鏈cDNA中。此處合成RNA條形碼銜接子以證明對cDNA編條形碼。也可使用DNA條形碼銜接子(在圖2B中合成)。RNAP停止其啟動子并且合成RNA條形碼銜接子(圖3，左上部)。在所述相同反應(yīng)中，發(fā)生反轉(zhuǎn)錄并且產(chǎn)生第一鏈cDNA(右上部)?；贛MLV的H-反轉(zhuǎn)錄酶具有3’拖尾活性并且添加數(shù)個dC至所述第一鏈cDNA的3’端。所述條形碼銜接子與所述拖尾dC(底部)堿基配對并且所述反轉(zhuǎn)錄酶使用所述條形碼銜接子作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，從而將所述條形碼序列并入所述第一鏈cDNA中。因此對所述反應(yīng)中的所有mRNA編條形碼。圖4顯示在本發(fā)明的實施方案中RNA條形碼銜接子具有比DNA條形碼銜接子少的背景。在圖3的編條形碼反應(yīng)中，寡聚(dT)和條形碼銜接子均存在，并且兩種寡核苷酸可引發(fā)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。當(dāng)所述反應(yīng)用寡聚(dT)(圖4，頂部)引發(fā)時，所述反應(yīng)照常進(jìn)行。當(dāng)所述RT反應(yīng)用DNA條形碼銜接子(中部)錯誤引發(fā)時，在PCR期間正向引物可停止有義和反義鏈并且引起非所需產(chǎn)物的擴(kuò)增。當(dāng)所述RT反應(yīng)用RNA條形碼銜接子(底部)引發(fā)時，當(dāng)在PCR1中使用校正讀碼DNA聚合酶時生長鏈無法使用RNA核苷酸作為模板，并且因此錯誤引發(fā)的cDNA將不會在有義和反義鏈上含有條形碼銜接序列。因此，非所需產(chǎn)物不應(yīng)按指數(shù)規(guī)律擴(kuò)增，導(dǎo)致顯著減少背景。圖5A-C為卡通畫，說明根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案用于產(chǎn)生條形碼銜接子和執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)容積的分離。條形碼銜接分子可在多個第一反應(yīng)容積(如液滴)中酶法產(chǎn)生，所述第一反應(yīng)容積由圖5A中的垂直線表示。各第一反應(yīng)容積可含有水溶液中的條形碼銜接分子，所述條形碼銜接分子均具有相同條形碼序列。分別地，RNA分子可在多個第二反應(yīng)容積中反轉(zhuǎn)錄，所述第二反應(yīng)容積由圖5B中的水平線表示。各第二反應(yīng)容積可含有均源于相同樣品的RNA分子。所述第一和第二反應(yīng)容積可接著如通過合并液滴組合，所述液滴如由圖5C中的交叉線表示。圖5A和5B中的反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起，使得一種條形碼序列被引入對應(yīng)于各樣品的反應(yīng)容積中。所述條形碼序列可并入第一鏈cDNA或PCR產(chǎn)物中。圖6A-D顯示在本發(fā)明的各種實施方案中擴(kuò)增條形碼銜接模板以制造條形碼銜接分子。圖6A顯示連接于如珠粒的固體表面的條形碼銜接模板。圖6B顯示水溶液中的條形碼銜接分子，所述分子由圖6A中的條形碼銜接模板的擴(kuò)增產(chǎn)生。圖6C顯示單一條形碼銜接模板分子。所述分子在水溶液中并且容納在容器內(nèi)部。圖6D顯示圖6C的容器，其具有多種條形碼銜接分子，所述分子由單一模板分子的擴(kuò)增產(chǎn)生。圖7A-D顯示由模板產(chǎn)生條形碼銜接分子，其中所述模板連接于固體表面。在產(chǎn)生后，所述條形碼銜接分子在水溶液中。圖7A和7B顯示連接于固體表面的條形碼銜接模板。圖7C顯示由圖7A中的條形碼銜接模板酶法擴(kuò)增的條形碼銜接分子。圖7D顯示在圖7B中的條形碼銜接模板由所述固體表面化學(xué)或酶法裂解之后釋放至溶液中的條形碼銜接分子。圖8顯示使用DNA條形碼銜接子將條形碼序列并入cDNA的第一鏈中。(頂部)所述條形碼銜接子(包括3’聚T區(qū))由條形碼銜接模板使用DNA聚合酶產(chǎn)生。條形碼銜接分子在水溶液中。(底部)所述條形碼銜接子退火至mRNA的聚-A尾并且充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄的引物。所述條形碼序列并入cDNA的第一鏈的5’端中。圖9顯示使用DNA條形碼銜接子將條形碼序列并入cDNA的第一鏈中。(頂部)所述條形碼銜接子(包括3’隨機或半隨機序列區(qū))由條形碼銜接模板使用DNA聚合酶產(chǎn)生。條形碼銜接分子在水溶液中。(底部)所述條形碼銜接子通過退火至至少部分地與所述3’序列區(qū)互補的RNA區(qū)而充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄的引物。所述條形碼序列并入cDNA的第一鏈的5’端中。圖10為消除個別吸移步驟的編條形碼工作流的示意性概述。簡單地說，編條形碼反應(yīng)發(fā)生在油包水液滴中，其中細(xì)胞和含有條形碼銜接子的珠粒通過液滴產(chǎn)生器件分布。條形碼銜接子酶法擴(kuò)增或從如珠粒的固體表面釋放，并且所述條形碼添加至來自細(xì)胞的所有轉(zhuǎn)錄物中。圖11顯示使用充當(dāng)RT-PCR的正向引物的DNA條形碼銜接子將條形碼序列并入擴(kuò)增子中。所述條形碼銜接子由DNA模板使用DNA聚合酶(左上部)酶法產(chǎn)生。條形碼銜接分子在水溶液中。在獨立反應(yīng)容積中，或在相同反應(yīng)容積中，使用mRNA模板、反轉(zhuǎn)錄酶、含有聚T區(qū)的引物和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸合成cDNA的第一鏈(右上部)。所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸含有與所述條形碼銜接子中的序列區(qū)互補的序列區(qū)。所述條形碼序列接著在所述cDNA的PCR擴(kuò)增期間并入擴(kuò)增子中(底部)。所述條形碼銜接子充當(dāng)PCR的正向引物。圖12顯示使用充當(dāng)RT-PCR的反向引物的DNA條形碼銜接子將條形碼序列并入擴(kuò)增子中。所述條形碼銜接子由DNA模板使用DNA聚合酶(左上部)酶法產(chǎn)生。條形碼銜接分子在水溶液中。在獨立反應(yīng)容積中，或在相同反應(yīng)容積中，使用mRNA模板、反轉(zhuǎn)錄酶、含有聚T區(qū)的引物和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸合成cDNA的第一鏈(右上部)。所述引物含有與所述條形碼銜接子中的3’序列區(qū)互補的5’序列區(qū)。所述條形碼序列接著在所述cDNA的PCR擴(kuò)增期間并入擴(kuò)增子中(底部)。所述條形碼銜接子充當(dāng)PCR的反向引物。圖13顯示使用充當(dāng)RT-PCR的反向引物的DNA條形碼銜接子將條形碼序列并入擴(kuò)增子中。所述條形碼銜接子由DNA模板使用DNA聚合酶酶法產(chǎn)生(左上部)。條形碼銜接分子在水溶液中。在獨立反應(yīng)容積中，或在相同反應(yīng)容積中，使用mRNA模板、反轉(zhuǎn)錄酶、含有3’隨機序列區(qū)的引物和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸合成cDNA的第一鏈(右上部)。所述引物可通過所述隨機序列區(qū)退火至所述mRNA，并且還含有與所述條形碼銜接子中的3’序列區(qū)互補的5’序列區(qū)。所述條形碼序列接著在所述cDNA的PCR擴(kuò)增期間并入擴(kuò)增子中(底部)。所述條形碼銜接子充當(dāng)PCR的反向引物。圖14A-C說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案使用核酸標(biāo)記物查詢用于所選表型的細(xì)胞群體的方法。除了對來自細(xì)胞的RNA編條形碼，還可對包括來自非細(xì)胞來源的RNA的任何RNA編條形碼。非細(xì)胞RNA可通過任何方式，如通過用核酸標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞而被引入反應(yīng)容積中。這種標(biāo)記物可包括偶聯(lián)于分子標(biāo)記的核酸，所述分子標(biāo)記如抗體(圖14A)、抗原(圖14B)或pMHC(圖14C)。所述核酸標(biāo)記物可結(jié)合于所述群體中的一些或所有細(xì)胞，視細(xì)胞的表型和其對所述分子標(biāo)記的親和力而定。所述群體中的所有細(xì)胞均可接著溶解并且可對各細(xì)胞中的mRNA編條形碼。關(guān)于結(jié)合所述核酸標(biāo)記物的細(xì)胞，也可對締合的核酸編條形碼。這種核酸可為RNA或具有RNAP啟動子的dsDNA模板，所述啟動子如T7、T3或SP6啟動子。測序可接著使非內(nèi)源性RNA序列與特異性細(xì)胞締合，由此檢測何種細(xì)胞結(jié)合于所述分子標(biāo)記。不同分子標(biāo)記可偶聯(lián)于不同核酸序列，使得能夠鑒別多種細(xì)胞表型。圖15顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案在一種反應(yīng)中合成條形碼銜接模板珠粒。(左側(cè))珠粒偶聯(lián)于寡核苷酸。偶聯(lián)可通過將生物素標(biāo)記的寡核苷酸偶聯(lián)于抗生蛋白鏈菌素涂布的珠粒上進(jìn)行，并且也可使用所屬領(lǐng)域中已知的其它方式偶聯(lián)。(右側(cè))偶聯(lián)的珠粒、正向和反向引物以及含有條形碼序列和與所述正向和反向引物互補的序列的條形碼寡核苷酸均存在于反應(yīng)容器中，其中所述條形碼寡核苷酸優(yōu)選地以僅單一拷貝存在。接著進(jìn)行PCR以擴(kuò)增所述條形碼序列并且將其并入珠粒偶聯(lián)的寡核苷酸中以形成條形碼銜接模板珠粒。圖16顯示根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案在多個步驟中合成條形碼銜接模板珠粒。(頂部)珠粒偶聯(lián)于含有獨特S1序列的寡核苷酸的(多個拷貝)。執(zhí)行多種獨立偶聯(lián)反應(yīng)，其中各偶聯(lián)反應(yīng)使用含有不同的獨特S1序列的寡核苷酸。各自偶聯(lián)于具有不同的獨特S1序列的寡核苷酸的珠粒接著匯集在一起，形成具有S1x序列的珠粒的文庫。(中間)這些珠粒接著用于延伸反應(yīng)。在各反應(yīng)中，含有獨特W序列的寡核苷酸與偶聯(lián)于所述珠粒的含S1x寡核苷酸互補地堿基配對，并且執(zhí)行使用DNA聚合酶的延伸反應(yīng)。匯集來自所有延伸反應(yīng)的珠粒，并且形成含有S1x序列各自與獨特W序列的組合的珠粒的文庫。(底部)使來自前一步驟的雙鏈DNA變性并且從所述珠粒洗去反義鏈。如先前在所述珠粒上執(zhí)行額外的獨立延伸反應(yīng)，但與偶聯(lián)于所述珠粒的含S1x和W寡核苷酸互補地堿基配對的寡核苷酸在各獨立反應(yīng)中含有不同的獨特S2序列。匯集來自所有延伸反應(yīng)的珠粒，并且獲得含有條形碼銜接模板的珠粒的文庫，其中S1x、W和S2y序列的組合形成所述條形碼序列。大量的獨特條形碼序列可因此在這種組合方法中獲得。此外，多種獨特W序列可各自與S1x和S2y序列組合，產(chǎn)生一般格式S1x-Wz-S2y的條形碼。圖17顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案的液滴器件。三個DolomiteP-泵配備有流量傳感器。第一個P-泵經(jīng)由微流體管直接連接于2-Reagent液滴芯片，所述微流體管并入T形接合點以將線路分成兩個輸入。這是油輸入線路。另兩個P-泵經(jīng)由流體管連接于FEP樣品環(huán)管，所述環(huán)管配合于珀耳帖器件的凹槽中，所述珀耳帖器件用于在所述器件操作時保持樣品冷凍，并且這些環(huán)管各自連接于所述2-Reagent液滴芯片。各樣品環(huán)管在其前端并入四通閥，使得樣品可借助于注射器裝載于所述環(huán)管中。第一個樣品環(huán)管欲填充細(xì)胞和編條形碼珠粒懸浮液，而第二個環(huán)管欲填充RT/溶解混合物。所述樣品環(huán)管可水平地并且在所述液滴芯片上方或與所述液滴芯片相齊定向以便避免任何上坡區(qū)段，細(xì)胞和珠粒可能難以行進(jìn)通過所述上坡區(qū)段。圖18提供圖17所示的液滴器件的配置的細(xì)節(jié)。零件由IDEXH&S零件號給出：1.0.A)1528(110mm)；1.0.B)P-732；1.0.C)P-232/P-248；1.0.D)1688(300mm)；1.0.E)M-645；1.0.F)P-630；1.0.H)P-632；1.0.J)P-702；1.0.K)1529(50mm)；1.0.L)V-101D；1.0.N)P-732；1.0.O)P-624；1.0.T)1531(900mm)；1.2.A)P-630；1.2.B)1516(500mm)；1.2.C)P-702；1.2.D)1529(150mm)；1.2.E)P-702；1.2.G)1560(150mm)；1.3.A)1528(135mm)；1.5.A)1516(150mm)；1.5.B)1529(300mm)；1.7.A)61005；1.7.B)65020；2.0.A)1477(1254mm)；2.0.B)1527(1254mm)；2.0.C)1520(120mm)；2.0.D)1520(600mm)；2.0.E)1520(200mm)；2.0.F)1520(200mm)。出口管(從所述芯片至所述樣品收集管)為1562(180mm)。圖19顯示本文所述的液滴器件的替代實施方案。所述樣品環(huán)管與冰箱接觸。圖20顯示由條形碼銜接模板珠粒擴(kuò)增的RNA條形碼銜接子，所述珠粒使用多步驟方法制造。條形碼銜接模板珠粒用于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。存在來自分別使用S1-寡聚+W-寡聚-a+S2-寡聚-a和S1-寡聚+w-寡聚-b+S2-寡聚-b制造的珠粒的條帶。圖21顯示在多種緩沖液中執(zhí)行的編條形碼反應(yīng)。1、2和3是指三種反應(yīng)緩沖液，其分別為下文所述的0.5xMMLV、1xThermopolDF和0.5xTAE緩沖液。K、L和G是指κ、λ和γ免疫球蛋白鏈。所有鏈在所用的不同反應(yīng)緩沖液中擴(kuò)增。圖22顯示編條形碼反應(yīng)使用RNA條形碼更好地工作。1、2和3是指三種反應(yīng)條件，其為使用RNA條形碼銜接子的1xMMLV和0.5xMMLV條件以及使用DNA條形碼銜接子的1xMMLV。K、L和G是指κ、λ和γ免疫球蛋白鏈。使用DNA銜接子的反應(yīng)中的條帶由于高背景而模糊。圖23顯示在具有條形碼銜接模板的液滴反應(yīng)容器中由于對單一B細(xì)胞編條形碼而擴(kuò)增的產(chǎn)物。對應(yīng)于κ和λ輕鏈(“K/L”)和μ重鏈(“M”)的條帶可清楚可見。圖24顯示在與編條形碼珠粒共封裝于油包水乳液中之后輕鏈(κ/λ)和重鏈(γ)靶標(biāo)的RT/PCR擴(kuò)增。各樣品在成對泳道中運行，一個泳道用于κ/λ輕鏈(左側(cè))并且一個泳道用于γ重鏈(右側(cè))。乳液樣品包括細(xì)胞+珠粒共封裝實驗樣品(細(xì)胞+珠粒)以及兩個對照樣品，所述對照樣品相同地制備，除了在一種對照樣品中，條形碼模板銜接珠粒用水性條形碼銜接模板(細(xì)胞+水性BC)置換，并且在一種對照樣品中，細(xì)胞用獲自AllCells的純化的人類PBMCRNA模板置換(RNA+珠粒)。還包括整體陽性和陰性對照，其不進(jìn)入乳液器件(分別為R-和R+1)。產(chǎn)物條帶關(guān)于所述實驗樣品和所有陽性對照均可見，并且在陰性對照中不存在。圖25說明使用多種條形碼銜接模板類型制造條形碼銜接模板珠粒的方法。含條形碼寡核苷酸由預(yù)期長度82bp成功地產(chǎn)生(左上部)。成功地獲得單色條形碼銜接模板珠粒(右側(cè))。頂部圖形最初門控于AF647-珠粒上并且底部圖形最初門控于FAM-Cy3-珠粒上，使得在兩個圖形中繪出的閘門僅顯示單色珠粒。珠粒成功地用于對RNA編條形碼(左下部)。此處，T細(xì)胞受體α和β鏈成功地編條形碼并且擴(kuò)增。先前產(chǎn)生的珠粒用作陽性對照(泳道1-2)，并且單色條形碼銜接模板珠粒(泳道4-7)與陰性對照(泳道3)進(jìn)行比較。DNA在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，其中100bp梯帶裝載于左側(cè)泳道中。圖26說明通過將條形碼銜接模板珠粒和細(xì)胞封裝于變化大小的液滴中來對T細(xì)胞受體α鏈有效編條形碼。編條形碼RNA在編條形碼之后擴(kuò)增并且在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。圖27顯示TCRα和β鏈的文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。100bp梯帶裝載于右側(cè)泳道中。圖28顯示IFNγ、CD8和CD4基因的文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。100bp梯帶裝載于右側(cè)泳道中。圖29顯示轉(zhuǎn)錄組學(xué)文庫的文庫PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。100bp梯帶裝載于右側(cè)泳道中。定義當(dāng)所述術(shù)語用于本文中時，將序列“并入”聚核苷酸中是指通過磷酸二酯鍵共價連接一系列核苷酸與所述聚核苷酸的剩余部分，例如在所述聚核苷酸的3’或5’端，其中所述核苷酸依所述序列所指示的順序連接。如果聚核苷酸含有序列或其互補序列，那么所述序列已經(jīng)“并入”所述聚核苷酸中，或等效地，所述聚核苷酸“并入”所述序列。序列并入聚核苷酸中可酶法(例如，通過接合或聚合)或使用化學(xué)合成(例如，通過亞磷酰胺化學(xué))發(fā)生。如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增(amplify)”和“擴(kuò)增(amplification)”是指完全或部分地酶法拷貝聚核苷酸的序列，以便產(chǎn)生更多也含有所述序列或其互補序列的聚核苷酸。正在拷貝的序列被稱作模板序列。擴(kuò)增的實例包括通過RNA聚合酶進(jìn)行的DNA模板化RNA合成、通過反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行的RNA模板化第一鏈cDNA合成以及使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進(jìn)行的DNA模板化PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增包括所有引物-延伸反應(yīng)。如本文所用，術(shù)語“等溫”是指在恒定溫度或溫度范圍下進(jìn)行的反應(yīng)，如酶反應(yīng)。術(shù)語“締合(associated)”在本文中用于指樣品與DNA分子、RNA分子或起源于或源于所述樣品的其它聚核苷酸之間的關(guān)系。如果聚核苷酸為內(nèi)源性聚核苷酸，那么所述聚核苷酸與樣品締合，即，當(dāng)樣品選自或源于內(nèi)源性聚核苷酸時，所述聚核苷酸存在于所述樣品中。例如，細(xì)胞的內(nèi)源性mRNA與所述細(xì)胞締合。由這些mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA和由所述cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA擴(kuò)增子含有所述mRNA的序列并且還與所述細(xì)胞締合。與樣品締合的聚核苷酸無需位于或合成于所述樣品中，并且即使在所述樣品已經(jīng)受到破壞后(例如，在細(xì)胞已經(jīng)溶解后)仍被認(rèn)為與所述樣品締合。分子編條形碼或其它技術(shù)可用于確定混合物中的何種聚核苷酸與特定樣品締合。當(dāng)所述術(shù)語用于本文中時，“反應(yīng)容積”(或等效地，“容器”或“隔室”)為其中可容納例如水溶液的液體的容積并且所述容積保持與液體的其它所述容積或周圍媒介物分離(例如，隔離)的空間。反應(yīng)容積與其周圍環(huán)境之間的分離可由所述反應(yīng)容積周圍的固體屏障或由相分離引起。例如，懸浮于疏水性載液中的水性微流體液滴可構(gòu)成反應(yīng)容積，因為水在所述載液中不可混溶。因此，在所述載液中彼此分離的兩種液滴保持分離，并且溶解于一種液滴中的核酸或其它親水性物質(zhì)無法離開所述液滴或運送至另一液滴。反應(yīng)容積也可通過例如燒瓶、燒杯、離心管以及多孔板中的孔來界定。“添加”條形碼銜接子至與樣品締合的RNA中涉及將所述銜接分子引入含有這些RNA的反應(yīng)容積中，使得所述RNA可參與編條形碼反應(yīng)。在添加后，所述條形碼銜接子可例如通過與RNA雜交直接與一種或多種RNA反應(yīng)，或可參與其中RNA分子充當(dāng)模板的聚合反應(yīng)或一系列反應(yīng)(例如反轉(zhuǎn)錄或RT-PCR)。在一些方面，組合物可包括聚核苷酸。術(shù)語“聚核苷酸”是指如DNA分子和RNA分子和其類似物的核酸(例如，使用核苷酸類似物或使用核酸化學(xué)產(chǎn)生的DNA或RNA)。如所需，聚核苷酸可例如使用公認(rèn)的核酸化學(xué)以合成方式或使用例如聚合酶酶法制得并且必要時可進(jìn)行修飾。典型修飾包括甲基化、生物素標(biāo)記和其它所屬領(lǐng)域已知的修飾。另外，聚核苷酸可為單鏈的或雙鏈的并且必要時連接于可檢測部分。在一些方面，聚核苷酸可包括雜合分子，例如包含DNA和RNA。“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自一般代表分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應(yīng)了解術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可指修飾的核苷酸或代替置換部分。熟練人員充分了解鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可由其它部分置換而不會大致改變包含具有所述置換部分的核苷酸的寡核苷酸的堿基配對特性。例如而不限于，包含肌苷作為其堿基的核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸堿基配對。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在核苷酸序列中由含有例如肌苷的核苷酸置換。在另一實施例中，所述寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶可分別用鳥嘌呤和尿嘧啶置換以形成與靶標(biāo)mRNA堿基配對的G-U搖擺。含有所述置換部分的序列適用于本文所述的組合物和方法。如本文所用，并且除非另外指示，否則術(shù)語“互補”在用于描述相對于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列時是指包含所述第一核苷酸序列的聚核苷酸在某些條件下與包含所述第二核苷酸序列的聚核苷酸雜交并且形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力，如熟練人員應(yīng)了解。所述條件可例如為嚴(yán)格條件，其中嚴(yán)格條件可包括：400mMNaCl，40mMPIPESpH6.4，1mMEDTA，50℃或70℃持續(xù)12-16小時，隨后洗滌。其它條件可適用，如可在生物體內(nèi)部遇到的生理學(xué)相關(guān)條件。熟練人員將能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用確定主要適用于兩個序列的互補性的測試的條件的集合。互補序列包括包含第一核苷酸序列的聚核苷酸區(qū)域與包含第二核苷酸序列的聚核苷酸區(qū)域在一個或兩個核苷酸序列的長度或長度的一部分上的堿基配對。所述序列可在本文中稱作關(guān)于彼此“互補”。然而，在第一序列在本文中稱作關(guān)于第二序列“大致互補”的情況下，所述兩個序列可為互補的，或其可在堿基配對的區(qū)域內(nèi)包括一個或多個但一般不超過約5、4、3或2個錯配堿基對。關(guān)于具有錯配堿基對的兩個序列，所述序列將被視為“大致互補”，只要所述兩個核苷酸序列經(jīng)由堿基配對彼此結(jié)合。如本文所用，“互補”序列也可包括非Watson-Crick堿基對和/或由非天然和修飾的核苷酸形成的堿基對，或完全由所述堿基對形成，只要實現(xiàn)關(guān)于其雜交能力的上述實施方案。所述非Watson-Crick堿基對包括但不限于G:U搖擺或Hoogstein堿基配對。術(shù)語百分比“同一性”在兩個或更多個核酸或多肽序列的情形中是指如使用下文所述的序列比較算法之一(例如BLASTP和BLASTN或熟練人員可獲得的其它算法)或通過目視檢查所測量，當(dāng)關(guān)于最大對應(yīng)進(jìn)行比較和比對時，具有規(guī)定的相同核苷酸或氨基酸殘基百分率的兩個或更多個序列或子序列。視應(yīng)用而定，百分比“同一性”可在進(jìn)行比較的序列區(qū)域內(nèi)，例如在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在，或替代地在待比較的兩個序列的全長內(nèi)存在。關(guān)于序列比較，典型地一個序列充當(dāng)與測試序列進(jìn)行比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機中，必要時指定子序列座標(biāo)并且指定序列算法程序參數(shù)。所述序列比較算法接著基于指定的程序參數(shù)計算所述測試序列相對于所述參考序列的百分比序列同一性。可進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對，例如通過Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通過Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法，通過這些算法的計算機化執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)或通過目視檢查(一般參看Ausubel等人，下文)。適用于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一個實例為BLAST算法，其描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過NationalCenterforBiotechnologyInformation網(wǎng)站公開可得。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定所述算法的靈敏性和速度。BLASTN算法(關(guān)于核苷酸序列)使用字長(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和兩個鏈的比較作為缺省值。同一性序列包括包含第一核苷酸序列的聚核苷酸與包含第二核苷酸序列的聚核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的完整長度內(nèi)的100％同一性。所述序列可在本文中稱作關(guān)于彼此“完全同一”。然而，在一些方面，在第一序列在本文中稱作關(guān)于第二序列“大致同一”的情況下，所述兩個序列可為完全互補的，或其可在比對后具有一個或多個但一般不超過約5、4、3或2個錯配核苷酸。在一些方面，在第一序列在本文中稱作關(guān)于第二序列“大致同一”的情況下，所述兩個序列可為完全互補的，或其可彼此至少約50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一。為了確定本文所述的兩個核苷酸序列的百分比同一性，可使用上文所述的BLASTN的缺省設(shè)定。在第一序列在本文中稱作關(guān)于第二序列的同一性“相異”的情況下，所述兩個序列在比對后具有至少一個或多個錯配核苷酸。在一些方面，相異序列可在比對后具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個錯配核苷酸。在一些方面，相異序列可彼此約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或少于100％同一。在一些方面，在第一序列在本文中稱作關(guān)于第二序列“相異”的情況下，所述兩個序列可具有大致或完全同一序列，不過基于所述序列內(nèi)的修飾的不同模式彼此不同。所述修飾是本領(lǐng)域中一般已知的，例如甲基化。在一些方面，聚核苷酸可存在于聚核苷酸的文庫中。在一些方面，聚核苷酸文庫可包括多種聚核苷酸。在一些方面，所述多種聚核苷酸中的各聚核苷酸可源于單一樣品。在一些方面，單一樣品可包括單細(xì)胞，如B細(xì)胞。本文中使用常規(guī)表示法來描述核苷酸序列：單鏈核苷酸序列的左手端為5'端；雙鏈核苷酸序列的左手方向被稱作5'方向。核苷酸5'至3'添加至新生RNA轉(zhuǎn)錄物中的方向被稱作轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈被稱作“編碼鏈”；在與由所述DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA具有相同序列的DNA鏈上并且位于所述RNA轉(zhuǎn)錄物的5'至5'端的序列被稱作“上游序列”；在與所述RNA具有相同序列的DNA鏈上并且在所述編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的3'至3'端的序列被稱作“下游序列”。術(shù)語“信使RNA”或“mRNA”是指無內(nèi)含子并且可翻譯成多肽的RNA。術(shù)語“cDNA”是指與mRNA互補或同一的DNA，呈單鏈或雙鏈形式。術(shù)語“擴(kuò)增子”是指核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如RT-PCR)的擴(kuò)增產(chǎn)物。術(shù)語“雜交”是指與互補核酸特異性非共價結(jié)合相互作用的序列。雜交可針對核酸序列的全部或一部分發(fā)生。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到核酸雙鏈體或雜合物的穩(wěn)定性可由Tm確定。關(guān)于雜交條件的額外指導(dǎo)可發(fā)現(xiàn)于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1-6.3.6中和Sambrook等人,MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,第3卷中。如本文所用，“區(qū)域”是指聚核苷酸的核苷酸序列的鄰接部分。本文中描述的區(qū)域的實例包括鑒別區(qū)、樣品鑒別區(qū)、板鑒別區(qū)、銜接區(qū)等。在一些方面，聚核苷酸可包括一個或多個區(qū)域。在一些方面，聚核苷酸可包括少于2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個區(qū)域。在一些方面，區(qū)域可偶聯(lián)。在一些方面，區(qū)域可操作性偶聯(lián)。在一些方面，區(qū)域可物理偶聯(lián)。如本文所用，“可變區(qū)”是指由基因重組或基因轉(zhuǎn)換事件產(chǎn)生的可變核苷酸序列，所述事件如V(D)J重組和在上游VH基因區(qū)段與重排VDJ基因之間的同源重組以制造最終表達(dá)的基因產(chǎn)物。實例為但不限于免疫球蛋白基因和T細(xì)胞受體基因。例如，其可包括從所關(guān)注的T細(xì)胞或B細(xì)胞分離的免疫球蛋白的V、J和/或D區(qū)或T細(xì)胞受體序列，所述細(xì)胞如活化的T細(xì)胞或活化的B細(xì)胞。如本文所用，“B細(xì)胞可變免疫球蛋白區(qū)”是指從B細(xì)胞分離的可變免疫球蛋白核苷酸序列。例如，可變免疫球蛋白序列可包括從所關(guān)注的B細(xì)胞分離的免疫球蛋白序列的V、J和/或D區(qū)，所述細(xì)胞如記憶B細(xì)胞、活化的B細(xì)胞或成漿細(xì)胞。如本文所用，“條形碼”或“條形碼序列”是指可偶聯(lián)于至少一個核苷酸序列以便例如稍后鑒別所述至少一個核苷酸序列的任何獨特序列標(biāo)記。如本文所用，“條形碼集合”是指可偶聯(lián)于來自樣品的核苷酸序列的序列的任何獨特集合，其中核苷酸序列偶聯(lián)于所述集合中的一個條形碼序列，以便例如稍后鑒別所述核苷酸序列。術(shù)語“條形碼銜接子”、“編條形碼銜接子”和“條形碼銜接分子”在本文中可互換使用以指包含獨特條形碼序列的寡核苷酸。術(shù)語“條形碼銜接模板”、“銜接模板”、“模板分子”、“條形碼銜接構(gòu)建體”和“銜接構(gòu)建體”在本文中可互換使用以指可用作模板來擴(kuò)增并且制造單鏈條形碼銜接分子的包含條形碼序列的核酸分子。如本文所用，“條形碼銜接模板珠?！笔侵概悸?lián)于一種或多種條形碼銜接模板的珠粒。如本文所用，“編條形碼”或“編條形碼反應(yīng)”是指連接條形碼序列或條形碼序列的互補序列與核酸的反應(yīng)。所述條形碼銜接子無需必定與所述核酸共價連接，而是所述條形碼序列信息本身與所述核酸連接或并入所述核酸中?！皩怂峋帡l形碼”、“對細(xì)胞編條形碼”、“對來自細(xì)胞的核酸編條形碼”、“對來自反應(yīng)容器的核酸編條形碼”和“對反應(yīng)容器編條形碼”可互換使用。如本文所用，“鑒別區(qū)”是指可偶聯(lián)于至少一個核苷酸序列以便例如稍后鑒別所述至少一個核苷酸序列的核苷酸序列標(biāo)記(例如獨特條形碼序列)。在一些方面，條形碼序列用作樣品鑒別區(qū)。在一些方面，條形碼集合用作樣品鑒別區(qū)。如本文所用，“免疫球蛋白區(qū)”是指來自抗體的一個或兩個鏈(重鏈和輕鏈)的核苷酸序列的鄰接部分。如本文所用，“銜接區(qū)”或“銜接分子”是指偶聯(lián)第一核苷酸序列至第二核苷酸序列的連接子。在一些方面，銜接區(qū)可包括充當(dāng)連接子的核苷酸序列的鄰接部分。在一些方面，銜接區(qū)或銜接分子可包括結(jié)合位點，如cDNA結(jié)合位點。例如，結(jié)合位點可具有序列GGG并且經(jīng)由GGG與CCC之間的結(jié)合偶聯(lián)第一序列至第二序列。在一些方面，所述銜接區(qū)或銜接分子可包含如RNA聚合酶啟動子、切口核酸內(nèi)切酶限制位點、通用引發(fā)序列、條形碼和cDNA結(jié)合位點的元件。術(shù)語“樣品”可包括從受試者(例如哺乳動物受試者、動物受試者、人類受試者或非人類動物受試者)取得的RNA、DNA、單細(xì)胞或多個細(xì)胞或細(xì)胞的片段或體液的等分試樣。樣品可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用現(xiàn)在已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何方式進(jìn)行選擇，所述方式包括離心、靜脈穿刺、抽血、排泄、擦拭、射精、按摩、活組織檢查、針吸、灌洗樣品、刮削、手術(shù)切口、激光捕獲顯微切割、梯度分離或干預(yù)或所屬領(lǐng)域中已知的其它方式。樣品也可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知與所關(guān)注的樣品締合的一種或多種標(biāo)記物進(jìn)行選擇。樣品也可使用所屬領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行選擇，所述方法如細(xì)胞分選和FACS。發(fā)明詳述本發(fā)明的實施方案提供一種在各反應(yīng)容器中產(chǎn)生獨特核酸編條形碼銜接子的方法，使得所述核酸編條形碼銜接子在水相中但產(chǎn)生所述銜接子的模板可連接于固體表面(如連接于珠粒)或以游離形式處于溶液中。核酸編條形碼銜接子為包含獨特條形碼序列的任何聚核苷酸序列并且可或可不具有修飾(例如，生物素標(biāo)記或含有C18間隔區(qū))或含有修飾的聚核苷酸(如2’-O-甲基RNA堿基)。還提供使用本文公開的方法產(chǎn)生的組合物。相應(yīng)地，本發(fā)明提供RNA和DNA銜接子的組合物和用于其產(chǎn)生的構(gòu)建體。尤其還提供條形碼銜接模板珠粒文庫、裝載有RNA條形碼銜接子的乳液液滴文庫、含有具有細(xì)胞的條形碼文庫的乳液、編條形碼cDNA文庫和微流體液滴產(chǎn)生器件。在一些實施方案中，所述編條形碼銜接模板為雙鏈DNA(dsDNA)模板，其包含以下序列：5’-T7啟動子–通用引發(fā)序列–條形碼序列–結(jié)合序列-3’。所述T7啟動子序列允許通過T7RNA聚合酶由模板合成RNA編條形碼銜接子。所述通用引發(fā)序列用于與下游使用的PCR引物互補。所述結(jié)合序列由一個或多個鳥嘌呤堿基(G)組成并且允許所述編條形碼銜接子與第一鏈cDNA的3’端互補堿基配對(圖1)?？墒褂闷渌鼏幼有蛄校绲幌抻赥3和SP6啟動子序列，其允許分別通過T3和SP6RNA聚合酶合成RNA編條形碼銜接子。也可使用不具有特異性啟動子序列的其它RNA聚合酶，只要在大部分情形中合成全長或接近全長編條形碼銜接子(圖2A)。也可使用等溫擴(kuò)增，典型地使用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，如Bst大片段和Klenow3’→5’exo-，只要在大部分情形中合成全長或接近全長編條形碼銜接子。可使用特異性引物或切口核酸內(nèi)切酶序列來代替啟動子序列，視所用的等溫擴(kuò)增方法而定(圖2B)。因此產(chǎn)生的編條形碼銜接子將包含DNA核苷酸而非RNA核苷酸。RNA或DNA編條形碼銜接子可連接于所關(guān)注的聚核苷酸。先前已經(jīng)描述連接編條形碼銜接子至第一鏈cDNA的3’端(PCT/US2012/000221)。簡單地說，H-MMLV反轉(zhuǎn)錄酶具有3’dC拖尾活性并且添加非模板化dC至第一鏈cDNA。如果以至少一個G終止的編條形碼銜接子也存在，那么所述銜接子可與所述第一鏈cDNA的3’dC堿基配對并且所述反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)歷模板轉(zhuǎn)換并且使用所述編條形碼銜接子作為模板繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。所述反轉(zhuǎn)錄酶因此經(jīng)由磷酸二酯鍵共價添加所述條形碼序列至所述第一鏈cDNA的3’端(圖3)。在一些實施方案中，編條形碼銜接子使用T7RNA聚合酶由含有5’T7啟動子的雙鏈DNA(dsDNA)線性擴(kuò)增。在一些實施方案中，所述編條形碼銜接子在與所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相同的反應(yīng)中線性擴(kuò)增。由dsDNA模板擴(kuò)增編條形碼銜接子至少提供以下優(yōu)勢：1.編條形碼銜接模板可連接于珠粒(每個珠粒獨特條形碼)并且存儲于相同存儲容器中2.獨特編條形碼銜接子的多個拷貝可遞送至反應(yīng)容器中而不使用個別吸移步驟3.編條形碼銜接子擴(kuò)增，從而克服可連接于各珠粒的聚核苷酸的有限量4.擴(kuò)增的條形碼在水相中并且利用快得多的液相而非固相動力學(xué)還存在使用RNA編條形碼銜接子而非DNA編條形碼銜接子時所涉及的優(yōu)勢：1.RNA編條形碼銜接子可在連接所述條形碼序列至所關(guān)注的聚核苷酸的模板轉(zhuǎn)換反應(yīng)中更有效，因為反轉(zhuǎn)錄酶典型地使用RNA而非DNA作為模板并且模板轉(zhuǎn)換由所述反轉(zhuǎn)錄酶體內(nèi)使用以在反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制中轉(zhuǎn)換為RNA模板。2.當(dāng)在下游PCR反應(yīng)中使用校正讀碼DNA聚合酶時，使用完全RNA轉(zhuǎn)錄物作為銜接子導(dǎo)致較少背景。當(dāng)所述條形碼銜接子錯誤引發(fā)并且起始反轉(zhuǎn)錄時，背景出現(xiàn)，導(dǎo)致在第一鏈cDNA的5’和3’端均添加條形碼銜接序列。這些可在PCR中通過與所述條形碼銜接子互補的僅一種引物擴(kuò)增。然而，如果校正讀碼DNA聚合酶在PCR期間使用，那么其將不轉(zhuǎn)錄所述RNA引物(圖4)，從而消除來自條形碼銜接子錯誤引發(fā)的背景。由于涉及大量的編條形碼反應(yīng)，NextGen測序最適合對編條形碼核酸測序以利用生物信息學(xué)使來自相同反應(yīng)容器的核酸彼此締合。額外條形碼可與相異于另一樣品集合的樣品集合締合并且可使用具有獨特條形碼序列的PCR引物締合。這些額外條形碼也稱作板-ID。板-ID賦予優(yōu)勢，如在同一測序運作中區(qū)別不同樣品集合，或利用生物信息學(xué)追蹤并且消除不同樣品集合之間的任何潛在污染。由于PCR和NextGen測序誤差不可避免，本文所述的條形碼可設(shè)計成在序列空間中以合理距離(例如漢明或編輯距離)隔開，使得任何兩種條形碼的序列彼此區(qū)別將在于至少數(shù)個核苷酸。因此，可正確地指定大多數(shù)條形碼測序讀數(shù)，具有小百分率的未指定和錯誤指定條形碼。在一些實施方案中，設(shè)計預(yù)定條形碼序列，其中以最小漢明或編輯距離隔開。在一些實施方案中，條形碼包含隨機核苷酸，如(N)15，其產(chǎn)生415的總體可能空間，或約10億個獨特條形碼序列。如果待編條形碼的樣品的數(shù)目比這一總體空間少得多，例如1百萬個或總體條形碼空間的0.1％，那么我們預(yù)期所述條形碼將彼此隔開充分距離，使得應(yīng)正確地指定大多數(shù)條形碼。只要錯誤指定率充分低，可簡單地檢測并且棄去錯誤指定的測序讀數(shù)，因為連接于所述錯誤指定的條形碼序列的核酸不同于共有序列。我們應(yīng)預(yù)期針對締合于條形碼序列的各基因(例如γ重鏈、TCRα鏈)的共有序列由正確地指定的讀數(shù)組裝，因為所述條形碼序列是設(shè)計成隔開充分距離。反應(yīng)容器中的樣品可用獨特條形碼或獨特條形碼集合編條形碼。獨特條形碼集合可通過例如每個反應(yīng)容器遞送兩種或更多種條形碼銜接模板珠粒來使用，并且樣品的各核酸用所述獨特條形碼集合中的一種條形碼編條形碼。核酸接著通過使用獨特條形碼集合締合至樣品。一種區(qū)別何種條形碼集合用于何種樣品的方法是檢查來自NextGen測序的讀數(shù)。預(yù)期各條形碼序列與來自不同樣品的組裝的重疊群締合，因為條形碼序列在獨特條形碼集合中重新使用。但預(yù)期來自相同樣品的重疊群為同一的。例如，可觀察到同一的免疫球蛋白γ重鏈重疊群使用條形碼序列a、b和c。并且可觀察到條形碼序列a、b和d與另一免疫球蛋白γ重鏈重疊群締合。由此，我們可接著推斷a、b和c構(gòu)成條形碼集合1，并且a、b和d構(gòu)成條形碼集合2。在一些實施方案中，N個獨特條形碼序列的條形碼銜接模板珠粒的文庫充分多樣以對n種樣品編條形碼，使得大多數(shù)樣品由獨特條形碼或獨特條形碼集合編條形碼。如果條形碼銜接模板珠粒的數(shù)目極大地超過N，那么補替抽樣法可接近，并且由獨特條形碼編條形碼的樣品的數(shù)目U遵循二項式分布并且如下給出：其中k＝1，并且p＝1/N。未用獨特條形碼編條形碼的樣品(并且因此具有兩種或更多種彼此締合的樣品)的分?jǐn)?shù)如下給出：1-U/nN、n和未用獨特條形碼編條形碼的樣品的分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系在表1中給出。表1.未用獨特條形碼編條形碼的樣品的分?jǐn)?shù)如可見，如果N＝10n，那么>90％的樣品將用獨特條形碼編條形碼。用獨特條形碼集合U集合(在集合中具有x個條形碼)編條形碼的樣品的數(shù)目也遵循二項式分布，并且可被視為具有種獨特條形碼組合的條形碼文庫(N假定為充分大，使得組合基本上無重復(fù))，其中nx個條形碼用于對n種樣品編條形碼并且如下給出：其中k＝1，并且未用獨特條形碼編條形碼的樣品(并且因此具有兩種或更多種彼此締合的樣品)的分?jǐn)?shù)如下給出：1-U集合/nN、n、x和未用獨特條形碼編條形碼的樣品的分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系在表2和3中給出。表2.當(dāng)x＝2時，未用獨特條形碼集合編條形碼的樣品的分?jǐn)?shù)表3.當(dāng)x＝3時，未用獨特條形碼集合編條形碼的樣品的分?jǐn)?shù)如可見，當(dāng)使用獨特條形碼集合來代替獨特條形碼時，需要條形碼銜接文庫中少得多的獨特條形碼來對類似數(shù)目的樣品編條形碼，使得大多數(shù)樣品可用獨特條形碼集合鑒別。I.方法A.制造所關(guān)注的聚核苷酸在一些方面，本發(fā)明提供用于制造一種或多種所關(guān)注的聚核苷酸的方法。所述聚核苷酸可為編條形碼核酸，例如含有條形碼的cDNA或DNA擴(kuò)增子，其中共同條形碼或條形碼集合指示一組聚核苷酸源于相同樣品。根據(jù)所述方法，如下文所述獲得多種與一種或多種樣品締合的RNA。與各樣品締合的所述RNA存在于獨立反應(yīng)容積中。銜接分子接著添加至與各樣品締合的所述RNA中以將條形碼序列并入一種或多種源于所述RNA的聚核苷酸中。為了最大化編條形碼反應(yīng)動力學(xué)，所述條形碼銜接子優(yōu)選地在其添加至所述RNA中之前或同時以游離形式處于溶液中。添加所述條形碼銜接子可通過吸移，通過將一種反應(yīng)容積傾入另一種中，或通過合并兩種或更多種反應(yīng)容積來實現(xiàn)。例如，所述條形碼銜接子可在一種反應(yīng)容積中產(chǎn)生和/或封裝，所述反應(yīng)容積可接著與含有與一種樣品締合的RNA的另一反應(yīng)容積組合(圖5A-C)。在一些實施方案中，添加至來自樣品的RNA中的條形碼銜接子在其中存在所述RNA的反應(yīng)容積中原位產(chǎn)生。在一些實施方案中，條形碼銜接子由條形碼銜接模板酶法產(chǎn)生。條形碼銜接模板可為含有條形碼序列的雙鏈DNA分子，以及其它序列區(qū)域以促進(jìn)條形碼銜接子的產(chǎn)生和核酸的后續(xù)編條形碼(圖1)。條形碼銜接模板可使用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)制備。在一些實施方案中，條形碼銜接模板包括用于RNA聚合酶(RNAP)的啟動子，如T7、T3或SP6啟動子。RNA條形碼銜接子可接著通過使模板分子與適當(dāng)RNAP接觸并且使體外轉(zhuǎn)錄發(fā)生而產(chǎn)生(圖2A)。在一些實施方案中，條形碼銜接模板包括切口核酸內(nèi)切酶限制位點，如Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI或Nt.BsmAI位點。DNA條形碼銜接子可由所述模板通過使所述模板與對所述限制位點具特異性的切口核酸內(nèi)切酶接觸并且接著使所述模板暴露于鏈置換DNA聚合酶而產(chǎn)生(圖2B)。合適鏈置換DNA聚合酶的實例包括Klenowexo-片段、Bst大片段和其工程改造的變體。一般來說，條形碼銜接子由條形碼銜接模板通過使所述模板與一種或多種酶接觸而產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述酶反應(yīng)為等溫反應(yīng)。條形碼銜接模板在其用于產(chǎn)生條形碼銜接子時可以游離形式處于溶液中，或其可結(jié)合于固體支撐物?？捎糜诒景l(fā)明方法和組合物的實施方案中的固體支撐物的實例包括珠粒、色譜樹脂、多孔板、微量離心管或具有固體表面的其它物體。條形碼銜接模板可使用任何所需機制或捕獲化學(xué)，例如生物素-抗生物素蛋白、生物素-抗生蛋白鏈菌素或金-硫醇相互作用結(jié)合于固體支撐物。在一些實施方案中，與條形碼銜接模板連接的任何固體支撐物均與水溶液接觸，并且由所述模板產(chǎn)生的條形碼銜接分子在其產(chǎn)生時釋放至這一溶液中(圖6A、6B、7A-D)。所述水溶液可與待添加所述條形碼銜接分子的樣品所締合的RNA分子處于相同反應(yīng)容積中。也就是說，所述條形碼銜接分子可原位產(chǎn)生用于所述編條形碼反應(yīng)。或者，與用于條形碼銜接模板的固體支撐物接觸的水溶液可容納于不同于靶標(biāo)RNA的反應(yīng)容積中，并且由所述模板產(chǎn)生的條形碼銜接子可在組合所述兩種反應(yīng)容積后添加至這些RNA中。在一些實施方案中，條形碼銜接子通過自固體支撐物裂解條形碼銜接模板而產(chǎn)生(圖7B和7D)。模板分子可含有核酸內(nèi)切酶限制位點，所述位點促進(jìn)所述模板分子在暴露于適當(dāng)酶(例如，限制核酸內(nèi)切酶)后裂解。在所述裂解后釋放至溶液中的核酸分子可用作條形碼銜接子并且直接參與編條形碼反應(yīng)，或可經(jīng)受進(jìn)一步酶反應(yīng)(例如體外轉(zhuǎn)錄)以產(chǎn)生銜接分子。無論條形碼銜接分子如何產(chǎn)生，可制備這些分子的文庫以對來自多種樣品的核酸編條形碼。銜接分子可分離至不同反應(yīng)容積中，使得各反應(yīng)容積含有例如平均一種銜接分子?；蛘?，各反應(yīng)容積可含有銜接分子的多個拷貝，其中各拷貝含有相同條形碼序列。所述反應(yīng)容積可為微流體液滴或可封入微量離心管或其它容器中。除條形碼序列外，條形碼銜接分子還可包括通用引發(fā)序列或通用引發(fā)區(qū)和結(jié)合位點，如下文在“組合物”中描述。所述銜接分子還可包括獨特分子識別符(UMI)序列。在一些實施方案中，UMI序列含有隨機化核苷酸并且與所述條形碼序列無關(guān)并入所述條形碼銜接子(或產(chǎn)生所述銜接子的條形碼銜接模板)中。因此，含有相同條形碼序列的條形碼銜接分子的集合可含有不同UMI序列。在其中所述含有相同條形碼序列但含有不同UMI序列的條形碼銜接分子的集合添加至所述與一種樣品締合的RNA中的實施方案中，每一個RNA序列均可在編條形碼期間連接于不同UMI序列。制備具有UMI序列的條形碼銜接模板珠粒的方法公開于下文實施例12和13中，其中各珠粒上的模板分子含有相同條形碼序列和不同UMI序列的文庫。條形碼銜接子可為RNA或DNA分子，或RNA-DNA雜合物。例如，銜接子可包括在共同寡核苷酸鏈中共價連接于DNA核苷酸的RNA核苷酸。條形碼銜接子也可為單鏈或雙鏈的。如果為雙鏈的，那么所述條形碼銜接子可具有一個或多個鈍端或具有單鏈懸垂物的末端。在一些實施方案中，所述條形碼銜接子為單鏈DNA分子并且充當(dāng)反轉(zhuǎn)錄的引物。所述條形碼銜接子可使用DNA聚合酶(DNAP)產(chǎn)生。此處，所述條形碼銜接子的結(jié)合位點為RNA結(jié)合位點(例如mRNA結(jié)合位點)并且含有與一種或多種RNA中的序列區(qū)互補的序列區(qū)。在一些實施方案中，所述結(jié)合位點與添加所述條形碼銜接子的樣品中的所有RNA所共有的序列區(qū)互補。例如，所述結(jié)合位點可為聚T區(qū)，其與真核生物mRNA的聚-A尾互補(圖8)。或者或另外，所述結(jié)合位點可包括隨機序列區(qū)(圖9)。在添加所述條形碼銜接子至與樣品締合的所述RNA中之后，可發(fā)生反轉(zhuǎn)錄并且可合成cDNA的第一鏈，使得所述條形碼序列并入所述cDNA的第一鏈中。應(yīng)認(rèn)識到，反轉(zhuǎn)錄需要適當(dāng)條件，例如適當(dāng)緩沖液和反轉(zhuǎn)錄酶的存在，和適用于使所述條形碼銜接子退火至RNA的溫度和所述酶的活性。還應(yīng)認(rèn)識到，涉及DNA引物和RNA模板的反轉(zhuǎn)錄在所述引物的3’端與所述模板互補并且可直接退火至所述模板時最有效。相應(yīng)地，可設(shè)計所述條形碼銜接子使得所述結(jié)合位點出現(xiàn)于所述銜接分子的3’端。當(dāng)所述條形碼銜接子用作反轉(zhuǎn)錄中第一鏈cDNA合成的引物時，并且在涉及反轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明方法的其它實施方案(下文所述)中，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可發(fā)生在其中產(chǎn)生所述條形碼銜接子的相同反應(yīng)容積中。因此，在所述條形碼銜接子產(chǎn)生時，所述條形碼銜接子可添加至樣品或與樣品締合的所述RNA中。例如，微流體液滴可含有與條形碼銜接模板結(jié)合的珠粒，和細(xì)胞(圖10)。如果一種或多種酶也存在于所述液滴中，如切口核酸內(nèi)切酶、鏈置換DNA聚合酶或RNA聚合酶，那么可產(chǎn)生條形碼銜接分子。如果溶解試劑存在于所述液滴中以從所述細(xì)胞釋放RNA，并且如果存在反轉(zhuǎn)錄酶、引物和其它適當(dāng)試劑，那么可接著發(fā)生反轉(zhuǎn)錄。用于產(chǎn)生條形碼銜接子并且促進(jìn)溶解和反轉(zhuǎn)錄的酶和試劑可例如通過合并含有所述酶和試劑的液滴與含有所述珠粒和細(xì)胞的液滴同時添加至所述液滴中，或可分步添加。在本發(fā)明方法的一些實施方案中，與各樣品締合的所述RNA反轉(zhuǎn)錄，但所述條形碼銜接子并未引發(fā)第一鏈cDNA合成。相反，使用含有聚T區(qū)、隨機序列或其它RNA結(jié)合位點的標(biāo)準(zhǔn)DNA引物。在這些實施方案中，所述條形碼銜接子可在其中發(fā)生第一鏈cDNA合成的相同隔室或反應(yīng)容積中產(chǎn)生。在這種情況下，在反應(yīng)容積中包括具有在約8.0至8.8的pH下的Tris、鉀離子、氯離子、硫酸根離子、銨離子、乙酸離子和/或鎂離子的緩沖液可為有益的。或者，可產(chǎn)生所述條形碼銜接子并且可在不同隔室中發(fā)生第一鏈cDNA合成，在所述情況下所述隔室必要時可在第一鏈cDNA合成之前或之后組合。所述隔室也可在所述條形碼銜接子產(chǎn)生之前或之后組合。關(guān)于進(jìn)行酶反應(yīng)并且組合隔室的不同可能性提供優(yōu)化反應(yīng)條件的靈活性。然而，無論所述條形碼銜接子如何添加至與樣品締合的所述RNA中，所述條形碼銜接子可在第一鏈cDNA合成期間或之后立即參與酶編條形碼反應(yīng)。如上文所述，本發(fā)明方法可使用反轉(zhuǎn)錄酶(例如MMLVH-反轉(zhuǎn)錄酶)，所述反轉(zhuǎn)錄酶在到達(dá)模板RNA的5’端后添加一個或多個非模板化核苷酸(如C)至新生cDNA鏈的末端。這些核苷酸在RNA/DNA雙鏈體的一個末端形成3’DNA懸垂物。如果第二RNA分子含有與所述非模板化核苷酸互補的序列區(qū)(例如在其3’端的聚鳥嘌呤區(qū))，并且結(jié)合于所述非模板化核苷酸，那么所述反轉(zhuǎn)錄酶可轉(zhuǎn)換模板并且繼續(xù)延伸cDNA，現(xiàn)在是用所述第二RNA分子作為模板。所述第二RNA分子在本文中稱作并且在所屬領(lǐng)域中已知為模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸。在本發(fā)明方法的實施方案中，所述條形碼銜接子充當(dāng)用于反轉(zhuǎn)錄的模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(圖3)。因此，所述條形碼序列在模板轉(zhuǎn)換后并入cDNA的第一鏈中，并且存在于由所述cDNA的第一鏈的擴(kuò)增(例如，通過PCR)產(chǎn)生的DNA分子中。在這些實施方案中，可使用具有模板轉(zhuǎn)換活性的任何反轉(zhuǎn)錄酶。所述條形碼銜接子的結(jié)合位點為cDNA結(jié)合位點并且優(yōu)選地出現(xiàn)于所述銜接分子的3’端。所述結(jié)合位點可包括鳥嘌呤區(qū)(包含一個或多個G核苷酸)，或至少部分地與通過所述反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的3’懸垂物的序列互補的任何其它序列。應(yīng)認(rèn)識到所述懸垂物序列和因此用于所述條形碼銜接子的結(jié)合位點的適當(dāng)序列可取決于用于所述方法的反轉(zhuǎn)錄酶的選擇。在其它實施方案中，與各樣品締合的所述RNA反轉(zhuǎn)錄，但條形碼序列根本未并入cDNA的第一鏈中。也就是說，所述條形碼銜接子并未充當(dāng)用于第一鏈cDNA合成的引物或鏈轉(zhuǎn)換寡核苷酸。更確切地說，所述條形碼銜接子充當(dāng)用于所述cDNA的第一鏈或其互補序列的PCR擴(kuò)增的引物。在這些實施方案中，所述cDNA使用正向引物和反向引物擴(kuò)增，其中所述反向引物具有與用于第一鏈cDNA合成的引物的至少一部分相同的序列。所述條形碼銜接子可為正向引物或反向引物，并且為單鏈DNA寡核苷酸。當(dāng)所述條形碼銜接子為正向引物時，其可退火至在鏈轉(zhuǎn)換后由所述cDNA的延伸產(chǎn)生的第一鏈cDNA(或其互補序列)的一部分(圖11)?；蛘?，所述條形碼銜接子可退火至在來自樣品的RNA上模板化的第一鏈cDNA的一部分。因此，模板轉(zhuǎn)換和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸添加至用于樣品的反應(yīng)容積中無需發(fā)生來進(jìn)行本發(fā)明的這些實施方案。當(dāng)所述條形碼銜接子為反向引物時，其可結(jié)合用于第一鏈cDNA合成的任何引物使用，所述引物包括包括隨機序列的引物(圖12和13)。本發(fā)明的方法可用任何所需樣品實施。在一些實施方案中，各樣品包括細(xì)胞，并且可為例如單細(xì)胞。細(xì)胞可封入如微流體液滴的反應(yīng)容積中，并且必要時可溶解以釋放RNA分子至所述反應(yīng)容積中。為此，所述細(xì)胞可在任何便利時間與溶解緩沖液接觸。所述細(xì)胞可為B細(xì)胞，例如成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞，或任何其它種類的細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可在溶解之前有利地懸浮于包含滲透保護(hù)劑的細(xì)胞懸浮緩沖液中。所述滲透保護(hù)劑可保護(hù)所述細(xì)胞免于滲透性應(yīng)激并且確保細(xì)胞生理學(xué)在編條形碼之前保持穩(wěn)定或未受擾。在一些實施方案中，細(xì)胞連同條形碼銜接分子和/或條形碼銜接模板懸浮于所述細(xì)胞懸浮緩沖液中。在一些實施方案中，細(xì)胞在與用于反轉(zhuǎn)錄、PCR和/或溶解的試劑接觸之前懸浮于所述細(xì)胞懸浮緩沖液中。所述細(xì)胞懸浮緩沖液可包括于任何反應(yīng)容積中并且可與本文中關(guān)于形成和組合水性反應(yīng)容積所述的方法相容。在一些實施方案中，所述細(xì)胞懸浮緩沖液中的滲透保護(hù)劑為甜菜堿或其密切結(jié)構(gòu)類似物。甜菜堿和密切結(jié)構(gòu)類似物的實例包括甘氨酸甜菜堿(還稱為N,N,N-三甲基甘氨酸)、脯氨酸甜菜堿(還稱為水蘇堿)、β-丙氨酸甜菜堿、四氫嘧啶、膽堿-O-硫酸、葫蘆巴堿、二甲基巰基丙酸(DMSP)和二甲基噻亭。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為甘氨酸甜菜堿。除了充當(dāng)滲透保護(hù)劑以外，甜菜堿還已經(jīng)顯示減少PCR中二級結(jié)構(gòu)的形成并且改進(jìn)擴(kuò)增的特異性。甜菜堿包括于本發(fā)明方法中可因此為一般有益的。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為糖或多元醇，如海藻糖。其它適用的糖或多元醇包括蔗糖、果糖、棉子糖、甘露醇和肌醇。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑為氨基酸，如脯氨酸。單一滲透保護(hù)劑可包括于所述細(xì)胞懸浮緩沖液中，或可組合包括多種滲透保護(hù)劑。各滲透保護(hù)劑可以任何適用濃度存在。在一些實施方案中，所述細(xì)胞懸浮緩沖液的摩爾滲透壓濃度為約250-350mOsm/L。在一些實施方案中，所述滲透保護(hù)劑貢獻(xiàn)所述緩沖液的所述摩爾滲透壓濃度的多達(dá)10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。本文中使用的示例性細(xì)胞懸浮緩沖液(參看例如實施例7-9、11和14)包括約230-330mM甜菜堿和約10mMNaCl。在其中各樣品包括至少一種細(xì)胞的實施方案中，與所述樣品締合的所述RNA可包括mRNA。所述樣品可包括例如至少1、3、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000種mRNA分子，其可代表多種基因、等位基因、閱讀框或相異序列。在一些實施方案中，與所述樣品締合的所述RNA包括來自所述樣品的所有mRNA、所述細(xì)胞的完全或部分轉(zhuǎn)錄組或來自所述細(xì)胞的總RNA。應(yīng)認(rèn)識到可對每種樣品更多RNA編條形碼并且如果更多條形碼銜接分子可遞送至用于各樣品的反應(yīng)容積，那么可制造更多所關(guān)注的聚核苷酸。然而，不受任何理論束縛，本發(fā)明方法不限制每種樣品可編條形碼的RNA的數(shù)目。相應(yīng)地，每種樣品制造的所關(guān)注的聚核苷酸的數(shù)目可為至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000。各所關(guān)注的聚核苷酸可存在于多個拷貝中。此外，可在所述方法的一種實施中編條形碼的細(xì)胞或樣品的數(shù)目僅受制備多種具有獨特條形碼序列的條形碼銜接模板的挑戰(zhàn)(上文討論)限制。在一些實施方案中，所述一種或多種樣品包括至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000個細(xì)胞。樣品(例如，各自為單細(xì)胞)可獲自相同受試者或不同受試者。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個不同受試者可提供樣品。本發(fā)明方法也可用于使用核酸標(biāo)記物查詢用于所關(guān)注的表型的細(xì)胞群體。所述核酸標(biāo)記物包括連接于結(jié)合劑的核酸，其可特異性結(jié)合于來自提供或不提供所述表型的群體的細(xì)胞的子集。例如，所述結(jié)合劑可結(jié)合于某些蛋白、糖蛋白、糖脂或存在于一些細(xì)胞的表面上的其它部分。在一些實施方案中，所述結(jié)合劑為分子標(biāo)記，如抗體、抗原或蛋白(圖14A-C)。在一些實施方案中，所述結(jié)合劑為肽-MHC復(fù)合物。所述核酸可使用非共價捕獲部分共價連接于所述結(jié)合劑，或在其它情況下如所需。為了查詢用于所述表型的細(xì)胞，使細(xì)胞與所述核酸標(biāo)記物接觸并且接著洗滌。因此，所述核酸標(biāo)記物僅保留于與所述結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞上。所述細(xì)胞可接著封入反應(yīng)容積中并且如上文所述溶解，使得可對所述細(xì)胞中的RNA編條形碼。在編條形碼反應(yīng)期間，也對所述核酸標(biāo)記物的核酸編條形碼，使得所述標(biāo)記物序列出現(xiàn)于針對保留所述標(biāo)記物的細(xì)胞的RNA或擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)中。在一些實施方案中，所述核酸標(biāo)記物的核酸為具有所述群體的細(xì)胞的非內(nèi)源性序列的RNA分子。在一些實施方案中，所述核酸為包含RNAP啟動子的雙鏈DNA分子。因此，所述核酸在與所述細(xì)胞(或其溶解產(chǎn)物)相同的反應(yīng)容積中時可轉(zhuǎn)錄，并且所得RNA分子可連同來自所述細(xì)胞的RNA一起編條形碼。細(xì)胞可針對多種表型使用多種核酸標(biāo)記物來查詢，各核酸標(biāo)記物包括連接于不同核酸序列的不同結(jié)合劑。例如，細(xì)胞可與第一核酸標(biāo)記物和第二核酸標(biāo)記物接觸，其中各核酸標(biāo)記物包括連接于核酸的分子標(biāo)記。所述兩種核酸標(biāo)記物的分子標(biāo)記可彼此不同(例如，為不同蛋白或?qū)Σ煌?xì)胞表面部分具有親和力)。連接于這些分子標(biāo)記的核酸可含有全部或部分地彼此不同的序列。細(xì)胞可同時或依序與兩種或更多種核酸標(biāo)記物接觸。作為進(jìn)一步實例，三個抗體可連接于不同的非內(nèi)源性RNA序列，并且關(guān)于用這些抗體處理的細(xì)胞的編條形碼測序數(shù)據(jù)可披露各細(xì)胞是否提供針對所述抗體中的無一者、一些或全部的靶標(biāo)。編條形碼擴(kuò)增子的拷貝數(shù)也可逐步披露表型，例如不同細(xì)胞上的細(xì)胞表面部分的相對豐度，其中所述部分由所述核酸標(biāo)記物靶向。B.連接聚核苷酸至固體支撐物本發(fā)明的另一方面提供用于使聚核苷酸連接于固體支撐物的方法，其中所述聚核苷酸含有條形碼序列。所述聚核苷酸可為條形碼銜接模板或所述模板的前體。所述聚核苷酸可因此如上文所述用于酶法產(chǎn)生條形碼銜接子并且將所述條形碼序列并入源于RNA的擴(kuò)增子中。在一些實施方案中，所述方法涉及產(chǎn)生反相乳液的親水性隔室(即，水性液滴)。所述隔室可如所需例如通過將水溶液混入疏水性載液中并且任選地攪動所述混合物來產(chǎn)生。所述水溶液可具有固體支撐物、寡核苷酸和懸浮于其中的試劑，使得當(dāng)形成所述隔室時，各隔室含有用于使所述聚核苷酸連接于所述固體支撐物的所有必需組分。在這些實施方案中，在添加所述固體支撐物至所述隔室中之前，寡核苷酸經(jīng)由捕獲部分結(jié)合于所述固體支撐物的表面。這種寡核苷酸在本文中稱作“結(jié)合的寡核苷酸”并且含有與條形碼寡核苷酸的3’序列互補的3’序列。所述聚核苷酸因此通過聚合酶延伸反應(yīng)在所述固體支撐物上形成，所述反應(yīng)涉及所述結(jié)合的寡核苷酸和條形碼寡核苷酸，并且這種反應(yīng)發(fā)生在所述隔室內(nèi)。在優(yōu)選實施方案中，當(dāng)形成所述親水性隔室時，所述條形碼寡核苷酸以低或限制濃度存在(例如，每個隔室一個分子)。當(dāng)具有隨機化序列的條形碼寡核苷酸的文庫用于制備多種條形碼模板珠粒時，這種濃度是有利的。如果假定每一種條形碼寡核苷酸具有不同條形碼序列，并且各隔室中的固體支撐物需要僅具有一種條形碼序列，那么每個隔室可存在一種條形碼寡核苷酸(至多或平均)。一旦滿足這種條件，多種固體支撐物(例如多種珠粒)可存在于隔室中，或者所述結(jié)合的寡核苷酸的多個拷貝可結(jié)合于各固體支撐物，但由所述隔室中的聚合酶延伸反應(yīng)產(chǎn)生的所有聚核苷酸均將含有相同的條形碼序列。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選固體支撐物為珠粒，例如由金屬和/或聚合物質(zhì)制得并且具有在約0.1至10微米范圍內(nèi)的直徑的球形珠粒。具有其它特征的珠粒可替代或另外使用。所述固體支撐物可用捕獲部分官能化以連接所述結(jié)合的寡核苷酸至所述表面(圖15，左側(cè))。捕獲部分的實例包括抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、生物素、羧基、環(huán)氧基、羥基、硫醇基和金。一些捕獲部分具有與其特異性地并且非共價地結(jié)合的結(jié)合搭配物。例如，抗生蛋白鏈菌素采用生物素作為其結(jié)合搭配物。所述捕獲部分可直接地(例如共價地)偶聯(lián)于所述固體支撐物，并且所述結(jié)合搭配物可偶聯(lián)于所述結(jié)合的寡核苷酸，或反之亦然，使得所述結(jié)合的寡核苷酸通過非共價相互作用結(jié)合于所述固體支撐物。其它捕獲部分提供所述結(jié)合的寡核苷酸與固體支撐物之間的直接共價連接。所述結(jié)合的寡核苷酸優(yōu)選地為在其5’端結(jié)合于所述固體支撐物的單鏈DNA分子。因此，所述結(jié)合的寡核苷酸的3’端以游離形式處于溶液中并且當(dāng)雜交至所述條形碼寡核苷酸時，可通過如DNA聚合酶的酶延伸。所述延伸反應(yīng)使用所述條形碼寡核苷酸模板化，使得所述條形碼序列并入結(jié)合于所述珠粒的DNA鏈中。必要時，所述結(jié)合的寡核苷酸和/或所述條形碼寡核苷酸可具有設(shè)計成使分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)最小化的序列。所述條形碼寡核苷酸可含有上文討論的序列區(qū)，如通用引發(fā)序列和/或結(jié)合位點。在用所述結(jié)合的寡核苷酸和所述條形碼寡核苷酸執(zhí)行引物延伸反應(yīng)后，這些序列區(qū)將并入結(jié)合于所述固體支撐物的聚核苷酸中。如果所述聚核苷酸隨后用作條形碼銜接模板，那么所述序列區(qū)也將存在于由所述模板產(chǎn)生的條形碼銜接分子中。如RNAP啟動子和/或切口核酸內(nèi)切酶限制位點的其它序列可包括于所述條形碼寡核苷酸中以促進(jìn)條形碼銜接分子的酶制造。所述RNAP啟動子可選自由T7、T3和SP6啟動子組成的組。所述切口核酸內(nèi)切酶限制位點可選自由Nt.BbvCI、Nt.BspQI、Nt.BsmAI、Nt.BstNBI、Nt.AlwI和Nt.BsmAI位點組成的組。所述條形碼寡核苷酸內(nèi)的結(jié)合位點可含有一個或多個G核苷酸。在一些實施方案中，所述條形碼序列和其它序列區(qū)使用PCR并入連接于固體支撐物的所述結(jié)合的寡核苷酸和/或所述聚核苷酸中(圖15，右側(cè))。在這些實施方案中，所述條形碼寡核苷酸充當(dāng)PCR的模板，并且所述結(jié)合的寡核苷酸充當(dāng)引物，其中所述結(jié)合的寡核苷酸的酶延伸從其3’端進(jìn)行。所述條形碼寡核苷酸還包括與PCR反向引物序列同一或互補的5’序列。因此，反向引物可退火至所述條形碼寡核苷酸(或其互補序列)的5’端并且引物延伸沿與所述結(jié)合的寡核苷酸的方向相對的方向。必要時，這種反向引物可經(jīng)熒光團(tuán)標(biāo)記，使得通過PCR產(chǎn)生并且連接于所述固體支撐物的聚核苷酸為熒光性的。所述標(biāo)記可用于確定固體支撐物(例如珠粒)是否已經(jīng)成功地連接于包括所述條形碼序列的聚核苷酸。上述方法可在單一步驟中執(zhí)行。在本發(fā)明方法的其它實施方案中，含有條形碼序列的聚核苷酸在多個步驟中連接于固體支撐物。在這些實施方案中，所述條形碼序列由例如S1x、W和S2y區(qū)的數(shù)個序列區(qū)構(gòu)成。這些序列區(qū)可作為兩種或更多種條形碼寡核苷酸的一部分引入所述聚核苷酸中，其中各條形碼寡核苷酸用于獨立步驟或酶反應(yīng)中。在由所述獨立步驟產(chǎn)生的聚核苷酸中，所述S1x、W和S2y區(qū)不必定為鄰接的。各種S1x、W和S2y序列可組合于不同固體支撐物上以形成不同條形碼序列或條形碼序列的文庫。為了在多個步驟中連接聚核苷酸至固體支撐物(其中所述聚核苷酸含有條形碼序列)，如上文所述提供固體支撐物和結(jié)合于所述固體支撐物的寡核苷酸。所述固體支撐物和結(jié)合的寡核苷酸可提供于乳液的親水性隔室中，或任何其它所需反應(yīng)容積中。還提供第一條形碼寡核苷酸(圖16，頂部和中間)。所述結(jié)合的寡核苷酸包含S1x序列和與所述第一條形碼寡核苷酸的3’序列互補的序列。所述第一條形碼寡核苷酸包含W序列。在所述多步驟程序的第一步驟中，執(zhí)行聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)以將所述W序列并入所述結(jié)合的寡核苷酸中。因此，在這一步驟后，所述S1x序列和W序列存在于結(jié)合于所述固體支撐物的相同核酸鏈中。如果使用延伸反應(yīng)，那么如上文關(guān)于單一步驟程序所討論，所述結(jié)合的寡核苷酸可充當(dāng)引物并且所述第一條形碼寡核苷酸可充當(dāng)模板，使得所述結(jié)合的寡核苷酸從其3’端延伸。在一些實施方案中，所述第一條形碼寡核苷酸中與所述結(jié)合的寡核苷酸中的S1x序列互補的部分含有肌苷區(qū)。隨后，提供第二條形碼寡核苷酸以將S2y序列并入所述結(jié)合的寡核苷酸中(圖16，底部)。所述第二條形碼寡核苷酸包含所述S2y序列，以及與由所述多步驟程序的第一步驟產(chǎn)生的所述結(jié)合的寡核苷酸的3’端互補的3’序列。因此，所述第二條形碼寡核苷酸可包括與所述第一條形碼寡核苷酸的一部分互補或同一的序列區(qū)。所述第二條形碼寡核苷酸通過聚合酶延伸反應(yīng)或接合反應(yīng)與所述結(jié)合的寡核苷酸(現(xiàn)在延伸以包括所述S1x序列和所述W序列)反應(yīng)。在這一步驟后，所述S1x、W和S2y序列均存在于結(jié)合于所述固體支撐物的相同核酸鏈中。如所需，相同或不同反應(yīng)條件可用于多步驟程序的第一和第二步驟中以連接聚核苷酸至固體支撐物。例如，相同的酶(例如DNA聚合酶)或不同酶(例如DNA聚合酶和連接酶)可用于所述第一條形碼寡核苷酸和第二條形碼寡核苷酸的反應(yīng)中，不過使用相同的酶可更有效。為了混合試劑和所述固體支撐物用于連續(xù)步驟，試劑可分配至反應(yīng)容積中，并且反應(yīng)容積可分裂、組合或以其它方式處理，均如所需。例如，所述固體支撐物和結(jié)合的寡核苷酸可分布至多個反應(yīng)容積中，并且不同的第一條形碼寡核苷酸可添加至各反應(yīng)容積中，使得不同的W序列偶聯(lián)于相同S1x序列。這些反應(yīng)容積各自可又分成更多的用于添加所述第二條形碼寡核苷酸的容積，使得多個S2y序列偶聯(lián)于各W序列。在一些實施方案中，洗滌固體支撐物以去除未結(jié)合的寡核苷酸。在一些實施方案中，在將所述W序列并入所述結(jié)合的寡核苷酸中之后加熱固體支撐物，以熔融所述結(jié)合的寡核苷酸和第一條形碼寡核苷酸的雙鏈體，并且使所述結(jié)合的寡核苷酸和第二條形碼寡核苷酸退火?？砂ㄓ跅l形碼銜接分子和/或條形碼銜接模板中的序列區(qū)(如通用引發(fā)序列、結(jié)合位點、RNAP啟動子或切口核酸內(nèi)切酶限制位點)可如所需分布于所述第一條形碼寡核苷酸與所述第二條形碼寡核苷酸之間。例如，所有所述序列可包括于一種條形碼寡核苷酸中，或一些可包括于一種條形碼寡核苷酸中并且一些可包括于其它條形碼寡核苷酸中。在一些實施方案中，選擇的條形碼寡核苷酸進(jìn)一步包含通用引發(fā)序列和結(jié)合位點，所述選擇的條形碼寡核苷酸為所述第一條形碼寡核苷酸或所述第二條形碼寡核苷酸。在一些實施方案中，這種選擇的條形碼寡核苷酸還包含RNAP啟動子或切口核酸內(nèi)切酶限制位點。應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明方法提供用于將不同序列區(qū)并入條形碼銜接模板中的多種選項。這些模板和用于制備所述模板的寡核苷酸的最佳設(shè)計可取決于用于酶法產(chǎn)生條形碼銜接分子和對RNA編條形碼的機制。本文關(guān)于連接聚核苷酸至固體支撐物所述的方法中的任一者均可用于制備一種或多種用于對樣品、細(xì)胞或RNA編條形碼的固體支撐物。連接于各固體支撐物的聚核苷酸包括條形碼序列并且可充當(dāng)條形碼銜接模板。本發(fā)明方法還可用于制備條形碼文庫，所述文庫包括多種固體支撐物，各固體支撐物與條形碼序列締合。任何兩種固體支撐物(例如珠粒)可具有完全或部分地彼此不同的條形碼序列。在一些實施方案中，所述條形碼文庫中的每一種固體支撐物與不同條形碼序列締合。根據(jù)本發(fā)明方法制備的條形碼銜接模板珠粒包括結(jié)合于條形碼銜接模板的珠粒。所述珠?？山Y(jié)合于所述模板分子的多個拷貝，例如至少10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000、100,000、300,000或1,000,000個拷貝。在一些實施方案中，結(jié)合于一種珠粒的模板分子的各拷貝包括相同條形碼序列。在其中所述模板分子具有形式S1x-W-S2y的條形碼序列的實施方案中，結(jié)合于一種珠粒的模板分子的各拷貝包括相同S1x、W和/或S2y序列。本發(fā)明方法還允許制備包含多種條形碼銜接模板珠粒的珠粒條形碼文庫。所述文庫中的每一種珠粒可與不同條形碼序列締合，并且各珠粒上的條形碼銜接模板的拷貝可包含相同條形碼序列。在一些實施方案中，本發(fā)明方法可用于通過在條形碼銜接模板珠粒上以物理方式捕獲由一種或多種樣品(例如細(xì)胞)制備或獲得的cDNA來制備聚核苷酸文庫。各珠粒包括在3’端具有cDNA結(jié)合位點的模板分子。所述珠?？膳c酶接觸以使所述結(jié)合位點為單鏈的(例如，在以游離形式處于溶液中的模板分子的末端留下3’懸垂物)。所述珠粒接著與來自樣品的一種或多種cDNA接觸，使得所述cDNA通過所述結(jié)合位點結(jié)合于所述模板分子的拷貝。在優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合位點包括一個或多個G核苷酸(例如聚G區(qū))，并且與通過反轉(zhuǎn)錄酶添加至cDNA的末端的非模板化聚C區(qū)互補。聚核苷酸文庫中的珠?？扇缢枋褂茫缫詫碜远喾N樣品的cDNA測序或分離來自不同樣品的cDNA。在后一種情況下，對應(yīng)于不同樣品的珠?？墒褂秒x心或磁性沉淀，并且接著使用標(biāo)準(zhǔn)方法再懸浮和分離。必要時，在cDNA結(jié)合于珠粒上的模板分子后，所述模板分子可酶法延伸，由此將cDNA序列并入結(jié)合所述珠粒的DNA雙鏈體中并且使這些序列與條形碼序列締合。如果來自樣品的cDNA分子的拷貝數(shù)可相當(dāng)于珠粒上的條形碼銜接模板的拷貝數(shù)，那么這些cDNA分子可被捕獲于少量珠粒(例如，每種樣品至多約1、3、10、30、100、300或1000個珠粒)上。來自樣品的RNA可使用標(biāo)準(zhǔn)方法或如上文所討論進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA。B細(xì)胞(例如成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞)可用作樣品，并且在一些實施方案中，所述cDNA為B細(xì)胞源性可變免疫球蛋白區(qū)。II.組合物A.聚核苷酸在一些方面，聚核苷酸可包括cDNA區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括樣品鑒別(條形碼)-銜接區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括樣品鑒別(條形碼)區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括銜接區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括通用引物區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括擴(kuò)增子區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括板鑒別區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第一板鑒別區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第二板鑒別區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括限制位點區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第一限制位點區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第二限制位點區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括測序區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第一測序區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括第二測序區(qū)。在一些方面，聚核苷酸可包括多種本文所述的任何區(qū)域。例如，聚核苷酸可包括第一樣品鑒別(條形碼)區(qū)和第二樣品鑒別(條形碼)區(qū)。在一些方面，所述第一樣品鑒別(條形碼)區(qū)和所述第二樣品鑒別(條形碼)區(qū)為同一或大致同一的。在一些方面，所述第一樣品鑒別(條形碼)區(qū)和所述第二樣品(條形碼)鑒別區(qū)為相異的。在一些方面，鑒別(條形碼)區(qū)偶聯(lián)于可變免疫球蛋白區(qū)。在一些方面，區(qū)域的序列將至少足夠長以充當(dāng)針對PCR反應(yīng)中的引物或探針的靶標(biāo)序列。在一些方面，區(qū)域可為1個至大于5000個堿基對長。例如，區(qū)域可為1-10,000個核苷酸長，例如2-30個核苷酸長，包括其間所有子范圍。作為非限制性實例，區(qū)域可為1-30個核苷酸、1-26個核苷酸、1-23個核苷酸、1-22個核苷酸、1-21個核苷酸、1-20個核苷酸、1-19個核苷酸、1-18個核苷酸、1-17個核苷酸、18-30個核苷酸、18-26個核苷酸、18-23個核苷酸、18-22個核苷酸、18-21個核苷酸、18-20個核苷酸、19-30個核苷酸、19-26個核苷酸、19-23個核苷酸、19-22個核苷酸、19-21個核苷酸、19-20個核苷酸、20-30個核苷酸、20-26個核苷酸、20-25個核苷酸、20-24個核苷酸、20-23個核苷酸、20-22個核苷酸、20-21個核苷酸、21-30個核苷酸、21-26個核苷酸、21-25個核苷酸、21-24個核苷酸、21-23個核苷酸或21-22個核苷酸。在一些方面，區(qū)域可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個核苷酸長。在一些方面，區(qū)域可為少于50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000或大于1000個核苷酸長。在一些方面，區(qū)域可為少于1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000、9000-10000或大于10000個核苷酸長。在一些方面，區(qū)域可包括本文所公開的聚核苷酸的至少兩個核酸、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個核苷酸。在一些方面，聚核苷酸可源于單一樣品或與單一樣品締合。在一些方面，區(qū)域可源于單一樣品或與單一樣品締合。在一些方面，cDNA區(qū)可源于單一樣品或與單一樣品締合。在一些方面，擴(kuò)增子區(qū)可源于單一樣品或與單一樣品締合?！皢我粯悠贰卑ò瑥膯我粊碓慈〉玫木酆塑账岬臉悠?。在一些方面，單一來源包括在特定時間點或在特定位置，例如在受試者或細(xì)胞燒瓶或細(xì)胞板中取得的樣品。在一些方面，第一單一樣品在第一時間點從第一受試者取得并且第二單一樣品在相異于所述第一時間點的第二時間點從所述第一受試者取得。在一些方面，第一單一樣品在第一位置從第一受試者取得并且第二樣品在相異于所述第一位置的第二位置從所述第一受試者取得。在一些方面，第一單一樣品在一個時間點從第一受試者取得并且第二單一樣品在一個時間點從第二受試者取得。在一些方面，第一單一樣品在一個位置從第一受試者取得并且第二樣品在一個位置從第二受試者取得。在一個實施方案中，樣品包含包括源于一種或多種B細(xì)胞的mRNA的聚核苷酸。在另一實施方案中，樣品包含包括源于一種或多種B細(xì)胞的cDNA的聚核苷酸。在另一實施方案中，單一樣品包含源于一種或多種B細(xì)胞的mRNA，所述細(xì)胞分選至96孔或384孔板的單一孔中。樣品一般源于原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)、真核細(xì)胞(例如哺乳動物和酵母細(xì)胞)或如病毒或噬菌體的遺傳物質(zhì)的其它來源。如本文所用的術(shù)語“哺乳動物(mammal)”或“哺乳動物(mammalian)”包括人類和非人類并且包括但不限于人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、鼠科動物、牛、馬和豬。在一些方面，本發(fā)明方法適用于具有至少96個孔、至少384個孔、至少1536個孔或更多孔的板中的單一樣品。在其它方面，本發(fā)明方法適用于各自具有至少96個孔的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、十個、十五個、二十個、三十個或更多個板中的單一樣品。在一些方面，5’銜接區(qū)序列和/或樣品鑒別區(qū)例如在RT期間添加至來自單一樣品的所有cDNA中并且不僅僅添加至Ig基因中。在一些方面，3’基因特異性引物(GSP)可用于擴(kuò)增所述單一樣品中的任何表達(dá)的基因。在一些方面，擴(kuò)增具有5’可變區(qū)的基因，例如T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體而無需多重簡并5’引物來擴(kuò)增所關(guān)注的基因。GSP可包括對IgG、IgM、IgD、IgA、IgE、TCR鏈和其它所關(guān)注的基因具有特異性的引物。在一些方面，也可例如使用巢式GSP執(zhí)行多輪PCR。關(guān)于所述巢式GSP，用于第二輪PCR的GSP相對于用于第一輪PCR的GSP的雜交位置沿其靶標(biāo)基因序列在位置5'與所述序列雜交。在一些方面，cDNA區(qū)或擴(kuò)增子區(qū)可包括DNA聚核苷酸。在一些方面，cDNA區(qū)或擴(kuò)增子區(qū)可包括cDNA聚核苷酸。在一些方面，cDNA區(qū)或擴(kuò)增子區(qū)可包括與DNA聚核苷酸雜交的RNA聚核苷酸。在一些方面，cDNA區(qū)或擴(kuò)增子區(qū)可包括與cDNA聚核苷酸雜交的mRNA聚核苷酸。在一些方面，通用引物區(qū)不完全與任何人類外顯子互補。在一些方面，通用引物區(qū)不完全與任何表達(dá)的人類基因互補。在一些方面，通用引物區(qū)具有最小二級結(jié)構(gòu)。在一些方面，擴(kuò)增子區(qū)包含免疫球蛋白重鏈擴(kuò)增子序列。在一些方面，擴(kuò)增子區(qū)包含免疫球蛋白輕鏈擴(kuò)增子序列。在一些方面，擴(kuò)增子區(qū)包含T細(xì)胞受體α擴(kuò)增子序列。在一些方面，擴(kuò)增子區(qū)包含T細(xì)胞受體β擴(kuò)增子序列。在一些方面，聚核苷酸存在于聚核苷酸文庫中并且可基于所述聚核苷酸的區(qū)域與存在于所述文庫中的其它聚核苷酸區(qū)別。在一些方面，源于第一單一樣品的文庫中的各聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列相異于源于一種或多種相異于所述第一單一樣品的樣品的文庫中的其它聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列。在一些方面，源于第一單一樣品的文庫中的各聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述第一單一樣品的樣品的文庫中的其它聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少1個核苷酸。在一些方面，源于第一單一樣品的文庫中的各聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述第一單一樣品的樣品的文庫中的其它聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個核苷酸。在一些方面，源于第一單一樣品的文庫中的各聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列可與源于一種或多種相異于所述第一單一樣品的樣品的文庫中的其它聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或少于100％同一。在一些方面，源于第一單一樣品的文庫中的各聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述第一單一樣品的樣品的文庫中的其它聚核苷酸的樣品鑒別區(qū)的序列少于100％同一。在一些方面，樣品鑒別區(qū)充當(dāng)由單一樣品反轉(zhuǎn)錄的所有第一鏈cDNA上的數(shù)字條形碼。在一些方面，所述樣品鑒別區(qū)為至少1個核苷酸長。在一些方面，樣品鑒別區(qū)可包含至少3個核苷酸，并且樣品鑒別區(qū)的彼此不同之處可在于至少1個核苷酸。在一個實施方案中，樣品鑒別區(qū)為3-15個核苷酸長并且彼此不同之處在于至少1個核苷酸。在一些方面，樣品鑒別區(qū)可包含至少64種變體(使用3個核苷酸長的樣品鑒別區(qū)，其中各樣品-ID彼此不同之處在于至少1個核苷酸)，或在一些方面更大數(shù)目的變體。在一些方面，連接3’至所述樣品鑒別區(qū)的序列可為包含至少1個G的銜接區(qū)。在一個優(yōu)選實施方案中，連接3’至所述樣品鑒別區(qū)的序列可為包含至少2個G的銜接區(qū)。在一個實施方案中，連接至樣品鑒別區(qū)的5’端的序列為通用引物序列，其可在PCR擴(kuò)增期間使用以避免對后續(xù)添加5’通用引物序列(通過接合或另一種方法)的需要或多重簡并5’引物來擴(kuò)增具有可變5’區(qū)的基因的使用。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列相異于源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少1個核苷酸。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個核苷酸。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列可與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或少于100％同一。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第一板鑒別區(qū)的序列少于100％同一。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列相異于源于一種或多種不同于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少1個核苷酸。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列的不同之處在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或更多個核苷酸。在一些方面，所述第二板鑒別區(qū)的序列與聚核苷酸上的所述第一板鑒別區(qū)的序列同一。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列可與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或少于100％同一。在一些方面，源于單一樣品的第一集合的文庫中的各聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列與源于一種或多種相異于所述單一樣品的第一集合的單一樣品集合的文庫中的其它聚核苷酸的第二板鑒別區(qū)的序列少于100％同一。在一些方面，板鑒別區(qū)(例如第一板鑒別區(qū)或第二板鑒別區(qū))可包含至少2個核苷酸，并且板鑒別區(qū)彼此不同之處在于至少1個核苷酸。在一個實施方案中，板鑒別區(qū)為2-10個核苷酸長并且彼此不同之處在于至少1個核苷酸。在一些方面，板鑒別區(qū)的使用僅在一些實施方案中發(fā)現(xiàn)，因為更大數(shù)目的不同樣品鑒別區(qū)(每種待分析的單一樣品一個)的使用可消除對板鑒別區(qū)的需要。在一些方面，板鑒別區(qū)用于減少需要合成的含有樣品鑒別區(qū)的獨特寡核苷酸的數(shù)目。在一些方面，聚核苷酸包括一個或多個銜接區(qū)。在一些方面，銜接區(qū)包括一個或多個G。在一些方面，銜接區(qū)包括2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個G。在一些方面，銜接區(qū)使用MMLVH-反轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換特性連接至cDNA的3’端。存在連接銜接區(qū)的不同方法，包括但不限于用具有5’側(cè)接銜接區(qū)序列的引物進(jìn)行PCR、粘性和鈍端接合、模板轉(zhuǎn)換介導(dǎo)的核苷酸添加或共價連接核苷酸至所述聚核苷酸的5’端、3’端或5’和3’端的其它方法。這些方法可使用分子生物學(xué)中通常使用的酶的特性。PCR可使用例如嗜熱DNA聚合酶。通過用留下懸垂端的限制酶切割dsDNA或通過如TdT(末端轉(zhuǎn)移酶)的酶的3’拖尾活性產(chǎn)生互補或大致互補的粘性端。粘性和鈍端可接著使用如T4連接酶的連接酶與互補銜接區(qū)接合。模板轉(zhuǎn)換利用MMLVH-反轉(zhuǎn)錄酶的3’拖尾活性來添加一個或多個胞嘧啶(C)至cDNA的3’端并且利用其將來自mRNA的模板轉(zhuǎn)換為具有互補G的銜接區(qū)的能力。在一些方面，cDNA在其3’端包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個C。在一些方面，聚核苷酸包括一個或多個限制位點區(qū)。限制位點區(qū)包括一個或多個限制位點。限制位點可包括：NheI、XhoI、BstBI、EcoRI、SacII、BbvCI、PspXI、AgeI、ApaI、KpnI、Acc65I、XmaI、BstEII、DraIII、PacI、FseI、AsiSI和AscI。在一些方面，可使用任何稀有8-切割酶限制位點。在一些方面，本文所述的聚核苷酸的一個或多個區(qū)域可操作性地偶聯(lián)于所述聚核苷酸的一個或多個其它區(qū)域。在一些方面，單一聚核苷酸的兩個或更多個相異區(qū)域可操作性地偶聯(lián)。例如，通用引物區(qū)可操作性地偶聯(lián)于銜接區(qū)。在一些方面，兩個或更多個區(qū)域可操作性地偶聯(lián)在一起，所述區(qū)域的序列大致彼此同一或描述同一。例如，第一樣品鑒別區(qū)可操作性地偶聯(lián)于第二樣品鑒別區(qū)。在一些方面，所述第一樣品鑒別區(qū)和所述第二樣品鑒別區(qū)的序列為同一或大致同一的。在一些方面，所述第一樣品鑒別區(qū)和所述第二樣品鑒別區(qū)的序列為不同的或相異的。在一些方面，本文所述的聚核苷酸的一個或多個區(qū)域可偶聯(lián)于所述聚核苷酸的一個或多個其它區(qū)域。在一些方面，單一聚核苷酸的兩個或更多個相異區(qū)域可偶聯(lián)。例如，通用引物區(qū)可偶聯(lián)于銜接區(qū)。在一些方面，兩個或更多個區(qū)域可偶聯(lián)在一起，所述區(qū)域的序列大致彼此同一或描述同一。例如，第一樣品鑒別區(qū)可偶聯(lián)于第二樣品鑒別區(qū)。在一些方面，所述第一樣品鑒別區(qū)和所述第二樣品鑒別區(qū)的序列為同一或大致同一的。在一些方面，所述第一樣品鑒別區(qū)和所述第二樣品鑒別區(qū)的序列為不同的或相異的。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-3’，其中A為樣品鑒別區(qū)，并且其中B為銜接區(qū)。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-C-3’，其中A為通用引物區(qū)，其中B為樣品鑒別區(qū)，并且其中C為銜接區(qū)。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-C-3’，其中A為樣品鑒別區(qū)，其中B為銜接區(qū)，并且其中C為源于單一樣品的擴(kuò)增子區(qū)。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-C-D-3’，其中A為通用引物區(qū)，其中B為樣品鑒別區(qū)，其中C為銜接區(qū)，并且其中D為源于單一樣品的擴(kuò)增子區(qū)。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-C-D-E-3’，其中A為板鑒別區(qū)，其中B為通用引物區(qū)，其中C為樣品鑒別區(qū)，其中D為銜接區(qū)，并且其中E為源于單一樣品的擴(kuò)增子區(qū)。在一些方面，聚核苷酸包括序列5’-A-B-C-D-E-F-3’，其中A為第一限制位點區(qū)，其中B為通用引物區(qū)，其中C為樣品鑒別區(qū)，其中D為銜接區(qū)，其中E為源于單一樣品的擴(kuò)增子區(qū)，并且其中F為第二限制位點區(qū)。在一些方面，上述序列中每一者的區(qū)域可以不同順序重排，例如5’-C-A-D-B-3’或5’-E-A-C-B-D-F-3’或5’-B-A-3’。在一些方面，上述序列的一個或多個區(qū)域可缺失，例如5’-A-D-3’或5’-B-C-3’。在一些方面，一個或多個額外區(qū)域可添加至上述序列中，例如5’-A-A2-B-3’或5’-A-B-C-D-E-F-G-3’。在所述實施例中，所述一個或多個額外區(qū)域可為本文所公開的任何區(qū)域或其等效物。在一些方面，上述序列的一個或多個區(qū)域可進(jìn)行修飾，例如甲基化。在一些方面，聚核苷酸可包括銜接分子。在一些方面，聚核苷酸銜接分子可包括通用引物區(qū)、樣品鑒別區(qū)和銜接區(qū)，其中所述通用引物區(qū)的3’端偶聯(lián)于所述樣品鑒別區(qū)的5’端，并且其中所述樣品鑒別區(qū)的3’端偶聯(lián)于所述銜接區(qū)的5’端。在一些方面，銜接分子包括包含至少2個結(jié)合于通過反轉(zhuǎn)錄酶在第一鏈cDNA的3'端添加的C的核苷酸的聚核苷酸。在一些方面，銜接分子包括包含3-6個G(DNAG)的脫氧核糖聚核苷酸。在另一實施方案中，銜接分子包括包含3-6個G(RNAG)的核糖聚核苷酸。在其它實施方案中，所述銜接分子可利用核苷酸類似物，如鎖核酸(LNA)，例如LNAG。在其它實施方案中，核苷酸堿基也可為通用或簡并堿基，如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯，所述堿基可以任何組合與C以及其它核苷酸堿基配對。在一些方面，聚核苷酸可包括引物或探針。在一些方面，引物可包括通用引物區(qū)和板鑒別區(qū)，并且其中所述板鑒別區(qū)的3’端偶聯(lián)于所述通用引物區(qū)的5’端。在一些方面，組合物可包括聚核苷酸組合物文庫。在一些方面，聚核苷酸組合物文庫包括多種聚核苷酸組合物。在一些方面，各組合物存在于獨立容器中。在一些方面，容器可為試管。在一些方面，容器可為板中的孔。在一些方面，容器可為96孔板中的孔。在一些方面，容器可為384孔板中的孔。在一些方面，各組合物包含源于單一樣品的cDNA區(qū)。在一些方面，各組合物包含樣品鑒別-銜接區(qū)，其包含偶聯(lián)于銜接區(qū)的樣品鑒別區(qū)。在一些方面，文庫中各樣品鑒別-銜接區(qū)的樣品鑒別區(qū)的序列相異于所述文庫中存在于各獨立容器中的其它樣品鑒別-銜接區(qū)的樣品鑒別區(qū)的核苷酸序列。在一些方面，所述樣品鑒別-銜接區(qū)連接至cDNA區(qū)。在一些方面，所述樣品鑒別-銜接區(qū)通過其3’區(qū)之間的結(jié)合連接至cDNA區(qū)。在一些方面，所述樣品鑒別-銜接區(qū)通過G:C結(jié)合連接至cDNA區(qū)。在一些方面，所述cDNA區(qū)包含與DNA聚核苷酸雜交的RNA聚核苷酸。在一些方面，所述cDNA區(qū)包含與cDNA聚核苷酸雜交的mRNA聚核苷酸。在一些方面，聚核苷酸文庫中的多種聚核苷酸組合物可包含至少2個、至少3個、至少10個、至少30個、至少100個、至少300個、至少1000個、至少3000個、至少10,000個、至少30,000個、至少100,000個、至少300,000個、至少1,000,000個、至少3,000,000個、至少10,000,000個、至少30,000,000個或更多個成員。在其它方面，聚核苷酸文庫中的多種聚核苷酸組合物可包含細(xì)胞樣品的整個轉(zhuǎn)錄組的至少2種、至少3種、至少10種、至少30種、至少100種、至少300種、至少1000種、至少3000種、至少10,000種、至少30,000種或更多種基因。在其它方面，聚核苷酸文庫中的多種聚核苷酸組合物包含至少1種、至少2種、至少3種、至少10種、至少30種、至少100種、至少300種、至少1000種、至少10,000種、至少100,000種、至少1,000,000種、至少10,000,000種、至少1,000,000,000種或更多種存在于個體血液中的不同抗體物質(zhì)。這些抗體物質(zhì)可由成漿細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、長壽命漿細(xì)胞、原生B細(xì)胞、其它B譜系細(xì)胞或其組合表達(dá)。B.載體在一些方面，組合物可包括載體。術(shù)語“載體”用于指載體核酸分子，核酸序列可插入其中以引入至細(xì)胞中，所述核酸序列可在所述細(xì)胞中復(fù)制。載體可用于由核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在一些方面，載體可包括一種或多種本文所述的聚核苷酸。在一個實施方案中，編碼靶標(biāo)多肽的核酸序列的文庫可引入細(xì)胞群體中，由此允許篩選文庫。核酸序列可為“外源的”或“異源的”，這意指其相對于其中正引入所述載體的細(xì)胞而言是外來的，或所述序列與所述細(xì)胞中的序列同源，但在宿主細(xì)胞核酸內(nèi)通常未發(fā)現(xiàn)所述序列的位置中。載體包括質(zhì)粒、粘粒和病毒(例如噬菌體)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)建構(gòu)載體，所述技術(shù)描述于Maniatis等人,1988和Ausubel等人,1994中，所述參考文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文中。在一些方面，載體可為具有預(yù)先工程改造的抗體恒定區(qū)的載體。以這種方式，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可僅克隆所關(guān)注的抗體的VDJ區(qū)并且將這些區(qū)域克隆至所述預(yù)先工程改造的載體中。術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有編碼能夠被轉(zhuǎn)錄的基因產(chǎn)物的至少一部分的核酸序列的載體。在一些情況下，RNA分子接著翻譯成蛋白、多肽或肽。表達(dá)載體可含有多種“控制序列”，所述控制序列是指用于特定宿主生物體中操作性地連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和可能發(fā)生的翻譯的核酸序列。除了管理轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列以外，載體和表達(dá)載體還可含有也發(fā)揮其它功能的核酸序列。在一些方面，載體可包括啟動子。在一些方面，載體可包括增強子?！皢幼印睘榭刂菩蛄?，其為核酸序列中控制轉(zhuǎn)錄的起始和速率的區(qū)域。其可含有遺傳元件，在所述遺傳元件處可結(jié)合調(diào)控蛋白和分子，如RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄因子。措辭“操作性地定位”、“操作性地連接”、“在控制下”和“在轉(zhuǎn)錄控制下”意指啟動子相對于核酸序列處于正確功能位置和/或定向中以控制所述序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。啟動子可或可不結(jié)合“增強子”使用，所述增強子是指核酸序列的轉(zhuǎn)錄活化中涉及的順式作用調(diào)控序列。啟動子可為與基因或序列天然締合的啟動子，如可通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5'非編碼序列來獲得。所述啟動子可稱為“內(nèi)源的”。同樣，增強子可為與核酸序列天然締合的增強子，位于所述序列的下游或上游?；蛘撸ㄟ^在重組或異源啟動子的控制下定位編碼核酸區(qū)段將獲得某些優(yōu)勢，所述重組或異源啟動子是指通常不與核酸序列在其天然環(huán)境中締合的啟動子。重組或異源增強子也是指通常不與核酸序列在其天然環(huán)境中締合的增強子。所述啟動子或增強子可包括其它基因的啟動子或增強子，和從任何其它原核細(xì)胞分離的啟動子或增強子，和非“天然存在”的啟動子或增強子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的不同元件，和/或改變表達(dá)的突變。除了以合成方式制造啟動子和增強子的核酸序列以外，還可使用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)(包括PCR)結(jié)合本文所公開的組合物制造序列(參看美國專利號4,683,202、美國專利號5,928,906，各自以引用的方式并入本文中)。在一些方面，啟動子和/或增強子有效地指導(dǎo)選擇用于表達(dá)的細(xì)胞類型中DNA區(qū)段的表達(dá)?？墒褂玫乃鰡幼拥囊粋€實例為大腸桿菌阿拉伯糖或T7啟動子。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般熟悉用于蛋白表達(dá)的啟動子、增強子和細(xì)胞類型組合的使用，例如參看Sambrook等人(1989)，以引用的方式并入本文中。所用的啟動子可在指導(dǎo)所引入的DNA區(qū)段的高程度表達(dá)的適當(dāng)條件下為組成性的、組織特異性的、誘導(dǎo)性的和/或適用的，如在重組蛋白和/或肽的大規(guī)模制造中為有利的。所述啟動子可為異源的或內(nèi)源的。在一些方面，載體可包括起始信號和/或內(nèi)部核糖體結(jié)合位點。也可包括特異性起始信號以用于編碼序列的有效翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子或相鄰序列?？尚枰峁┩庠捶g控制信號，包括ATG起始密碼子。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將輕易地能夠確定這種信號并且提供必需信號。眾所周知，起始密碼子必須與所需編碼序列的閱讀框“同框”以確保整個插入物的翻譯。所述外源翻譯控制信號和起始密碼子可為天然的或合成的。表達(dá)效率可通過包括適當(dāng)轉(zhuǎn)錄增強子元件來增強。在一些方面，載體可包括增加或優(yōu)化編碼所關(guān)注的基因的DNA區(qū)段的表達(dá)水平的序列。所述序列的實例包括在表達(dá)的mRNA中添加內(nèi)含子(Brinster,R.L.等人(1988)Intronsincreasetranscriptionalefficiencyintransgenicmice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,836–40；Choi,T.等人(1991)Agenericintronincreasesgeneexpressionintransgenicmice.Mol.Cell.Biol.11,3070–4)。用于優(yōu)化DNA區(qū)段的表達(dá)的方法的另一實例為“密碼子優(yōu)化”。密碼子優(yōu)化涉及在DNA區(qū)段中插入沉默突變以減少使用稀有密碼子來優(yōu)化蛋白翻譯(Codonengineeringforimprovedantibodyexpressioninmammaliancells.CartonJM,SauerwaldT,Hawley-NelsonP,MorseB,PefferN,BeckH,LuJ,CottyA,AmegadzieB,SweetR.ProteinExprPurif.2007年10月；55(2):279-86.2007年6月16日電子出版)。在一些方面，載體可包括多克隆位點。載體可包括多克隆位點(MCS)，其為含有多個限制酶位點的核酸區(qū)，所述限制酶位點中的任一者均可結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)使用以消化所述載體(參看Carbonelli等人,1999，Levenson等人,1998，和Cocea,1997，以引用的方式并入本文中)?！跋拗泼赶笔侵赣脙H在核酸分子中的特異性位置處起作用的酶使核酸分子催化裂解。這些限制酶中的多種可在市面上購得。所述酶的使用由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員理解。載體經(jīng)常使用限制酶線性化或片段化，所述限制酶在所述MCS內(nèi)進(jìn)行切割以使得外源序列能夠接合至所述載體?！敖雍稀笔侵冈趦蓚€核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，所述兩個核酸片段可或可不彼此鄰接。涉及限制酶和接合反應(yīng)的技術(shù)為重組
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員眾所周知的。在一些方面，載體可包括末端信號。所述載體或構(gòu)建體一般將包含至少一個末端信號?！澳┒诵盘枴被颉敖K止子”包含通過RNA聚合酶特異性終止RNA轉(zhuǎn)錄物所涉及的DNA序列。因此，在某些實施方案中，涵蓋終止RNA轉(zhuǎn)錄物的制造的末端信號。終止子可為體內(nèi)實現(xiàn)所需信使水平必需的。預(yù)期使用的終止子包括本文所述或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何已知的轉(zhuǎn)錄終止子，包括但不限于例如ρ依賴性或ρ獨立性終止子。在某些實施方案中，終止信號可為可轉(zhuǎn)錄或可翻譯序列的缺乏，如歸因于序列截短。在一些方面，載體可包括復(fù)制起點。為了在宿主細(xì)胞中繁殖載體，其可含有一個或多個復(fù)制起點位點(通常稱為“ori”)，所述載體為起始復(fù)制的特異性核酸序列。在一些方面，載體可包括一種或多種可選擇和/或可篩選標(biāo)記物。在某些實施方案中，含有核酸構(gòu)建體的細(xì)胞可通過在表達(dá)載體中包括標(biāo)記物進(jìn)行體外或體內(nèi)鑒別。所述標(biāo)記物將向細(xì)胞賦予可鑒別改變，從而允許容易鑒別含有所述表達(dá)載體的細(xì)胞。一般來說，可選擇標(biāo)記物為賦予允許選擇的特性的標(biāo)記物。陽性可選擇標(biāo)記物為其中所述標(biāo)記物的存在允許其選擇的標(biāo)記物，而陰性可選擇標(biāo)記物為其中其存在防止其選擇的標(biāo)記物。陽性可選擇標(biāo)記物的實例為耐藥性標(biāo)記物。通常，包括藥物選擇標(biāo)記物有助于克隆和鑒別轉(zhuǎn)化體，例如賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博來霉素和組氨醇的抗性的基因為適用的可選擇標(biāo)記物。除了賦予允許基于條件的執(zhí)行區(qū)別轉(zhuǎn)化體的表型的標(biāo)記物以外，還預(yù)期其它類型的標(biāo)記物，包括可篩選標(biāo)記物(如GFP)，其基礎(chǔ)為比色分析。或者，可利用可篩選酶，如氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)知曉如何使用免疫標(biāo)記物，可能結(jié)合FACS分析。所用標(biāo)記物未被視為重要的，只要其能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達(dá)即可。可選擇和可篩選標(biāo)記物的其它實例為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。一方面，所述載體可表達(dá)編碼多種所關(guān)注的多肽的DNA區(qū)段。例如，編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA區(qū)段可通過單一載體編碼并且表達(dá)。一方面，兩種DNA區(qū)段可包括于相同表達(dá)的RNA上并且使用內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)序列以使所述DNA區(qū)段表達(dá)為獨立多肽(PinkstaffJK,ChappellSA,MauroVP,EdelmanGM,KrushelLA.,InternalinitiationoftranslationoffivedendriticallylocalizedneuronalmRNAs.,ProcNatlAcadSciUSA.2001年2月27日；98(5):2770-5.2001年2月20日電子出版)。另一方面，各DNA區(qū)段具有其本身的啟動子區(qū)，導(dǎo)致獨立mRNA的表達(dá)(AndersenCR,NielsenLS,BaerA,TolstrupAB,WeilgunyD.EfficientExpressionfromOneCMVEnhancerControllingTwoCorePromoters.MolBiotechnol.2010年11月27日.[印刷版之前的電子版])。C.宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)在一些方面，組合物可包括宿主細(xì)胞。在一些方面，宿主細(xì)胞可包括本文所述的聚核苷酸或載體。在一些方面，宿主細(xì)胞可包括真核細(xì)胞(例如昆蟲、酵母或哺乳動物)或原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)。在表達(dá)異源核酸序列的背景下，“宿主細(xì)胞”可指原核細(xì)胞，并且其包括能夠復(fù)制載體和/或表達(dá)由載體編碼的異源基因的任何可轉(zhuǎn)化生物體。宿主細(xì)胞可并且已經(jīng)用作載體的接受者。宿主細(xì)胞可“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”，其是指將外源核酸轉(zhuǎn)移或引入宿主細(xì)胞中的過程。轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括原代受試者細(xì)胞和其后代。在特定實施方案中，宿主細(xì)胞為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。這些細(xì)菌適合使用，因為其在內(nèi)膜與外膜之間具有細(xì)胞周質(zhì)間隙并且具體說來，前述內(nèi)膜在周質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)之間，其還稱作細(xì)胞質(zhì)膜。因而，可能使用具有所述細(xì)胞周質(zhì)間隙的任何其它細(xì)胞。革蘭氏陰性細(xì)菌的實例包括但不限于大腸桿菌、綠濃假單胞菌、霍亂弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、流感嗜血桿菌、百日咳博德特氏菌、解淀粉歐文氏菌、根瘤菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞可進(jìn)一步作為細(xì)菌細(xì)胞定義，所述細(xì)菌細(xì)胞已經(jīng)用包含能夠結(jié)合所選配體的候選結(jié)合多肽的融合多肽的編碼序列轉(zhuǎn)化。所述多肽錨定于細(xì)胞質(zhì)膜的外面，面對細(xì)胞周質(zhì)間隙，并且可包含抗體編碼序列或另一序列。一種用于所述多肽的表達(dá)的方式是使前導(dǎo)序列連接至能夠引起所述引導(dǎo)的多肽。多種原核細(xì)胞系和培養(yǎng)物可供用作宿主細(xì)胞，并且其可通過美國菌種保藏中心(ATCC)獲得，美國菌種保藏中心(ATCC)為充當(dāng)活培養(yǎng)物和遺傳物質(zhì)的檔案館的機構(gòu)。適當(dāng)宿主可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員基于載體骨架和所需結(jié)果確定。舉例來說，質(zhì)?；蛘沉？梢朐松锼拗骷?xì)胞中用于多種載體的復(fù)制。作為用于載體復(fù)制和/或表達(dá)的宿主細(xì)胞使用的細(xì)菌細(xì)胞包括DH5-α、JM109和KC8，以及多種市面上可購得的細(xì)菌宿主，如SURETM感受態(tài)細(xì)胞和SOLOPACKTMGold細(xì)胞(STRATAGENETM,LaJolla)。在一些方面，如大腸桿菌LE392的其它細(xì)菌細(xì)胞預(yù)期用作宿主細(xì)胞。來自多種細(xì)胞類型和生物體的多種宿主細(xì)胞可獲得并且將為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知。同樣，病毒載體可結(jié)合原核宿主細(xì)胞，尤其是允許用于所述載體的復(fù)制或表達(dá)的宿主細(xì)胞使用。一些載體可使用控制序列，所述控制序列允許其在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將進(jìn)一步了解孵育所有上述宿主細(xì)胞以維持所述細(xì)胞并且允許載體的復(fù)制的條件。還了解和知曉將允許載體的大規(guī)模制造以及由載體和其同源多肽、蛋白或肽編碼的核酸的制造的技術(shù)和條件。在一些方面，宿主細(xì)胞為哺乳動物的。實例包括CHO細(xì)胞、CHO-K1細(xì)胞或CHO-S細(xì)胞。其它哺乳動物宿主細(xì)胞包括NS0細(xì)胞，和為dhfr-的CHO細(xì)胞，例如CHO-dhfr-、DUKX-B11CHO細(xì)胞和DG44CHO細(xì)胞。存在多種表達(dá)系統(tǒng)，其可包含本文所公開的組合物的至少一部分或全部。表達(dá)系統(tǒng)可包括真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可能用于例如制造經(jīng)鑒別為能夠結(jié)合特定配體的多肽產(chǎn)品?；谠松锏南到y(tǒng)可用于制造核酸序列，或其同源多肽、蛋白和肽。多種所述系統(tǒng)可在市面上并且廣泛購得。表達(dá)系統(tǒng)的其它實例包含含有如T7、Tac、Trc、BAD、λpL、四環(huán)素或Lac啟動子的強原核生物啟動子的載體、pET表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。D.多肽在一些方面，組合物可包括多肽。在一些方面，由本文所述的聚核苷酸編碼的多肽可例如由宿主細(xì)胞表達(dá)。術(shù)語“多肽”或“蛋白”包括具有原生蛋白的氨基酸序列的大分子，也就是說由天然存在和非重組細(xì)胞制造的蛋白；或其由遺傳工程改造的或重組細(xì)胞制造，并且包含具有原生蛋白的氨基酸序列的分子，或具有原生序列的一個或多個氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。所述術(shù)語還包括其中一種或多種氨基酸為對應(yīng)的天然存在氨基酸和聚合物的化學(xué)類似物的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”和“蛋白”涵蓋抗原結(jié)合蛋白、抗體或具有抗原結(jié)合蛋白的一個或多個氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。術(shù)語“多肽片段”是指如與全長原生蛋白相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或內(nèi)部缺失的多肽。所述片段還可含有如與原生蛋白相比經(jīng)過修飾的氨基酸。在某些實施方案中，片段為約5個至500個氨基酸長。例如，片段可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400個或450個氨基酸長。適用的多肽片段包括抗體的免疫功能片段，包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在結(jié)合抗體的情況下，適用的片段包括但不限于CDR區(qū)、重鏈和/或輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域、抗體鏈的一部分或僅其可變區(qū)(包括兩個CDR)等。術(shù)語“分離蛋白”意指主題蛋白(1)不含至少一些通常將與其一起發(fā)現(xiàn)的其它蛋白，(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種的其它蛋白，(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，(4)已經(jīng)與在自然界與其締合的聚核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其它物質(zhì)的至少約50％分離，(5)與在自然界未與其締合的多肽操作性地締合(通過共價或非共價相互作用)，或(6)不在自然界存在。典型地，“分離蛋白”構(gòu)成給定樣品的至少約5％、至少約10％、至少約25％或至少約50％。合成起源的基因組DNA、cDNA、mRNA或其它RNA、核酸或其任何組合可編碼所述分離蛋白。優(yōu)選地，所述分離蛋白大致不含在其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的蛋白或多肽或其它污染物，所述蛋白或多肽或其它污染物將干擾其治療、診斷、預(yù)防、研究或其它用途。在一些方面，多肽可包括抗原結(jié)合蛋白(ABP)。如本文所用的“抗原結(jié)合蛋白”(“ABP”)意指結(jié)合規(guī)定的靶標(biāo)抗原的任何蛋白?！翱乖Y(jié)合蛋白”包括但不限于抗體和其結(jié)合部分，如免疫功能片段。肽體為抗原結(jié)合蛋白的另一實例。如本文所用的術(shù)語抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)抗原結(jié)合蛋白的“免疫功能片段”(或簡單地“片段”)為抗原結(jié)合蛋白物質(zhì)，其包含缺乏存在于全長鏈中的至少一些氨基酸但仍能夠特異性結(jié)合于抗原的抗體的一部分(無論所述部分如何獲得或合成)。所述片段為生物學(xué)活性的，因為其結(jié)合于靶標(biāo)抗原并且可與其它抗原結(jié)合蛋白(包括完整抗體)競爭結(jié)合于給定的表位。在一些實施方案中，所述片段為中和片段。這些生物學(xué)活性片段可通過重組DNA技術(shù)制造，或可通過抗原結(jié)合蛋白(包括完整抗體)的酶或化學(xué)裂解制造。免疫功能免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、雙功能抗體(與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在相同多肽上的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，經(jīng)由短肽連接子連接，所述短肽連接子過短而無法允許相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間的配對)、Fab'、F(ab')2、Fv、結(jié)構(gòu)域抗體和單鏈抗體，并且可源于任何哺乳動物來源，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、駱駝科動物或兔。進(jìn)一步預(yù)期，本文所公開的抗原結(jié)合蛋白的功能部分(例如一個或多個CDR)可能共價結(jié)合于第二蛋白或小分子以產(chǎn)生針對身體中的特定靶標(biāo)的治療劑，從而具有雙功能治療特性或具有延長血清半衰期。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，抗原結(jié)合蛋白可包括非蛋白組分。關(guān)于抗原結(jié)合蛋白和抗體的額外細(xì)節(jié)(如修飾、變體、制造方法和篩選方法)可發(fā)現(xiàn)于美國專利公布20110027287中，所述專利公布以引用的方式整體并入本文中來達(dá)成所有目的。在一些方面，多肽可包括抗體。術(shù)語“抗體”是指任何同型的完整免疫球蛋白，或可與所述完整抗體競爭特異性結(jié)合于靶標(biāo)抗原的其片段，并且包括例如嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體和雙特異性抗體?！翱贵w”為抗原結(jié)合蛋白物質(zhì)。完整抗體一般將包含至少兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，如天然存在于駱駝科動物中的抗體，其可僅包含重鏈?？贵w可單獨源于單一來源，或可為“嵌合的”，也就是說所述抗體的不同部分可源于兩種不同抗體。所述抗原結(jié)合蛋白、抗體或結(jié)合片段可在雜交瘤中，通過重組DNA技術(shù)，或通過完整抗體的酶或化學(xué)裂解制造。除非另外指示，否則術(shù)語“抗體”除包含兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈的抗體以外還包括其衍生物、變體、片段和突變蛋白。此外，除非明確地排除，否則抗體分別包括單克隆抗體、雙特異性抗體、微抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(本文中有時稱作“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、抗體融合物(本文中有時稱作“抗體綴合物”)和其片段。在一些實施方案中，所述術(shù)語還涵蓋肽體。治療有效量的ABP可施用于有需要的受試者。ABP可配制于藥物組合物中。這些組合物除一種或多種ABP以外還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的其它物質(zhì)。所述物質(zhì)應(yīng)為無毒的并且不應(yīng)干擾活性成分的功效。所述載體或其它物質(zhì)的精確性質(zhì)可取決于施用途徑，例如口服、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、經(jīng)鼻、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑。用于口服施用的藥物組合物可呈片劑、膠囊、粉劑或液體形式。片劑可包括固體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包括液體載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油?？砂ㄉ睇}水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。關(guān)于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射或在痛苦位點處注射，活性成分將呈腸胃外可接受的水溶液形式，所述水溶液無熱原質(zhì)并且具有合適的pH、等張性和穩(wěn)定性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員充分能夠使用例如等張媒介物制備合適溶液，所述等張媒介物如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液?？扇缢璋ǚ栏瘎?、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其它添加劑。ABP施用優(yōu)選地呈“治療有效量”或“預(yù)防有效量”(視情況而定，不過預(yù)防可被視為療法)，這足以顯示對個體的益處。實際施用量和施用速率和時程將取決于正在治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方(例如對劑量的決定等)在一般從業(yè)者和其它醫(yī)師的職責(zé)內(nèi)，并且典型地考慮待治療的病癥、個別患者的病況、遞送位點、施用方法和從業(yè)者已知的其它因素。上文提及的技術(shù)和方案的實例可發(fā)現(xiàn)于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Osol,A.(編),1980中。組合物可單獨或與其它治療組合(同時或依序，取決于待治療的病況)施用。III.免疫細(xì)胞樣品可包括免疫細(xì)胞。所述免疫細(xì)胞可包括T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)包括例如表達(dá)T細(xì)胞受體的細(xì)胞。B細(xì)胞包括例如活化B細(xì)胞、胚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、成漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、B1細(xì)胞、B2細(xì)胞、邊緣區(qū)B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞。T細(xì)胞包括活化T細(xì)胞、胚T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞(效應(yīng)T細(xì)胞或Th細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、記憶T細(xì)胞、中央記憶T細(xì)胞、效應(yīng)記憶T細(xì)胞和調(diào)控T細(xì)胞。樣品可包括單細(xì)胞(例如單一T或B細(xì)胞)或至少1,000個、至少10,000個、至少100,000個、至少250,000個、至少500,000個、至少750,000個或至少1,000,000個細(xì)胞。A.B細(xì)胞如本文所用，“B細(xì)胞”是指具有至少一個重排免疫球蛋白基因座的任何細(xì)胞。B細(xì)胞可包括至少一個重排免疫球蛋白重鏈基因座或至少一個重排免疫球蛋白輕鏈基因座。B細(xì)胞可包括至少一個重排免疫球蛋白重鏈基因座和至少一個重排免疫球蛋白輕鏈基因座。B細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，其為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分。B細(xì)胞可包括將抗體以膜結(jié)合形式表達(dá)為細(xì)胞表面上的B細(xì)胞受體(BCR)或表達(dá)為分泌抗體的任何細(xì)胞。B細(xì)胞可表達(dá)免疫球蛋白(抗體、B細(xì)胞受體)。抗體可包括由重和輕免疫球蛋白鏈形成的異質(zhì)二聚體。所述重鏈由可變、多樣性和接合(VDJ)基因的基因重排形成以形成可變區(qū)，所述可變區(qū)接合至恒定區(qū)。所述輕鏈由可變和接合(VJ)基因的基因重排形成以形成可變區(qū)，所述可變區(qū)接著接合至恒定區(qū)。由于可能大量的接合組合，所述抗體基因(其也為BCR)的可變區(qū)具有巨大多樣性，使得B細(xì)胞能夠識別任何外來抗原并且對其作出反應(yīng)。B.B細(xì)胞活化和分化當(dāng)B細(xì)胞在發(fā)炎免疫反應(yīng)的背景中識別抗原時，B細(xì)胞活化并且分化。其通過包括2種信號來活化，一種信號遞送通過BCR(重排免疫球蛋白的膜結(jié)合形式)，并且另一種信號遞送通過CD40或另一共刺激分子。這一第二信號可通過與輔助T細(xì)胞的相互作用來提供，所述輔助T細(xì)胞在其表面上表達(dá)CD40的配體(CD40L)。B細(xì)胞接著增殖并且可經(jīng)歷體細(xì)胞超突變，其中所述抗體基因的核苷酸序列產(chǎn)生隨機改變，并且選擇其抗體對B細(xì)胞具有較高親和力的B細(xì)胞。其也可經(jīng)歷“類別轉(zhuǎn)換”，其中編碼IgM同型的重鏈的恒定區(qū)轉(zhuǎn)換為編碼IgG、IgA或IgE同型的恒定區(qū)。分化B細(xì)胞可作為記憶B細(xì)胞終止，所述記憶B細(xì)胞通常具有較高親和力并且進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，不過一些記憶B細(xì)胞仍具有IgM同型。記憶B細(xì)胞也可活化并且分化為成漿細(xì)胞并且最終分化為漿細(xì)胞。分化B細(xì)胞也可首先變?yōu)槌蓾{細(xì)胞，所述成漿細(xì)胞接著分化以變?yōu)闈{細(xì)胞。C.親和力成熟和克隆家族克隆家族一般通過使用相關(guān)免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈V(D)J序列由2種或更多種樣品定義。相關(guān)免疫球蛋白重鏈V(D)J序列可通過其對在基因組中編碼的V(D)J基因區(qū)段的共同使用來鑒別。在克隆家族內(nèi)一般存在子家族，所述子家族基于其V(D)J區(qū)段內(nèi)的共同突變而變化，可在B細(xì)胞基因重組和體細(xì)胞超突變期間產(chǎn)生?；罨疊細(xì)胞在淋巴或其它組織內(nèi)遷移并且形成胚中心，在所述組織內(nèi)所述細(xì)胞經(jīng)歷親和力成熟。B細(xì)胞也可在胚中心外部經(jīng)歷親和力成熟。在親和力成熟期間，B細(xì)胞經(jīng)歷其抗體基因的隨機突變，所述隨機突變集中在所述基因的互補決定區(qū)(CDR)中，所述互補決定區(qū)編碼直接結(jié)合于并且識別靶標(biāo)抗原的抗體的部分，所述B細(xì)胞針對所述靶標(biāo)抗原活化。這由初始增殖B細(xì)胞產(chǎn)生子克隆，所述子克隆表達(dá)略微不同于初始克隆并且彼此不同的免疫球蛋白?？寺「偁幙乖⑶疫x擇較高親和力克隆，而較低親和力克隆通過細(xì)胞凋亡死亡。這一過程導(dǎo)致B細(xì)胞的“親和力成熟”并且因此導(dǎo)致表達(dá)以較高親和力結(jié)合于所述抗原的免疫球蛋白的B細(xì)胞的產(chǎn)生。起源于相同‘親本’B細(xì)胞的所有B細(xì)胞形成克隆家族，并且這些克隆家族包括識別相同或相似抗原表位的B細(xì)胞。在一些方面，我們預(yù)期以較高出現(xiàn)率存在的克隆代表以較高親和力結(jié)合于抗原的克隆，因為最高親和力克隆在親和力成熟期間進(jìn)行選擇。在一些方面，具有不同V(D)J區(qū)段使用的克隆展現(xiàn)不同的結(jié)合特征。在一些方面，具有相同V(D)J區(qū)段使用但具有不同突變的克隆展現(xiàn)不同的結(jié)合特征。D.記憶B細(xì)胞記憶B細(xì)胞通常為親和力成熟B細(xì)胞，并且可進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換。這些細(xì)胞為可更快速地對后續(xù)抗原挑戰(zhàn)作出反應(yīng)的細(xì)胞，顯著地將針對抗原的親和力成熟抗體分泌所包括的時間從原生生物體中的約14天減少至約7天。E.成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞漿細(xì)胞可為長壽命或短壽命的。長壽命漿細(xì)胞可在生物體的終生存活，而短壽命漿細(xì)胞可持續(xù)3-4天。長壽命漿細(xì)胞停留在發(fā)炎區(qū)域中、粘膜區(qū)域中(在IgA分泌漿細(xì)胞的情況下)、二級淋巴組織中(如脾或淋巴結(jié))或骨髓中。為了到達(dá)這些發(fā)散區(qū)域，注定變成長壽命漿細(xì)胞的成漿細(xì)胞可在利用多種趨化因子梯度通行至適當(dāng)區(qū)域之前首先行進(jìn)通過血流。成漿細(xì)胞為親和力成熟細(xì)胞，典型地進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換，并且通常分泌抗體，不過所分泌抗體的量一般低于由漿細(xì)胞制造的抗體的量。漿細(xì)胞為專用抗體分泌者。F.TCR和BCR基因的特征由于鑒別重組存在于各個別適應(yīng)性免疫細(xì)胞的DNA以及其相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄物中，可對RNA或DNA測序。來自T細(xì)胞或B細(xì)胞的重組序列也可稱作克隆型。所述DNA或RNA可對應(yīng)于編碼抗體的來自T細(xì)胞受體(TCR)基因或免疫球蛋白(Ig)基因的序列。例如，所述DNA或RNA可對應(yīng)于編碼TCR的α、β、γ或δ鏈的序列。在大多數(shù)T細(xì)胞中，TCR為由α鏈和β鏈組成的異質(zhì)二聚體。TCR-α鏈通過VJ重組產(chǎn)生，并且β鏈?zhǔn)荏w通過V(D)J重組產(chǎn)生。對于TCR-β鏈，在人類中存在48個V區(qū)段、2個D區(qū)段和13個J區(qū)段。在兩個接合點中的每一者處，可缺失數(shù)個堿基并且可添加其它堿基(稱為N和P核苷酸)。在少數(shù)T細(xì)胞中，TCR由γ和δ鏈組成。TCRγ鏈通過VJ重組產(chǎn)生，并且TCRδ鏈通過V(D)J重組產(chǎn)生(KennethMurphy、PaulTravers和MarkWalport,Janeway'sImmunology第7版,GarlandScience,2007，其以引用的方式整體并入本文中)。在所述方法中分析的DNA和RNA可對應(yīng)于編碼具有恒定區(qū)(α、δ、γ、ε或μ)的重鏈免疫球蛋白(IgH)或具有恒定區(qū)λ或κ的輕鏈免疫球蛋白(IgK或IgL)的序列。各抗體可具有兩個同一輕鏈和兩個同一重鏈。各鏈由恒定(C)和可變區(qū)構(gòu)成。對于重鏈，可變區(qū)由可變(V)、多樣性(D)和接合(J)區(qū)段構(gòu)成。編碼這些區(qū)段中的每一種類型的數(shù)個相異序列存在于基因組中。特異性VDJ重組事件在B細(xì)胞的發(fā)育期間發(fā)生，標(biāo)記所述細(xì)胞產(chǎn)生特異性重鏈。輕鏈中的多樣性以類似方式產(chǎn)生，除了不存在D區(qū)，因此僅有VJ重組。體細(xì)胞突變通常接近所述重組的位點發(fā)生，引起數(shù)種核苷酸的添加或缺失，進(jìn)一步增加由B細(xì)胞產(chǎn)生的重鏈和輕鏈的多樣性。由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的可能多樣性接著為不同重鏈和輕鏈的產(chǎn)物。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)有助于形成抗原識別(或結(jié)合)區(qū)或位點。在這種多樣性中添加體細(xì)胞超突變過程，其可在針對一些表位作出特異性反應(yīng)之后發(fā)生。在這種過程中，突變在能夠識別所述特異性表位的那些B細(xì)胞中發(fā)生，導(dǎo)致可能更強烈地結(jié)合所述特異性表位的抗體的更大多樣性。所有這些因素均有助于由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的極大多樣性?？僧a(chǎn)生數(shù)十億種并且可能超過一萬億種相異抗體。關(guān)于產(chǎn)生T細(xì)胞多樣性的基礎(chǔ)前提類似于關(guān)于由B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)前提。T細(xì)胞和B細(xì)胞活化的要素為其結(jié)合于表位。特異性細(xì)胞的活化導(dǎo)致更多相同類型細(xì)胞的制造，導(dǎo)致克隆擴(kuò)張。互補決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)為抗原受體(例如T細(xì)胞受體和免疫球蛋白)的可變結(jié)構(gòu)域中可結(jié)合抗原的序列。各抗原受體的鏈含有三種CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。產(chǎn)生T細(xì)胞(α和β)和免疫球蛋白(IgH和IgK或IgL)的兩種多肽有助于三種CDR的形成。CDR1和CDR2中由TCR-β編碼的部分位于47個功能V區(qū)段之一內(nèi)。CDR的大多數(shù)多樣性發(fā)現(xiàn)于CDR3中，其中所述多樣性由T淋巴細(xì)胞的發(fā)育期間的體細(xì)胞重組事件產(chǎn)生。BCR的極大多樣性存在于個體間和個體內(nèi)。所述BCR由編碼抗體重鏈和輕鏈的兩種基因IgH和IgK(或IgL)構(gòu)成。結(jié)合抗原和MHC分子的三種互補決定區(qū)(CDR)序列在IgH和IgK(或IgL)中具有大多數(shù)多樣性。CDR1和CDR2中由IgH編碼的部分位于44個功能V區(qū)段之一內(nèi)。原生B細(xì)胞的大多數(shù)多樣性在CDR3的產(chǎn)生中通過B淋巴細(xì)胞的發(fā)育期間的體細(xì)胞重組事件出現(xiàn)。所述重組可產(chǎn)生具有所述V、D和J區(qū)段中每樣一個的分子。在人類中，存在44個V、27個D和6個J區(qū)段；因此，存在超過7,000種組合的理論可能性。在小部分BCR中(約5％)，發(fā)現(xiàn)兩個D區(qū)段。此外，在兩個接合點中的每一者處，可缺失數(shù)個堿基并且可添加其它堿基(稱為N和P核苷酸)，從而產(chǎn)生極大多樣性程度。在B細(xì)胞活化后，發(fā)生通過體細(xì)胞超突變實現(xiàn)的親和力成熟過程。在這一過程中，活化B細(xì)胞的后代細(xì)胞在基因中聚集不同體細(xì)胞突變，其中在CDR區(qū)中具有較高突變濃度，導(dǎo)致產(chǎn)生對抗原具有較高親和力的抗體。除體細(xì)胞超突變以外，活化B細(xì)胞還經(jīng)歷同型轉(zhuǎn)換的過程。具有相同可變區(qū)段的抗體可具有不同形式(同型)，視恒定區(qū)段而定。盡管所有原生B細(xì)胞均表達(dá)IgM(或IgD)，活化B細(xì)胞主要表達(dá)IgG，以及IgM、IgA和IgE。從IgM(和/或IgD)至IgG、IgA或IgE的這一表達(dá)轉(zhuǎn)換通過重組事件發(fā)生，引起一種細(xì)胞專用于制造特異性同型。對于各IgM、IgD和IgE存在一個區(qū)段，對于IgA存在兩個區(qū)段，并且對于IgG存在四個區(qū)段。IV.計算機執(zhí)行在一些方面，一種或多種本文所述的方法可在計算機上執(zhí)行。在一個實施方案中，計算機包含至少一個耦合于芯片組的處理器。在一些實施方案中，所述芯片組耦合于存儲器、存儲器件、鍵盤、圖形適配器、定點器件和/或網(wǎng)絡(luò)適配器。顯示器典型地耦合于所述圖形適配器。在一個實施方案中，所述芯片組的功能性由存儲控制器中心和/或I/O控制器中心提供。在另一實施方案中，所述存儲器直接耦合于所述處理器而非所述芯片組。所述存儲器件為能夠容納數(shù)據(jù)的任何器件，如硬盤驅(qū)動器、光盤只讀存儲器(CD-ROM)、DVD或固態(tài)存儲器件。所述存儲器容納由所述處理器使用的指令和數(shù)據(jù)。所述定點器件可為鼠標(biāo)、游標(biāo)控制球或其它類型的定點器件，并且與鍵盤組合使用以將數(shù)據(jù)輸入計算機系統(tǒng)中。所述圖形適配器在顯示器上顯示圖像和其它信息。所述網(wǎng)絡(luò)適配器將計算機系統(tǒng)耦合于局域或廣域網(wǎng)絡(luò)。如所屬領(lǐng)域中已知，計算機可具有與先前所述的那些不同和/或其它組件。另外，計算機可缺乏某些組件。此外，所述存儲器件可為計算機局部的和/或遠(yuǎn)程的(如在存儲區(qū)域網(wǎng)絡(luò)(SAN)內(nèi)具體化)。如所屬領(lǐng)域中已知，使計算機適應(yīng)以執(zhí)行用于提供本文所述的功能性的計算機程序模塊。如本文所用，術(shù)語“模塊”是指用于提供規(guī)定的功能性的計算機程序邏輯。因此，模塊可在硬件、固件和/或軟件中執(zhí)行。在一個實施方案中，程序模塊存儲在所述存儲器件上，裝載于所述存儲器中，并且由所述處理器執(zhí)行。本文所述的實體的實施方案可包括其它和/或與此處所述的模塊不同的模塊。另外，歸因于所述模塊的功能性可在其它實施方案中由其它或不同模塊執(zhí)行。此外，這一描述出于清晰并且便利的目的偶爾省略術(shù)語“模塊”。V.試劑盒本文進(jìn)一步公開包含本文所述的銜接構(gòu)建體的試劑盒。試劑盒可包含多種偶聯(lián)于本文所述的銜接構(gòu)建體的固體支撐物。在一些實施方案中，所述試劑盒包含銜接模板文庫，所述文庫包含多種銜接模板。在一些實施方案中，所述試劑盒包含銜接模板文庫，所述文庫包含多種偶聯(lián)于多種固體支撐物的銜接模板。所述試劑盒可進(jìn)一步包含用于通過酶反應(yīng)由所述銜接模板構(gòu)建體產(chǎn)生本文所述的銜接分子(例如，條形碼銜接分子)的酶。在一些實施方案中，所述試劑盒包含本文所述的細(xì)胞懸浮緩沖液。試劑盒可包括本文所公開的聚核苷酸、聚核苷酸文庫、載體和/或宿主細(xì)胞和使用說明書。所述試劑盒可在合適容器中包含本文所公開的聚核苷酸、聚核苷酸文庫、載體和/或宿主細(xì)胞、一種或多種對照和所屬領(lǐng)域中眾所周知的多種緩沖液、試劑、酶和其它標(biāo)準(zhǔn)成分。所述容器可包括在包含一個或多個孔的板上的至少一個孔。所述容器可包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器構(gòu)件，聚核苷酸、聚核苷酸文庫、載體和/或宿主細(xì)胞可放入其中，并且在一些情況下合適地等分試樣。在提供額外組件的情況下，所述試劑盒可含有額外容器，這一組件可放入所述額外容器中。所述試劑盒還可包括用于容納所述聚核苷酸、聚核苷酸文庫、載體和/或宿主細(xì)胞的構(gòu)件和密切限制于商業(yè)規(guī)模的任何其它試劑容器。所述容器可包括注射或吹塑成型塑料容器，所需小瓶保留于其中?？砂ㄙN有使用說明書和/或警告標(biāo)簽的容器。VI.器件本發(fā)明的實施方案包括用于產(chǎn)生和傳送反應(yīng)容積的器件。這些容積可以微流體規(guī)模出現(xiàn)并且可與載液進(jìn)行相分離?？捎伤銎骷幚淼姆磻?yīng)容積的實例包括反相乳液中的水性液滴(即，水/油乳液)。所述器件允許條形碼銜接模板、條形碼銜接分子、樣品(例如細(xì)胞)和/或從這些樣品獲得的RNA分別地或一起封裝于液滴中。所述器件還允許將試劑引入液滴中，使得條形碼銜接分子可酶法產(chǎn)生并且可對來自個別樣品的RNA編條形碼。如本文所用并且要求的器件的非限制性實例描繪于圖17-19中。熟練技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到這些器件的變化形式也可建構(gòu)并且用于本發(fā)明方法中。器件一般包括三個微流體途徑，各途徑耦合于壓力源和流量傳感器。用于微流體途徑的壓力源驅(qū)動流體通過所述途徑，并且出現(xiàn)于所述壓力源的下游的所述流量傳感器可用于測量通過所述途徑的流動速率。在一些實施方案中，第一途徑101和第二途徑102在第一接合點104處合并以形成組合途徑，所述組合途徑接著與第三途徑103在第二接合點105處合并。所述第二接合點出現(xiàn)于微流體液滴芯片中并且可為產(chǎn)生微流體液滴的位點。如本文所述的器件可由可獲自IDEXCorporation(LakeForest,Illinois,U.S.A.)的管和射流組件并且使用可獲自DolomiteMicrofluidics(Charlestown,Massachusetts,U.S.A.)的微流體液滴芯片組裝。所述微流體液滴芯片的一些特征描述于美國專利號7,268,167、7,375,140、7,717,615、7,772,287、8,741,192和8,883,864中，所述專利以引用的方式并入本文中。合適的壓力源包括注射泵和壓力泵。壓力泵可獲自DolomiteMicrofluidics。所述壓力源可獨立地控制。在一些實施方案中，所述第一和第二微流體途徑傳送水溶液。各途徑可包括注射口和閥(例如四通閥)以使在所述注射口中引入的溶液與所述途徑在同一條線上。在一些實施方案中，容納水性載液的儲槽安置在各四通閥的上游。當(dāng)所述水性載液在下游被驅(qū)動或在下游推動水溶液的插塞朝向所述第一接合點時，所述載液可與所述水溶液在所述四通閥中混合。在一些實施方案中，流阻器安置在各微流體途徑中。一旦水溶液被引入所述第一或第二微流體途徑中，其可傳遞通過樣品環(huán)管，所述樣品環(huán)管計量所述溶液朝向所述第一接合點的流動。計量可如所需實現(xiàn)，例如使用流體阻力或沿所述樣品環(huán)管安置的閥。在一些實施方案中，一個樣品環(huán)管與所述第一和第二微流體途徑中的每一者締合，并且所述樣品環(huán)管與熱冷卻單元接觸。可包括所述熱冷卻單元以防止所述水溶液中酶、核酸或其它生物組分的熱變性，或針對酶反應(yīng)建立最佳溫度。所述熱冷卻單元中與用于所述第一和第二微流體途徑的樣品環(huán)管接觸的部分可獨立地或聯(lián)合加以控制。任何物質(zhì)或裝置均可用作熱冷卻單元，其限制條件是其可使傳遞通過所述樣品環(huán)管的水溶液的溫度偏離環(huán)境溫度。合適的熱冷卻器件的實例為珀耳帖器件和冰箱。在一些實施方案中，傳送通過所述第一微流體途徑的水溶液含有細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒。在一些實施方案中，傳送通過所述第二微流體途徑的水溶液含有用于細(xì)胞溶解的試劑和用于制造所關(guān)注的聚核苷酸的試劑(例如，用于產(chǎn)生條形碼銜接分子的酶)。與各微流體途徑締合的注射口、閥和/或樣品環(huán)管可經(jīng)過配置或經(jīng)過定制以容納傳遞通過所述途徑的水溶液的內(nèi)含物。例如，與所述第一微流體途徑締合的樣品環(huán)管可具有放大的內(nèi)徑以容納細(xì)胞和珠粒。應(yīng)認(rèn)識到關(guān)于在所述第一和第二微流體途徑之間分配細(xì)胞、珠粒和試劑存在多種其它選項，使得這些組分均在所述第一接合點組合。例如，細(xì)胞可傳送通過所述第一微流體途徑并且珠?？蓚魉屯ㄟ^所述第二微流體途徑。各途徑可鑒于其攜帶的水溶液的內(nèi)含物，如所需經(jīng)過配置。由所述第一微流體途徑和所述第二微流體途徑的合并產(chǎn)生的組合途徑又與所述第三微流體途徑在所述微流體液滴芯片中合并。這發(fā)生在所述第二接合點，其在所述第一接合點的下游?？稍谒龅谝唤雍宵c與第二接合點之間建立任何所需距離。在一些實施方案中，所述第一接合點也位于所述微流體液滴芯片內(nèi)。在一些實施方案中，所述第一接合點恰在所述第二接合點上游，使得所述組合途徑中的流體在與來自所述第三微流體途徑的流體組合之前行進(jìn)可忽略的距離(例如，小于10、3、1、0.3或0.1cm)。這種安排可減少所述組合途徑中組分的混合。在一些實施方案中，所述器件中的所述微流體途徑的尺寸(在所述微流體液滴芯片的內(nèi)部和/或外部)使得流體的移動通過層流管理。所述第三微流體途徑可經(jīng)過配置以遞送油/表面活性劑混合物至所述微流體液滴芯片。因此，在所述器件中的第二接合點，水相和疏水相可混合并且可形成微流體液滴。可選擇所述第二接合點的幾何形狀以確保這些液滴具有所需特征。例如，可選擇幾何形狀以促進(jìn)在所述微流體途徑中在合適的流動速率下形成具有所需大小并且彼此間隔開所需距離的單分散液滴。在一些實施方案中，所述第三微流體途徑分成所述微流體液滴芯片的上游的兩個子途徑，所述兩個子途徑在所述第二接合點連同所述組合(水性)途徑合并在一起。所述兩個子途徑可以大角度(例如，大約或至少30、60、90、120、150或180度)彼此逼近，使得所述油/表面活性劑混合物在其進(jìn)入所述第二接合點時形成圍繞所述水性混合物的外殼。使用這種幾何形狀，水性液滴被從所述水性混合物‘夾斷’并且當(dāng)其離開所述接合點時以大約與所述水性混合物相同的方向流動。這種產(chǎn)生液滴的方法在所屬領(lǐng)域中被稱作流動聚焦。在其它實施方案中，所述組合水性途徑以恰當(dāng)?shù)慕嵌扰c所述第三微流體途徑相交，因此使所述第二接合點具有t形接合幾何形狀。在這些實施方案中，油/表面活性劑混合物筆直流動通過所述接合點。所述水性混合物以垂直于由這種混合物形成的液滴被攜帶離開所述接合點的方向的方向逼近所述接合點。多種微流體幾何形狀中液滴形成的物理學(xué)描述于Thorsen等人,Phys.Rev.Lett.86,4163-4166,2001中和別處。由所述含有水性混合物的組合途徑和所述含有油/表面活性劑混合物的第三微流體途徑的合并形成的含有液滴的流體途徑構(gòu)成樣品途徑。所述樣品途徑被遞送至出現(xiàn)在所述第二接合點的下游的樣品收集容器。在所述樣品收集容器中，液滴可經(jīng)受熱循環(huán)。所述液滴也可被破開并且可收集編條形碼核酸。在操作中，本文所述的器件可用于將條形碼銜接模板珠粒和細(xì)胞封裝于水性微流體液滴中，使得各液滴平均含有大約一種珠粒和一種細(xì)胞。各液滴中的珠粒和細(xì)胞的數(shù)目可如所需調(diào)整，例如通過調(diào)節(jié)裝載于所述器件中的溶液中珠粒或細(xì)胞的濃度，或通過調(diào)節(jié)所述三個微流體途徑中的流動速率。包括于各液滴中的試劑允許條形碼銜接分子由所述液滴中的所述一種珠粒酶法產(chǎn)生。這些試劑還允許所述一種細(xì)胞溶解并且允許來自所述細(xì)胞的RNA經(jīng)歷編條形碼反應(yīng)。因此，來自所述細(xì)胞的RNA可在所述液滴內(nèi)編條形碼，并且當(dāng)混合來自多種細(xì)胞的核酸時，源于這些RNA的核酸(并且含有條形碼序列)可稍后追溯到一種細(xì)胞。VII.實施例A.實施例1：在單一反應(yīng)中制造條形碼銜接模板珠粒文庫。使用下文所述的方法以使用乳液PCR產(chǎn)生條形碼銜接模板珠粒文庫，其中執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來連接獨特條形碼銜接模板至各珠粒(參看圖15)。表4：用于在單一反應(yīng)中制造條形碼銜接模板珠粒文庫的寡核苷酸抗生蛋白鏈菌素涂布的M-270(LifeTechnologies)與生物素標(biāo)記的寡核苷酸(“emB_T7bridge2”)偶聯(lián)：1.珠粒通過輕微渦旋再懸浮2.1mLM270珠粒(大約6.7×108個珠粒)放入三個1.5mL微量離心管中的每一者中，總計3mL3.放在磁鐵上持續(xù)3分鐘。4.從各管取出上清液并且再懸浮于1mL(1x體積)結(jié)合/洗滌緩沖液(BWB；1MNaCl、5mMTris、0.5mMEDTA)中5.再重復(fù)步驟4兩次，隨后最終再懸浮于540μL體積BWB中6.60μL100μMemB_T7bridge2添加至珠粒中并且在輕微旋轉(zhuǎn)下孵育15分鐘7.在孵育后，珠粒用1mLBWB緩沖液洗滌3次，并且組合至單一管中8.珠粒在4℃下與0.01％疊氮化鈉一起存儲9.珠粒在使用前用10mMTris洗滌3次條形碼寡核苷酸和正向和反向引物在基于乳液的PCR中添加至來自以上的偶聯(lián)珠粒中：1.以下PCR混合物(3mL總體積)在三個1.5mL微量離心管(VWR目錄號20170-650)中制備：2.制備油-表面活性劑混合物(1mL總體積)：a.礦物油(Sigma)900μLb.EM90(Evonik)100uL3.800μL油-表面活性劑混合物和200μLPCR混合物組合至15個Axygen2.0mLMaxymumRecovery錐形底微量離心管(MCT-200-L-C)中的每一者中。管密封并且振蕩持續(xù)3秒4.管放入QiagenTissueLyzerII中，并且在14Hz下振蕩持續(xù)5分鐘5.所述乳液在VWR96孔PCR板(83007-374)的孔中分配，其中每孔添加160μL乳液6.管使用以下程序進(jìn)行熱循環(huán)：乳液被破乳并且回收珠粒：1.將所述PCR板的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管(VWR20170-650)中，每個管具有不超過0.5mL乳液體積2.100uL1uMemB_T7bridgefree引物添加至各管中3.管用異丁醇終止，密封并且振蕩以充分混合4.管在14,000rpm下離心持續(xù)1min5.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著盡可能抽吸盡可能多的上清液，同時留下沉淀的珠粒6.添加1mL異丁醇，通過上下吸移充分混合，直至剩余油/乳液體積已經(jīng)分散至所述異丁醇中7.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著抽吸所述異丁醇。來自所有管的珠粒通過首先從其中將組合所述珠粒的管抽吸上清液并且接著從另一管轉(zhuǎn)移全部體積，酌留在所述磁鐵處收集所述珠粒的時間，接著抽吸上清液并且重復(fù)而組合至所述單一管中8.添加1mL新鮮異丁醇，充分混合并且擱置60秒9.抽吸異丁醇10.添加1mL100％乙醇，充分混合并且擱置60秒11.抽吸乙醇12.重復(fù)步驟10和1113.添加1mL70％乙醇，充分混合并且擱置60秒14.抽吸乙醇15.重復(fù)步驟13和1416.添加1mLPBS，充分混合并且擱置60秒。17.抽吸PBS18.重復(fù)步驟16和17并入條形碼銜接模板的珠粒接著使用BectonDickensonFACSAriaIII，利用來自并入emB_Rv3反向引物中的AlexaFluor647染料的熒光與未編條形碼珠粒分選。珠粒在4℃下存儲于0.01％疊氮化鈉中以便存儲。注意這一實施例制造具有T7RNAP啟動子序列的條形碼銜接模板珠粒以便由T7RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。通過用其它RNAP啟動子序列置換emB-T7bridge2中的T7RNAP啟動子序列“TAATACGACTCACTATAGG”(SEQIDNO:6)，可使用其它RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，通過用切口核酸內(nèi)切酶位點(如Nt.BbvCI的“CCTCAGC”)置換所述啟動子序列，可使用切口核酸內(nèi)切酶(例如Nt.BbvCI)和鏈置換DNAP(如Klenowexo-)擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，emB-BCbridge2中的“HHHTHHHHTHHHHTHHHTHHHH”(SEQIDNO:3)產(chǎn)生約3.87億種獨特條形碼。當(dāng)這一條形碼文庫用于對甚至例如1千萬種細(xì)胞編條形碼時，僅使用2.5％的所述獨特條形碼。預(yù)期大多數(shù)所述條形碼彼此相距充分距離，使得大多數(shù)來自NextGen測序的條形碼序列讀數(shù)容易彼此區(qū)別(其中一部分讀數(shù)被棄去)，而不考慮PCR和測序誤差。所述乳液可使用所屬領(lǐng)域中已知的多種方法制得，并且在這種情況下使用振蕩方法制得并且所得液滴為多分散的，其中平均液滴直徑為約25μm。條形碼寡核苷酸用正向和反向引物擴(kuò)增并且所述反向引物用熒光標(biāo)簽標(biāo)記，所述熒光標(biāo)簽在這一實施例中為AlexaFluor647，使得并入條形碼銜接模板的珠?？膳c未標(biāo)記珠粒區(qū)別。并入條形碼銜接模板的明亮熒光珠粒接著與暗淡未標(biāo)記珠粒進(jìn)行FACS分選。在這一實施例中的珠粒和條形碼寡核苷酸的規(guī)定濃度下，通過泊松分布將珠粒以平均每個液滴約7個珠粒裝載于液滴中，并且我們觀察到大約28％的液滴含有獨特條形碼寡核苷酸的一種或多種拷貝，而剩余的液滴根本不含條形碼寡核苷酸。在含有至少一種條形碼寡核苷酸的液滴中，約70％應(yīng)精確地含有一種條形碼寡核苷酸，而剩余約30％應(yīng)含有兩種或更多種條形碼。因此，所述條形碼模板銜接珠粒文庫的約70％為單克隆的(每個珠粒一種獨特條形碼序列)并且約30％為多克隆的。下文所述的方法的最終產(chǎn)量為大約1200萬個條形碼銜接模板珠粒，其中約840萬個為單克隆條形碼銜接模板珠粒。并且盡管液滴填充有平均每個液滴約7個珠粒，在破乳所述乳液后，珠粒的產(chǎn)率為約2％?；诙検椒植?，約770萬種獨特條形碼序列存在于這一條形碼銜接模板珠粒文庫中。珠粒和條形碼寡核苷酸的濃度可經(jīng)過調(diào)節(jié)以獲得條形碼銜接模板珠粒文庫，其中存在不同比例的單克隆和多克隆珠粒和不同數(shù)目的獨特條形碼序列。這將允許對來自單細(xì)胞的核酸編條形碼以實現(xiàn)不同比例的核酸經(jīng)由獨特條形碼或獨特條形碼的集合締合至單細(xì)胞，并且還改變從進(jìn)一步分析棄去的編條形碼核酸的百分率。這種條形碼銜接模板珠粒制造方法可優(yōu)化以實現(xiàn)例如90％:10％、99％:1％或任何其它比率的單克隆:多克隆珠粒比率。這種相對于目前約70％:30％比率的改進(jìn)可通過數(shù)種不同方法實現(xiàn)，包括進(jìn)一步稀釋含有所述條形碼序列的寡核苷酸(在這種情況下為emB-BCbridge2)，使得較少拷貝在所述乳液中的液滴中分配，導(dǎo)致封裝于任何給定液滴中的多種條形碼序列的發(fā)生率降低。B.實施例2：在單一反應(yīng)II中制造條形碼銜接模板珠粒文庫。使用下文所述的方法以使用乳液PCR產(chǎn)生條形碼銜接模板珠粒文庫，其中執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來連接獨特條形碼銜接模板至各珠粒(參看圖15)。表5：用于在單一反應(yīng)II中制造條形碼銜接模板珠粒文庫的寡核苷酸抗生蛋白鏈菌素涂布的M-270(LifeTechnologies)與生物素標(biāo)記的寡核苷酸(“emB_T7bridgeIsceI”)偶聯(lián)：1.珠粒通過輕微渦旋再懸浮2.1mLM270珠粒(大約6.7×108個珠粒)放入三個1.5mL微量離心管中的每一者中，總計3mL3.放在磁鐵上持續(xù)3分鐘。4.從各管取出上清液并且再懸浮于1mL(1x體積)結(jié)合/洗滌緩沖液(BWB；1MNaCl、5mMTris、0.5mMEDTA)中5.再重復(fù)步驟4兩次，隨后最終再懸浮于540μL體積BWB中6.60μL100μMemB_T7bridgeIsceI添加至珠粒中并且在輕微旋轉(zhuǎn)下孵育15分鐘7.在孵育后，珠粒用1mLBWB緩沖液洗滌3次，并且組合至單一管中8.珠粒在4℃下與0.01％疊氮化鈉一起存儲9.珠粒在使用前用10mMTris洗滌3次條形碼寡核苷酸和正向和反向引物在基于乳液的PCR中添加至來自以上的偶聯(lián)珠粒中：1.以下PCR混合物(3mL總體積)在三個1.5mL微量離心管(VWR目錄號20170-650)中制備：2.制備油-表面活性劑混合物(1mL總體積)：a.礦物油(Sigma)900μLb.EM90(Evonik)100μL3.800μL油-表面活性劑混合物和200μLPCR混合物組合至15個Axygen2.0mLMaxymumRecovery錐形底微量離心管(MCT-200-L-C)中的每一者中。管密封并且振蕩持續(xù)3秒4.管放入QiagenTissueLyzerII中，并且在14Hz下振蕩持續(xù)5分鐘5.所述乳液在VWR96孔PCR板(83007-374)的孔中分配，其中每孔添加160μL乳液6.管使用以下程序進(jìn)行熱循環(huán)：乳液被破乳并且回收珠粒：1.將所述PCR板的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管(VWR20170-650)中，每個管具有不超過0.5mL乳液體積2.100uL1uMemB_T7bridgefreeIsceI_2引物添加至各管中3.管用異丁醇終止，密封并且振蕩以充分混合4.管在14,000rpm下離心持續(xù)1min5.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著盡可能抽吸盡可能多的上清液，同時留下沉淀的珠粒6.添加1mL異丁醇，通過上下吸移充分混合，直至剩余油/乳液體積已經(jīng)分散至所述異丁醇中7.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著抽吸所述異丁醇。來自所有管的珠粒通過首先從其中將組合所述珠粒的管抽吸上清液并且接著從另一管轉(zhuǎn)移全部體積，酌留在所述磁鐵處收集所述珠粒的時間，接著抽吸上清液并且重復(fù)而組合至所述單一管中8.添加1mL新鮮異丁醇，充分混合并且擱置60秒9.抽吸異丁醇10.添加1mL100％乙醇，充分混合并且擱置60秒11.抽吸乙醇12.重復(fù)步驟10和1113.添加1mL70％乙醇，充分混合并且擱置60秒14.抽吸乙醇15.重復(fù)步驟13和1416.添加1mLPBS，充分混合并且擱置60秒。17.抽吸PBS18.重復(fù)步驟16和17并入條形碼銜接模板的珠粒接著使用BectonDickensonFACSAriaIII，利用來自并入emB_IsceI_RV反向引物中的AlexaFluor647染料的熒光與未編條形碼珠粒分選。珠粒在4℃下存儲于0.01％疊氮化鈉中以便存儲。注意這一實施例制造具有T7RNAP啟動子序列的條形碼銜接模板珠粒以便由T7RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。通過用其它RNAP啟動子序列置換emB-T7bridgeIsceI中的T7RNAP啟動子序列“TAATACGACTCACTATAGG”(SEQIDNO:6)，可使用其它RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，通過用切口核酸內(nèi)切酶位點(如Nt.BbvCI的“CCTCAGC”)置換所述啟動子序列，可使用切口核酸內(nèi)切酶(例如Nt.BbvCI)和鏈置換DNAP(如Klenowexo-)擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，emB-BCbridgeIsceI_2中的“HHHTHHHHTHHHHTHHHTHHHH”(SEQIDNO:3)產(chǎn)生約3.87億種獨特條形碼。當(dāng)這一條形碼文庫用于對甚至例如1千萬種細(xì)胞編條形碼時，僅使用2.5％的所述獨特條形碼。預(yù)期大多數(shù)所述條形碼彼此相距充分距離，使得大多數(shù)來自NextGen測序的條形碼序列讀數(shù)容易彼此區(qū)別(其中一部分讀數(shù)被棄去)，而不考慮PCR和測序誤差。在這一實施例中的珠粒和條形碼寡核苷酸的規(guī)定濃度下，通過泊松分布將珠粒以平均每個液滴約7個珠粒裝載于液滴中，并且我們觀察到大約25％的液滴含有獨特條形碼寡核苷酸的一種或多種拷貝，而剩余的液滴根本不含條形碼寡核苷酸。在含有至少一種條形碼寡核苷酸的液滴中，約75％精確地含有一種條形碼寡核苷酸，而剩余約25％含有兩種或更多種條形碼。因此，所述條形碼模板銜接珠粒文庫的約75％為單克隆的(每個珠粒一種獨特條形碼序列)并且約25％為多克隆的。下文所述的方法的最終產(chǎn)量為大約5千萬個條形碼銜接模板珠粒，其中約3750萬個為單克隆珠粒。盡管液滴填充有平均每個液滴約7個珠粒，在破乳所述乳液后，珠粒的產(chǎn)率為約11％?；诙検椒植?，存在約2800萬個具有獨特條形碼序列的單克隆珠粒。珠粒和條形碼寡核苷酸的濃度可經(jīng)過調(diào)節(jié)以獲得條形碼銜接模板珠粒文庫，其中存在不同比例的單克隆和多克隆珠粒和不同數(shù)目的獨特條形碼序列。這將允許對來自單細(xì)胞的核酸編條形碼以實現(xiàn)不同比例的核酸經(jīng)由獨特條形碼或獨特條形碼的集合締合至單細(xì)胞，并且還改變從進(jìn)一步分析棄去的編條形碼核酸的百分率。C.實施例3：在多步驟中制造條形碼銜接模板珠粒文庫。在這一實施例中，進(jìn)行根據(jù)圖16的反應(yīng)，除了使用僅一種S1、一種W和一種S2條形碼序列。因此，未發(fā)生偶聯(lián)于不同S1序列的珠粒的匯集并且同樣，在聚合酶延伸反應(yīng)以添加W序列至所述S1寡核苷酸中后，珠粒未匯集。這一實施例可容易地擴(kuò)展至根據(jù)圖16簡單地通過具有多種具有獨特條形碼序列的S1-寡核苷酸、W-寡核苷酸和S2-寡核苷酸來進(jìn)行。表6：用于在單一反應(yīng)中制造條形碼銜接模板珠粒文庫的寡核苷酸抗生蛋白鏈菌素涂布的M-270(LifeTechnologies)在個別反應(yīng)中與生物素標(biāo)記的含有S1序列的寡核苷酸偶聯(lián)：1.珠粒通過輕微渦旋再懸浮2.M270珠粒(LifeTechnologies)放在磁鐵上持續(xù)3分鐘。3.從各管取出上清液并且再懸浮于(1x體積)0.5x結(jié)合/洗滌緩沖液(BWB；1MNaCl、5mMTris、0.5mMEDTA)中4.再重復(fù)步驟4兩次，隨后最終再懸浮于BWB緩沖液中5.10μMS1-寡核苷酸添加至珠粒中并且在輕微旋轉(zhuǎn)下孵育15分鐘6.在孵育后，珠粒用BWB緩沖液洗滌3次7.珠粒在4℃下與0.01％疊氮化鈉一起存儲8.珠粒在使用前用10mMTris洗滌3次偶聯(lián)的珠粒接著匯集在一起，并且執(zhí)行使用w-寡核苷酸的延伸反應(yīng)。關(guān)于w延伸反應(yīng)：在55℃下在振蕩孵育器中孵育過夜，在800rpm下振蕩。珠粒匯集并且用1xBWB緩沖液洗滌三次。反義鏈接著在70℃熔融緩沖液(50mMNaCl、10mMTrispH8.0)中熔融。珠粒用磁鐵沉淀并且完全去除上清液，接著珠粒在1mLTE0.1中洗滌三次并且以1mg/20uL再懸浮于TE0.1中。關(guān)于s2延伸反應(yīng)(每250μg珠粒)：S2-寡核苷酸-a與S1+w-a珠粒一起使用，并且S2-寡核苷酸-b與S1+w-b珠粒一起使用。在60℃下孵育10min，接著緩慢冷卻至37℃。在37℃下孵育2小時，在800rpm下振蕩。接著使反應(yīng)冷卻至室溫。接著添加以下：dNTP(NEB)1μL大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)0.1μLKlenow片段(NEB)1μL反應(yīng)在25℃下孵育3小時，在800rpm下振蕩。用1μLdNTP更新每小時反應(yīng)。珠粒匯集并且用1xBWB緩沖液洗滌三次。珠粒在4℃下與0.01％疊氮化鈉一起存儲并且在使用前用10mMTris洗滌3次。條形碼銜接模板珠粒的小等分試樣也用于使用T7RNAP的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中以確定所述珠粒的制造是否成功。如果成功，那么T7RNAP將能夠從存在于s1-寡核苷酸序列中的雙鏈T7啟動子轉(zhuǎn)錄RNA。使用MegascriptT7試劑盒(LifeTechnologies)并且遵循制造商的說明書。5μL反應(yīng)在RNAFlashgel(Lonza)上運行。參看圖20。如由S1、W和S2序列的組合形成的獨特條形碼序列的數(shù)目可如所需增加或降低。例如，如表1中可見，如果獨特條形碼的數(shù)目如通過二項式分布所確定為待編條形碼的細(xì)胞的數(shù)目的約10倍大，那么我們可預(yù)期約10％的細(xì)胞共享同一條形碼并且因此在使核酸彼此生物信息學(xué)連接(這可檢測為超過一種可變基因核酸，如兩個免疫球蛋白重鏈或兩個TCRα鏈彼此締合)期間被棄去。因此，由所述文庫，我們可預(yù)期約90％的編條形碼細(xì)胞用獨特序列成功地編條形碼，使得核酸能夠彼此適當(dāng)信息學(xué)連接。因此，所需的S1x、W和S2y序列的數(shù)目取決于待編條形碼的細(xì)胞的所需數(shù)目。在表7中，預(yù)計W-延伸反應(yīng)在96孔板中發(fā)生，并且使用同一數(shù)目的S1x和S2y序列。如可見，為了對1千萬種細(xì)胞編條形碼，需要至多323種S1x和S2y寡核苷酸和960種Wz寡核苷酸。這些為可管理數(shù)目，尤其當(dāng)所述反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行時，使得有必要總計僅18個96孔板執(zhí)行所述反應(yīng)以制造所需大小的條形碼銜接模板珠粒文庫。表7.獲得足夠大小的條形碼銜接模板文庫以對來自所需數(shù)目的細(xì)胞的核酸編條形碼所需的S1x、Wz和S2y序列的數(shù)目此外，可需要將S1x、S2y和Wz中的條形碼設(shè)計成最小漢明距離隔開，其中這一最小值為2。使用這一最小值，僅使用與所述條形碼序列精確匹配的來自NextGen測序的條形碼序列讀數(shù)；棄去具有誤差的條形碼序列讀數(shù)。如果所用的漢明距離或編輯距離增加至最小值3，那么誤差校正為可能的。注意這一實施例制造具有T7RNAP啟動子序列的條形碼銜接模板珠粒以便由T7RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。通過用其它RNAP啟動子序列置換emB-T7bridge2中的T7RNAP啟動子序列“TAATACGACTCACTATAGG”(SEQIDNO:6)，可使用其它RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，通過用切口核酸內(nèi)切酶位點(如Nt.BbvCI的“CCTCAGC”)置換所述啟動子序列，可使用切口核酸內(nèi)切酶(例如Nt.BbvCI)和鏈置換DNAP(如Klenowexo-)擴(kuò)增條形碼銜接子。D.實施例4：制造水性條形碼銜接模板。在這一實施例中，合成未偶聯(lián)于珠粒的水性條形碼銜接模板以證明本發(fā)明方法的廣泛適用性。如下文所述制備反應(yīng)混合物：反應(yīng)混合物接著以每孔25μL等分試樣至96孔PCR板中并且如下進(jìn)行熱循環(huán)：所得PCR產(chǎn)物為所述條形碼銜接模板，其接著鈍化以去除A懸垂物：NEBuffer2162μL10mMdNTP30μLT4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)2μL2.5μL所述鈍化混合物添加至各25μL反應(yīng)容積中，并且在12℃下孵育15分鐘。1μL250mMEDTA接著添加至各25μL反應(yīng)容積中并且加熱至75℃持續(xù)20分鐘以使所述酶失活。凈化所述反應(yīng)并且定量：1.反應(yīng)接著使用ZymoResearchRNA清潔和濃縮試劑盒遵循制造商說明書匯集并且凈化2.使用Picogreen定量試劑盒(LifeTechnologies)來定量所述DNA并且將條形碼銜接模板濃度調(diào)節(jié)至55ng/uL注意這一實施例制造具有T7RNAP啟動子序列的條形碼銜接模板珠粒以便由T7RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。通過用其它RNAP啟動子序列置換emB-T7bridge2中的T7RNAP啟動子序列“TAATACGACTCACTATAGG”(SEQIDNO:6)，可使用其它RNAP擴(kuò)增條形碼銜接子。另外，通過用切口核酸內(nèi)切酶位點(如Nt.BbvCI的“CCTCAGC”)置換所述啟動子序列，可使用切口核酸內(nèi)切酶(例如Nt.BbvCI)和鏈置換DNAP(如Klenowexo-)擴(kuò)增條形碼銜接子。E.實施例5：添加來自條形碼銜接模板的條形碼至不同反應(yīng)緩沖液中的mRNA中。這一實施例顯示本發(fā)明方法可在多種不同緩沖液中使用。如上文實施例4中所述制造條形碼銜接模板。表8.反應(yīng)緩沖液的組成設(shè)置以下反應(yīng)：使用0.5xMMLV緩沖液以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：在42℃下執(zhí)行來自條形碼銜接模板的條形碼銜接子的T7RNAP線性擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。使用Thermopol緩沖液：以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：在42℃下執(zhí)行來自條形碼銜接模板的條形碼銜接子的T7RNAP線性擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。使用TAE緩沖液：以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：在42℃下執(zhí)行來自條形碼銜接模板的條形碼銜接子的T7RNAP線性擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。所述反應(yīng)接著使用經(jīng)過修改的傳統(tǒng)苯酚/氯仿方法凈化：1.200μLTE0.1(10mMTrispH8.0、0.1mMEDTA)添加至各反應(yīng)混合物中2.200μL苯酚/氯仿/異戊醇(Sigma)添加至各反應(yīng)混合物中并且在預(yù)旋轉(zhuǎn)GelPhaseLock管(5Prime)中劇烈地振蕩3.GelPhaseLock管在14,000g下離心持續(xù)3分鐘并且頂部水性部分被吸移至Amicon100kDa柱(Millipore)中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘4.450μLTE(10mMTris,pH8.0,1mMEDTA)接著被吸移至所述Amicon柱中，并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘5.450μL10mMTris(pH8.0)接著被吸移至所述Amicon柱中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)5分鐘6.所述Amicon柱倒置至新的收集管中并且在1000g下旋轉(zhuǎn)2分鐘以收集含有純化的mRNA/第一鏈cDNA雙鏈體的洗出液接著執(zhí)行兩輪PCR(PCR1和PCR2)：表9.PCR1和PCR2引物序列每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR1Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：來自PCR1的反應(yīng)物接著稀釋50倍并且在3個獨立PCR2反應(yīng)中用作模板，一個反應(yīng)用于κ輕鏈，一個反應(yīng)用于λ輕鏈并且一個反應(yīng)用于γ重鏈。每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR2Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：5μL產(chǎn)物在凝膠上運行(圖21)。如可見，所述編條形碼反應(yīng)在多種含有多種不同離子的不同緩沖液中良好地工作，所述離子如鉀離子、銨離子、氯離子、硫酸根離子和乙酸根離子。F.實施例6：由條形碼銜接模板擴(kuò)增的RNA條形碼銜接子比未擴(kuò)增DNA條形碼銜接子更好地工作。這一實施例顯示本發(fā)明方法可在多種具有不同鹽濃度的不同緩沖液中使用。此外，使用由條形碼銜接模板產(chǎn)生的擴(kuò)增的RNA條形碼銜接子比僅添加DNA條形碼銜接子至所述反應(yīng)中更好地工作(即，產(chǎn)生所需的擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物)，據(jù)推測因為使用RNA條形碼銜接子的反應(yīng)導(dǎo)致較低背景(參看圖4)。如上文實施例4中所述制造條形碼銜接模板。表10.額外寡核苷酸序列設(shè)置以下反應(yīng)并且緩沖液組成如表8中：使用1xMMLV緩沖液以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：在42℃下執(zhí)行來自條形碼銜接模板的條形碼銜接子的T7RNAP線性擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。使用0.5xMMLV緩沖液以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：在42℃下執(zhí)行來自條形碼銜接模板的條形碼銜接子的T7RNAP線性擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。使用DNA條形碼銜接子以上加熱至55℃持續(xù)3分鐘，接著添加以下：Ribolock(ThermoScientific)0.4μLT4gp32(NEB)1μLMaximaH-RTase(ThermoScientific)1μL在42℃下執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄和條形碼添加至第一鏈cDNA中持續(xù)2小時。所述反應(yīng)接著使用經(jīng)過修改的傳統(tǒng)苯酚/氯仿方法凈化：1.將200μLTE0.1(10mMTrispH8.0、0.1mMEDTA)添加至各反應(yīng)混合物中2.將200μL苯酚/氯仿/異戊醇(Sigma)添加至各反應(yīng)混合物中并且在預(yù)旋轉(zhuǎn)GelPhaseLock管(5Prime)中劇烈地振蕩3.GelPhaseLock管在14,000g下離心持續(xù)3分鐘并且頂部水性部分被吸移至Amicon100kDa柱(Millipore)中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘4.450μLTE(10mMTris,pH8.0,1mMEDTA)接著被吸移至所述Amicon柱中，并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘5.450μL10mMTris(pH8.0)接著被吸移至所述Amicon柱中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)5分鐘6.所述Amicon柱倒置至新的收集管中并且在1000g下旋轉(zhuǎn)2分鐘以收集含有純化的mRNA/第一鏈cDNA雙鏈體的洗出液接著執(zhí)行兩輪PCR(PCR1和PCR2)：使用條形碼銜接模板的每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR1Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：使用DNA條形碼銜接子的每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR1Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：來自PCR1的反應(yīng)物接著稀釋50倍并且在3個獨立PCR2反應(yīng)中用作模板，一個反應(yīng)用于κ輕鏈，一個反應(yīng)用于λ輕鏈，并且一個反應(yīng)用于γ重鏈。每個PCR1反應(yīng)設(shè)置以下PCR2Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：5μL產(chǎn)物在凝膠上運行(圖22)。如可見，所述編條形碼反應(yīng)在具有不同鹽濃度的緩沖液中良好地工作。雖然所述反應(yīng)由于所述T7RNAP的鹽敏感性在低鹽緩沖液(0.5xMMLV)中更好地工作，但其也在較高鹽緩沖液(1xMMLV)中工作。注意由于當(dāng)使用DNA條形碼銜接子時在RT步驟期間的非特異性引發(fā)(參考圖4)，存在異常高的背景并且所需條帶模糊。G.實施例7：在使用微流體液滴器件制造的液滴中使用水性條形碼銜接模板對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。使用用于產(chǎn)生單分散乳液的器件來封裝單細(xì)胞連同編條形碼珠粒和編條形碼分析所必需的其它試劑。三個DolomiteP-泵配備有流量傳感器(Dolomite3200016、3200095和3200098)。第一個P-泵經(jīng)由微流體管直接連接于2-Reagent液滴芯片(Dolomite3200287)，所述微流體管并入T形接合點以將線路分成兩個輸入。這是油輸入線路。另兩個P-泵經(jīng)由流體管連接于PEEK樣品環(huán)管，所述環(huán)管纏繞冰箱，所述冰箱用于在所述器件操作時保持樣品冷凍，并且這些環(huán)管各自連接于所述2-Reagent液滴芯片。各樣品環(huán)管在其前端并入四通閥，使得樣品可能借助于注射器裝載于所述環(huán)管中。所述第一樣品環(huán)管填充有細(xì)胞，而所述第二環(huán)管填充有RT/編條形碼/溶解混合物。所述器件配置的實施例如圖17-19中所示。所述冰箱在使用前填充有冰。鼠科動物B220+B細(xì)胞群體進(jìn)行FACS分選并且使用具有10mMNaCl和0.5mg/mlBSA的300mM甜菜堿作為懸浮緩沖液來制備細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞以4,500個細(xì)胞/μL的濃度使用。如下制備RT/水性條形碼混合物：使用注射器將所述細(xì)胞懸浮液裝載于一個樣品環(huán)管中并且將所述RT/編條形碼/溶解混合物裝載于另一樣品環(huán)管中。以使得單一液滴中多種細(xì)胞或條形碼的出現(xiàn)減至最少同時使那些濃度保持足夠高的方式選擇細(xì)胞和條形碼濃度，使得足夠多的細(xì)胞與條形碼一起封裝。轉(zhuǎn)換所述四通閥，使得所述樣品環(huán)管與所述泵在同一條線上，并且所有三個泵均啟動。所述兩個水性輸入以一定速率流動，使得其以1:2(細(xì)胞懸浮液:RT/編條形碼/溶解混合物)比率混合。所述水性和油輸入以一定速率流動，使得形成約50μm直徑的液滴，并且在足夠高的流動速率下流動，使得細(xì)胞流動通過所述器件。在SorensonBioscience0.2mLPCR管中收集乳液。在所述樣品已經(jīng)產(chǎn)生后，其首先進(jìn)行預(yù)加熱步驟(在55℃下3分鐘)并且接著在42℃下孵育2小時以使所述反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。在所述反應(yīng)后，使用下文所述的“破乳非珠粒乳液”方法破乳所述乳液。這制造了純化的cDNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增和測序。如下破乳非珠粒乳液：1.200μLTE、400μL苯酚/氯仿/異戊醇、800μL氯仿吸移至預(yù)旋轉(zhuǎn)GelPhaseLock管中2.各樣品吸移至對應(yīng)的GelPhaseLock管中3.管在14,000g下短暫離心持續(xù)3分鐘4.水層吸移至100kDaAmicon管(Millipore)中。5.管在14,000g下短暫離心持續(xù)3分鐘6.450μLTE吸移至所述Amicon管中7.管在14,000g下短暫離心持續(xù)3分鐘8.450μL10mMTris添加至所述Amicon管中9.管在14,000g下短暫離心持續(xù)5分鐘10.Amicon管倒置放入新鮮收集管中11.管在1,000g下短暫離心持續(xù)2分鐘接著執(zhí)行兩輪PCR(PCR1和PCR2)，除了表9中列出的一些引物序列外還使用以下引物。表11.用于鼠科動物免疫球蛋白基因的PCR的額外引物使用條形碼銜接模板的每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR1Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：來自PCR1的反應(yīng)物接著稀釋50倍并且在3個獨立PCR2反應(yīng)中用作模板，一個反應(yīng)用于κ和λ輕鏈，一個反應(yīng)用于μ重鏈，并且一個反應(yīng)用于γ重鏈。每個PCR1反應(yīng)設(shè)置以下PCR2Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：5μLPCR產(chǎn)物在凝膠上運行(圖23)。對應(yīng)于κ和λ輕鏈以及對應(yīng)于μ重鏈的條帶清楚可見。僅所述μ重鏈擴(kuò)增，因為預(yù)期大多數(shù)B220+B細(xì)胞為IgM+原生B細(xì)胞。因此擴(kuò)增的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可純化并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如但不限于454測序。由于這一實施例使用每個反應(yīng)容器>1個拷貝的濃度的條形碼銜接模板，將獨特條形碼集合而非獨特條形碼并入各反應(yīng)容器中的核酸中。配對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可通過使其共享獨特條形碼集合而非通過獨特條形碼彼此締合。條形碼銜接模板也可在一定濃度下使用，使得通過有限稀釋，大多數(shù)含有條形碼銜接模板的反應(yīng)容器將以每個反應(yīng)容器1個拷貝含有所述條形碼銜接模板。在這種情況下，配對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可通過使其共享獨特條形碼序列彼此締合。H.實施例8：在使用微流體液滴器件制造的液滴中使用條形碼銜接模板珠粒對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。使用如實施例7中所述的產(chǎn)生液滴的微流體器件，其中唯一差異在于所述第一樣品環(huán)管含有細(xì)胞和如實施例1、2或3中制得的條形碼銜接模板珠粒。鼠科動物B220+B細(xì)胞群體進(jìn)行FACS分選并且使用具有10mMNaCl和0.5mg/mlBSA的300mM甜菜堿作為懸浮緩沖液來制備細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒懸浮液。細(xì)胞以4,500個細(xì)胞/μL的濃度包括在內(nèi)并且珠粒以60,000個珠粒/μL的濃度使用。如下制備RT混合物：使用注射器將所述細(xì)胞和編條形碼珠粒懸浮液裝載于一個樣品環(huán)管中并且將所述RT/編條形碼/溶解混合物裝載于另一樣品環(huán)管中。轉(zhuǎn)換所述四通閥，使得所述樣品環(huán)管與所述泵在同一條線上，并且所有三個泵均啟動。所述兩個水性輸入以一定速率流動，使得其以1:2(細(xì)胞和珠粒懸浮液:RT/編條形碼/溶解混合物)比率混合。所述水性和油輸入以一定速率流動，使得形成約50um直徑的液滴，并且在足夠高的流動速率下流動，使得細(xì)胞和珠粒流動通過所述器件。在SorensonBioscience0.2mLPCR管中收集乳液。在所述樣品已經(jīng)產(chǎn)生后，其首先進(jìn)行加熱步驟(在55℃下3分鐘)并且接著在42℃下孵育2小時以使所述RT/編條形碼反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。在所述編條形碼反應(yīng)后，使用實施例7中所述的“破乳非珠粒乳液”方法破乳所述乳液。如實施例7中執(zhí)行后續(xù)PCR反應(yīng)。因此擴(kuò)增的免疫球蛋白重鏈和輕鏈純化并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如但不限于454測序。由于這一實施例以每個反應(yīng)容器約1種珠粒使用條形碼銜接模板珠粒，配對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過其共同使用獨特條形碼序列來配對。I.實施例9：使用用DNA聚合酶由條形碼銜接模板珠粒擴(kuò)增的條形碼銜接子對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。使用如實施例7中所述的產(chǎn)生液滴的微流體器件，其中唯一差異在于所述第一樣品環(huán)管含有細(xì)胞和如實施例1、2或3中制得的條形碼銜接模板珠粒。在這一實施例中，所述條形碼銜接模板珠粒包含5’Nt.BbvCI切口核酸內(nèi)切酶序列而非T7RNAP啟動子序列以允許通過DNA聚合酶擴(kuò)增條形碼銜接子。鼠科動物B220+B細(xì)胞群體進(jìn)行FACS分選并且使用具有10mMNaCl和0.5mg/mlBSA的300mM甜菜堿作為懸浮緩沖液來制備細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒懸浮液。細(xì)胞以4,500個細(xì)胞/uL的濃度包括在內(nèi)并且珠粒以60,000個珠粒/μL的濃度使用。如下制備RT混合物：使用注射器將所述細(xì)胞和編條形碼珠粒懸浮液裝載于一個樣品環(huán)管中并且將所述RT/編條形碼/溶解混合物裝載于另一樣品環(huán)管中。轉(zhuǎn)換所述四通閥，使得所述樣品環(huán)管與所述泵在同一條線上，并且所有三個泵均啟動。所述兩個水性輸入以一定速率流動，使得其以1:2(細(xì)胞和珠粒懸浮液:RT/編條形碼/溶解混合物)比率混合。所述水性和油輸入以一定速率流動，使得形成約50um直徑的液滴，并且在足夠高的流動速率下流動，使得細(xì)胞和珠粒流動通過所述器件。在SorensonBioscience0.2mLPCR管中收集乳液。在所述樣品已經(jīng)產(chǎn)生后，其首先進(jìn)行加熱步驟(在55℃下3分鐘)并且接著在42℃下孵育2小時以使所述RT/編條形碼反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。在所述編條形碼反應(yīng)后，使用實施例7中所述的破乳非珠粒乳液摂方法破乳所述乳液。如實施例7中執(zhí)行后續(xù)PCR反應(yīng)。因此擴(kuò)增的免疫球蛋白重鏈和輕鏈純化并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如但不限于454測序。由于這一實施例以每個反應(yīng)容器約1種珠粒使用條形碼銜接模板珠粒，配對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過其共同使用獨特條形碼序列來配對。J.實施例10：在多孔反應(yīng)容器中使用條形碼銜接模板對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。合成具有如圖1中的組成的條形碼銜接模板，作為來自如IDT的廠商的雙鏈體寡核苷酸。各獨特條形碼銜接模板保持于不同存儲容器中，使得條形碼序列無混合或交叉污染?；罨疊細(xì)胞(成漿細(xì)胞)為使用FACSAriaII(BectonDickenson)分選至10μL溶解緩沖液中進(jìn)入96孔板的所有孔中的單細(xì)胞。各孔中所述緩沖液的組成為：所述板接著在55℃下孵育3分鐘，接著在42℃下孵育2小時用于使所述RT/編條形碼反應(yīng)發(fā)生。96孔板的所有孔中的反應(yīng)接著匯集在一起并且使用經(jīng)過修改的傳統(tǒng)苯酚/氯仿方法執(zhí)行凈化：1.400μL苯酚/氯仿/異戊醇(Sigma)添加至預(yù)旋轉(zhuǎn)GelPhaseLock管(5Prime)中并且劇烈地振蕩2.GelPhaseLock管在14,000g下離心持續(xù)3分鐘并且頂部水性部分被吸移至Amicon100kDa柱(Millipore)中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘3.必要時重復(fù)步驟2以使整個水性容積旋轉(zhuǎn)通過所述Amicon柱4.450μLTE(10mMTris,pH8.0,1mMEDTA)接著被吸移至所述Amicon柱中，并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)3分鐘5.450μL10mMTris(pH8.0)接著被吸移至所述Amicon柱中并且在14,000g下旋轉(zhuǎn)5分鐘6.所述Amicon柱倒置至新的收集管中并且在1000g下旋轉(zhuǎn)2分鐘以收集含有純化的mRNA/第一鏈cDNA雙鏈體的洗出液設(shè)置以下PCR1Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：來自PCR1的反應(yīng)物接著稀釋50倍并且在3個獨立PCR2反應(yīng)中用作模板，一個反應(yīng)用于κ輕鏈，一個反應(yīng)用于λ輕鏈并且一個反應(yīng)用于γ重鏈。設(shè)置以下PCR2Phusion(ThermoScientific)反應(yīng)混合物：因此擴(kuò)增的免疫球蛋白重鏈和輕鏈純化并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如但不限于454測序。由于這一實施例使用單獨地吸移至各反應(yīng)容器(在這種情況下96孔板的孔)中的獨特條形碼銜接模板，配對的免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過其共同使用獨特條形碼序列在生物信息學(xué)上配對。K.實施例11：在使用微流體液滴器件制造的液滴中使用條形碼銜接模板珠粒對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。使用下文所述的方法以使用乳液PCR產(chǎn)生條形碼銜接模板珠粒文庫，其中執(zhí)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來連接獨特條形碼銜接模板至各珠粒(參看圖15)。表12：用于在單一反應(yīng)中制造條形碼銜接模板珠粒文庫的寡核苷酸抗生蛋白鏈菌素涂布的M-270(LifeTechnologies)與生物素標(biāo)記的寡核苷酸(“emB_T7bridgeIsceI”)偶聯(lián)：1.珠粒通過輕微渦旋再懸浮2.1mLM270珠粒(大約2×109個珠粒)放入三個1.5mL微量離心管中的每一者中，總計3mL3.放在磁鐵上持續(xù)3分鐘。4.從各管取出上清液并且再懸浮于1mL(1x體積)結(jié)合/洗滌緩沖液(BWB；1MNaCl、5mMTris、0.5mMEDTA)中5.再重復(fù)步驟4兩次，隨后最終再懸浮于540μL體積BWB中6.60μL100μMemB_T7bridge2添加至珠粒中并且在輕微旋轉(zhuǎn)下孵育15分鐘7.在孵育后，珠粒用1mLBWB緩沖液洗滌3次，并且組合至單一管中8.珠粒在4℃下與0.01％疊氮化鈉一起存儲9.珠粒在使用前用10mMTris洗滌3次條形碼寡核苷酸和正向和反向引物在基于乳液的PCR中添加至來自以上的偶聯(lián)珠粒中：1.以下PCR混合物(3mL總體積)在三個1.5mL微量離心管(VWR目錄號20170-650)中制備：2.制備油-表面活性劑混合物(20mL總體積)：a.礦物油(Sigma)18.4mLb.EM90(Evonik)1.6mL3.800μL油-表面活性劑混合物和200μLPCR混合物組合至12個Axygen2.0mLMaxymumRecovery錐形底微量離心管(MCT-200-L-C)中的每一者中。管密封并且振蕩持續(xù)3秒4.管放入QiagenTissueLyzerII中，并且在14Hz下振蕩持續(xù)5分鐘5.所述乳液在VWR96孔PCR板(83007-374)的孔中分配，其中每孔添加160μL乳液6.管使用以下程序進(jìn)行熱循環(huán)：乳液被破乳并且回收珠粒：1.將所述PCR板的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管(VWR20170-650)中，每個管具有不超過0.5mL乳液體積2.100uL1uMemB_T7bridgefreeIsceI_2引物添加至各管中3.管用異丁醇終止，密封并且振蕩以充分混合4.管在14,000rpm下離心持續(xù)1min5.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著盡可能抽吸盡可能多的上清液，同時留下沉淀的珠粒6.添加1mL異丁醇，通過上下吸移充分混合，直至剩余油/乳液體積已經(jīng)分散至所述異丁醇中7.管放在磁條上以將所述珠粒吸引至所述管的側(cè)面，接著抽吸所述異丁醇。來自所有管的珠粒通過首先從其中將組合所述珠粒的單一管抽吸上清液并且接著從另一管轉(zhuǎn)移全部體積，酌留在所述磁鐵處收集所述珠粒的時間，接著抽吸上清液并且重復(fù)而組合至所述單一管中8.添加1mL新鮮異丁醇，充分混合并且擱置60秒9.抽吸異丁醇10.添加1mL100％乙醇，充分混合并且擱置60秒11.抽吸乙醇12.重復(fù)步驟10和1113.添加1mL70％乙醇，充分混合并且擱置60秒14.抽吸乙醇15.重復(fù)步驟13和1416.添加1mLPBS，充分混合并且擱置60秒。17.抽吸PBS18.重復(fù)步驟16和17。并入條形碼銜接模板的珠粒接著使用BectonDickensonFACSAriaIII，利用來自并入emB_IsceI_RV反向引物中的AlexaFluor647染料的熒光與未編條形碼珠粒分選。珠粒在4℃下存儲于0.01％疊氮化鈉中以便存儲。使用圖17-19中所示并且實施例7中所述的微流體器件封裝單細(xì)胞連同編條形碼珠粒和編條形碼分析所必需的其它試劑。CD19+IgG+記憶B細(xì)胞群體進(jìn)行FACS分選并且在完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基(IMDM+10％FBS+100U/mLIL-2、50ng/mLIL-21、50ng/mLCD40L、5μg/mL抗CD40LmAb和1xNormocin)中培養(yǎng)6天，接著使用具有10mMNaCl和0.5mg/mlBSA的300mM甜菜堿作為懸浮緩沖液來制備細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞以2,500個細(xì)胞/μL的濃度使用并且編條形碼珠粒以100,000個珠粒/μL的濃度使用。如下制備RT/水性條形碼混合物：使用注射器將所述細(xì)胞和珠粒懸浮液裝載于一個樣品環(huán)管中并且將所述RT/編條形碼/溶解混合物裝載于另一樣品環(huán)管中。以使得單一液滴中多種細(xì)胞或條形碼的出現(xiàn)減至最少同時使那些濃度保持足夠高的方式選擇細(xì)胞和珠粒濃度，使得足夠多的細(xì)胞與珠粒一起封裝，謹(jǐn)記細(xì)胞和珠粒不會以與所述懸浮流體相同的速率遷移通過所述管，從而有效地引起稀釋。轉(zhuǎn)換所述四通閥，使得所述樣品環(huán)管與所述泵在同一條線上，并且所有三個泵均啟動。所述兩個水性輸入以一定速率流動，使得其以1:2(細(xì)胞懸浮液:RT/編條形碼/溶解混合物)比率混合。所述水性和油輸入以一定速率流動，使得形成約150μm直徑的液滴，尤其1μL/min(細(xì)胞/珠粒懸浮液線路)、2μL/min(RT混合物線路)、3μL/min(油線路)。在SorensonBioscience0.2mLPCR管中收集乳液。在所述樣品已經(jīng)產(chǎn)生后，其首先進(jìn)行預(yù)加熱步驟(在50℃下3分鐘)并且接著在42℃下孵育2小時以使所述反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。在所述反應(yīng)后，使用下文所述的方案破乳所述乳液。這制造了純化的cDNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增和測序。使用以下程序來破乳所述乳液并且回收產(chǎn)物：1.Phaselock管(5Prime)短暫離心以將凝膠推動至底部。2.樣品和200μLTE緩沖液、400μL苯酚氯仿混合物、800μL氯仿添加至各鎖相管中。3.管在14,000g下短暫離心持續(xù)3分鐘4.水層轉(zhuǎn)移至第二預(yù)旋轉(zhuǎn)鎖相管中并且添加相等體積的苯酚氯仿5.管在14,000g下短暫離心持續(xù)3分鐘6.450μLTE添加至所述Amicon過濾器中7.重復(fù)步驟5和68.450μL10mMTris添加至所述Amicon過濾器中9.重復(fù)步驟510.各過濾裝置接著倒置放入新的收集管中11.管在1000g下旋轉(zhuǎn)2分鐘，并且凈化的樣品旋轉(zhuǎn)至所述收集管中接著執(zhí)行兩輪PCR(PCR1和PCR2)，除了表13中列出的一些引物序列外還使用以下引物。表13：使用條形碼銜接模板的每個RT反應(yīng)設(shè)置以下PCR1Q5(NEB)反應(yīng)混合物：來自PCR1的反應(yīng)物接著在10mMTris-HCl(pH8.0)中稀釋25倍并且在兩個獨立PCR2反應(yīng)中用作模板，一個反應(yīng)用于κ和λ輕鏈并且一個反應(yīng)用于γ重鏈。每個PCR1反應(yīng)設(shè)置以下PCR2Q5(NEB)反應(yīng)混合物：10μLPCR產(chǎn)物在凝膠上運行(圖24)。對應(yīng)于κ和λ輕鏈以及對應(yīng)于γ重鏈的條帶清楚可見。獨立地對重鏈和輕鏈擴(kuò)增子執(zhí)行兩種4循環(huán)PCR反應(yīng)以添加454LibA測序銜接子。在LibPCR1中，“A”銜接子添加至所述擴(kuò)增子的5’端，并且“B”銜接子添加至3’端；并且在LibPCR2中反之亦然。LibPCR細(xì)節(jié)如下，其中Lib1-FR引物混合物用于LibPCR1中并且Lib2-FR混合物用于LibPCR2中，并且所述引物列于表14中。表14：接著使用Ampure(BeckmanCoulter)珠粒凈化根據(jù)制造商的說明書使用0.68:1的珠粒:DNA比率并且使用凝膠純化使用FlashgelRecoverygel(Lonza)根據(jù)制造商的說明書純化擴(kuò)增子。接著使用KapaqPCR文庫定量(KAPA)根據(jù)制造商的說明書定量擴(kuò)增子，并且接著將適量的重鏈和輕鏈擴(kuò)增子文庫用于454乳液PCR，并且破乳所述乳液并且將克隆擴(kuò)增的454珠粒裝載至454測序儀上用于根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行測序。由于A和B銜接子添加至所述擴(kuò)增子的5’和3’端，我們能夠由兩種方向測序并且獲得正向和反向讀數(shù)。由標(biāo)準(zhǔn)454運行產(chǎn)生序列，并且分析所得序列，不過也可能已經(jīng)使用了其它下一代測序平臺。通過寫入計算機程序來分析序列。所述計算機程序?qū)碜?54皮升滴定板的區(qū)域的序列讀數(shù)執(zhí)行以下步驟。區(qū)域1序列源于如上文所述產(chǎn)生的重鏈文庫。區(qū)域2序列源于如上文所述產(chǎn)生的輕鏈文庫。關(guān)于各讀數(shù)，用計算機計算兩個全局-局部比對以確定隨后與來自表15的序列T2’和T1匹配的鏈。所述全局-局部比對對匹配計分為0、錯誤匹配為-1并且使用間隙開放罰分和間隙延伸罰分-1。分?jǐn)?shù)需要大于-4或棄去讀數(shù)。關(guān)于重鏈區(qū)，841×103個讀數(shù)中的611×103個讀數(shù)滿足比對分?jǐn)?shù)限制。關(guān)于輕鏈區(qū)，856×103個讀數(shù)中的617×103個讀數(shù)滿足比對分?jǐn)?shù)限制?；谒鋈?局部比對，從所述讀數(shù)推斷出所述DNA條形碼的序列。關(guān)于滿足所述比對分?jǐn)?shù)限制的重鏈區(qū)讀數(shù)，397×103個讀數(shù)具有與預(yù)期模式一致的條形碼序列并且被指定具有所觀察的條形碼。關(guān)于滿足所述比對分?jǐn)?shù)限制的輕鏈區(qū)讀數(shù)，437×103個讀數(shù)具有與預(yù)期模式一致的條形碼序列并且被指定具有所觀察的條形碼。具有同一DNA條形碼序列的讀數(shù)被分在一組用于組裝。具有同一條形碼的讀數(shù)的分組使用newbler(454組裝器)組裝。關(guān)于與區(qū)域2序列具有同一條形碼序列的區(qū)域1序列的組裝共有序列被分組至重鏈和輕鏈對集合中。所述重鏈和輕鏈對集合含有源于存在于乳液RT泡沫中的一個或多個B細(xì)胞的重鏈和輕鏈序列。在所述重鏈和輕鏈讀數(shù)對集合中，2,551對具有至少10個來自所述重鏈區(qū)的讀數(shù)和至少10個來自所述輕鏈區(qū)的讀數(shù)。在2,551個所述對中，1,820對已經(jīng)組裝至精確地一個重鏈和精確地一個輕鏈。發(fā)現(xiàn)那些對中的61對具有在所產(chǎn)生的序列的整個數(shù)據(jù)集中獨特的重鏈和輕鏈。由具有共有條形碼“GCCGACCACGGCACAAGCGCCGAAAAT”(SEQIDNO:124)的編條形碼重鏈和輕鏈讀數(shù)產(chǎn)生的配對的重鏈和輕鏈序列的實例為“MEFGLSWLFLVAILKGVQCGVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAGSQFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDGYRIQYADSVEGRFSISRDNSNNMVYLQMTSLRAEDTAVYFCAKDLFPRTIGYFDYWGQGTRVTVSS”(SEQIDNO:125)(重鏈氨基酸序列)和“MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGKIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISINLAWYQHKPGQAPRLLIYGASTRATAIPARFSGSVSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPRTFGQGTKVEI”(SEQIDNO:126)(輕鏈氨基酸序列)。所述分析證明締合來自B細(xì)胞的重鏈序列與來自B細(xì)胞的對應(yīng)的輕鏈序列的能力。表15：用于鑒別來自B細(xì)胞的讀數(shù)中的DNA條形碼的序列L.實施例12：在使用微流體液滴器件制造的液滴中使用條形碼銜接模板珠粒對來自細(xì)胞的核酸編條形碼。這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。如實施例11中制備條形碼銜接模板珠粒文庫，除了emB_BCbridgeISceI_2用emB_BCbridgeISceI_N置換并且emB_IsceI_RV用emB_ISceI_RV_n置換。emB_ISceI_RV_n含有獨特分子識別符(UMI)，使得當(dāng)制備時，所述條形碼銜接模板珠粒文庫將包含各自具有獨特樣品條形碼和隨機H(A、C、T核苷酸)八聚體UMI的珠粒以對具有不同UMI的個別mRNA分子編條形碼。表16：用于在單一反應(yīng)中制造具有樣品條形碼和UMI的條形碼銜接模板珠粒文庫的額外寡核苷酸細(xì)胞連同珠粒被封裝于液滴中用于如實施例11所述的編條形碼反應(yīng)，其中唯一差異在于使用PBMC而非活化記憶B細(xì)胞，并且所用的寡聚(dT)為寡聚dT_n，其中所述序列為CACGACCGGTGCTCGATTTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQIDNO:50)。所述乳液接著如實施例11所述被破乳。接著執(zhí)行一輪PCR，使用以下引物：表17：每個反應(yīng)使用以下PCRQ5(NEB)反應(yīng)混合物，并且設(shè)置多種反應(yīng)，并且各反應(yīng)循環(huán)持續(xù)從15-26個循環(huán)的不同數(shù)目的循環(huán)以發(fā)現(xiàn)最佳循環(huán)數(shù)來使用：5μLPCR產(chǎn)物在凝膠上運行并且在后續(xù)下游步驟中使用產(chǎn)生良好產(chǎn)物量但未過度循環(huán)的循環(huán)數(shù)。接著根據(jù)Illumina的配對末端測序試劑盒制備產(chǎn)物并且在Illumina高通量測序儀上對正向末端測序，不過也可能已經(jīng)使用其它測序平臺。產(chǎn)生并且分析序列。接著使用樣品條形碼對個別細(xì)胞指定讀數(shù)，并且接著使用UMI以使用所屬領(lǐng)域中充分確立的方法執(zhí)行單細(xì)胞RNA測序分析(NatMethods.2014年2月；11(2):163-6.doi:10.1038/nmeth.2772.2013年12月22日電子出版)。M.實施例13：使用組合產(chǎn)生的條形碼的條形碼銜接模板合成在這一實施例中合成條形碼銜接模板珠粒文庫。由兩種寡核苷酸BC_部分1_有義和BC_部分2_類型(1、2或3)_反義組合產(chǎn)生含條形碼寡核苷酸(如在圖15中)。各BC_部分1_有義和BC_部分2_類型(1、2或3)_反義寡核苷酸分別含有獨特序列“條形碼部分1”和“條形碼部分2”。這些組合的序列產(chǎn)生獨特條形碼序列。根據(jù)GeneralizedDNAbarcodedesignbasedonHammingcodes,Bystrykh2012PLoSOne.20127:e36852的方法，“條形碼部分1”和“條形碼部分2”分別為(16,11)和(12,7)漢明碼。因此，因此設(shè)計的條形碼為誤差校正的。BC_部分2寡核苷酸還分為三種類型BC_部分2_類型1_反義、BC_部分2_類型2_反義和BC_部分2_類型3_反義。這允許用3種不同的非錯誤引發(fā)反向引物(Rv_類型1、Rv_類型2和Rv_類型3)擴(kuò)增產(chǎn)生條形碼銜接模板。當(dāng)那些反向引物各自共價偶聯(lián)于不同熒光團(tuán)時，可經(jīng)由在不同顏色中的熒光鑒別產(chǎn)生的條形碼銜接模板珠粒。另外，具有超過一種類型的條形碼類型的條形碼銜接模板珠粒將在超過一種顏色中發(fā)熒光。由于這一實施例中的條形碼銜接模板珠粒是在emPCR中制得，利用有限稀釋將具有一種含條形碼寡核苷酸的珠粒與所需引物一起放入液滴中。泊松統(tǒng)計學(xué)指示小百分率的液滴將含有超過一種含條形碼寡核苷酸，有效產(chǎn)生非單碼條形碼銜接模板珠粒。通過具有不同類型的在不同顏色中發(fā)熒光的條形碼銜接模板珠粒，隨后對單色珠粒的FACS分選將極大地增加經(jīng)由條形碼銜接模板珠粒的emPCR產(chǎn)生獲得的單碼珠粒的百分率。表18.組合產(chǎn)生的條形碼-序列[條形碼部分1]＝SEQIDNO:127-45126；[條形碼部分2]＝SEQIDNO:45127-47561。含條形碼寡核苷酸是使用表19中的條件和以下熱循環(huán)條件PCR產(chǎn)生的：94℃持續(xù)2min，隨后53℃持續(xù)2小時，94℃持續(xù)15s、53℃持續(xù)30s和68℃持續(xù)20s的7個循環(huán)，接著其后為68℃持續(xù)1min和10℃保持。所述反應(yīng)使用ZymoDNA凈化和濃縮試劑盒凈化并且用Qubit(LifeTechnologies)定量濃度。表19.用于制造含條形碼寡核苷酸的反應(yīng)混合物含條形碼寡核苷酸的82bp大小在凝膠上確認(rèn)(圖25，左上部)。9.8μmSuperAvidin微球珠粒(Bang’sLab)與生物素標(biāo)記的SAV-珠粒-連接子寡核苷酸偶聯(lián)。1500萬個珠粒與60μL10μM寡核苷酸一起孵育1小時，并且接著用BWB緩沖液(1MNaCl于TE中)洗滌3次，隨后在10mMTris中洗滌3次以產(chǎn)生偶聯(lián)的SAV_珠粒_連接子珠粒。產(chǎn)生條形碼銜接模板珠粒的emPCR如下繼續(xù)進(jìn)行：表20.用于制造條形碼銜接模板珠粒的反應(yīng)混合物通過振蕩乳液油與表20中的反應(yīng)混合物產(chǎn)生乳液。所述乳液油制劑為10mLAR20硅油(Sigma)、7.5mL7225CFormulationAid(DowCorning)、7.5mL0749Resin(DowCorning)和0.1％TritonX-100(Sigma)。12mL乳液油與4mL模擬混合物(無表20中的反應(yīng)混合物的寡核苷酸、引物和酶)一起在30Hz下在TissueLyser(Qiagen)中振蕩持續(xù)5min，并且接著在添加4mL反應(yīng)混合物后在12Hz下振蕩持續(xù)5min。這產(chǎn)生直徑在30-80um之間的較大液滴的大多數(shù)。熱循環(huán)條件為：通過用破乳混合物1洗滌，隨后用破乳混合物2洗滌，隨后70％乙醇洗滌和TE洗滌來破乳乳液。珠粒再懸浮于具有0.001％Tween20的TE中。珠粒在BDFACSJazz上運行并且分選明亮、單色珠粒(圖25，右部)。進(jìn)行如實施例14中執(zhí)行的編條形碼反應(yīng)以驗證所述珠粒適用作用于對RNA編條形碼的條形碼銜接子，除了所述反應(yīng)在開放PCR中用PCR管中的多種珠粒并且用純化的PBMCRNA進(jìn)行。如圖25左下部中，獲得條帶，其顯示珠粒確實適用作用于對RNA編條形碼的條形碼銜接模板。N.實施例14：使用不同體積的液滴中的條形碼銜接模板珠粒對來自T細(xì)胞的核酸編條形碼冷凍保存的PBMC解凍并且在AIMV培養(yǎng)基(LifeTechnology)中以3百萬個細(xì)胞/mL的密度孵育過夜。T細(xì)胞接著使用CD3微珠粒(MiltenyiBiotec)根據(jù)制造商的說明書用磁激活細(xì)胞分選(MACS)分離。簡單地說，T細(xì)胞在300g下離心持續(xù)10分鐘，并且在4℃下在含有20％CD3微珠粒的MACS緩沖液(2％胎牛血清和2mMEDTA于1XPBS中)中懸浮持續(xù)15分鐘。磁性標(biāo)記的T細(xì)胞接著使用磁性分離柱分離，隨后用1X伊屋諾霉素和1X佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸(PMA)共刺激持續(xù)3小時。在去除所述含有兩種刺激物的培養(yǎng)基后，細(xì)胞與作為抗凝集劑的1XDNA酶(Sigma)一起孵育15分鐘。使細(xì)胞離心以去除含有DNA酶的上清液，并且用含有5％1MNaCl、1.5％500mMEDTA、33.8％4M甜菜堿和7.5％20mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的細(xì)胞懸浮緩沖液(CSB)洗滌3次。在再懸浮于1mLCSB中之后，細(xì)胞還用40μm細(xì)胞過濾器(BDFalcon)過濾以去除細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞懸浮液接著如實施例8中在液滴發(fā)生器器件中運行以將細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒封裝至液滴中，其中所述珠粒如實施例13中產(chǎn)生。在這一實施例中，細(xì)胞和珠粒封裝至不同大小的液滴中：1.4、3.1和5.6nL。含有細(xì)胞和條形碼的液滴通過在以下最終反應(yīng)緩沖液組合物中在50℃下孵育3分鐘，隨后在42℃下孵育3小時而進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：RT反應(yīng)混合物所述乳液接著用苯酚/氯仿混合物破乳并且如實施例8中在Amicon100kDa柱(Millipore)中濃縮。cDNA經(jīng)受PCR1的18個循環(huán)，隨后使用下文列出的每個RT反應(yīng)的反應(yīng)混合物和表21中列出的熱循環(huán)條件進(jìn)行PCR2。所用引物在表22中。表21.PCR1和PCR2的熱循環(huán)條件表22.PCR1和PCR2的引物序列[i5指數(shù)引物]＝SEQIDNO:47562-47605。如由圖26可見，在所測試的3種液滴容積處，所述反應(yīng)成功地完成。O.實施例15：擴(kuò)增來自編條形碼核酸的TCRα和β基因并且測序編條形碼T細(xì)胞cDNA如實施例14中所述產(chǎn)生。簡單地說，PBMC用1X伊屋諾霉素和PMA在AIMV培養(yǎng)基中共刺激持續(xù)3小時。表達(dá)CD3、CD4或CD8的T細(xì)胞經(jīng)過磁性標(biāo)記并且單獨地使用MACS試劑盒(MiltenyiBiotec)分離并且穿過液體器件以封裝細(xì)胞與如實施例13中產(chǎn)生的條形碼銜接模板珠粒。含有細(xì)胞和條形碼的乳液在50℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3分鐘并且在42℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3小時。所述乳液接著用苯酚/氯仿混合物破乳并且使用Amicon100kDa柱(Millipore)濃縮。反轉(zhuǎn)錄和PCR1和PCR2如實施例14中執(zhí)行，其中不同的指數(shù)_sID引物用于各樣品，各引物具有獨特指數(shù)ID條形碼。這允許在相同下一代測序運行中進(jìn)行樣品的匯集和多路復(fù)用，其中不同樣品經(jīng)由所述指數(shù)ID條形碼彼此區(qū)別。PCR2產(chǎn)物接著用AMPure磁性珠粒(Roche)根據(jù)制造商說明書以1μlPCR2產(chǎn)物:1.8μl磁性珠粒的比率濃縮。樣品接著準(zhǔn)備使用額外文庫PCR用于Illumina測序以添加用于Illumina測序的銜接子。所用引物列于表23中。用于文庫PCR的熱循環(huán)條件表23.用于文庫PCR擴(kuò)增的引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物用PippinPrep和DNA純化和濃縮試劑盒(ZymoResearch)清潔以去除小片段并且用瓊脂糖凝膠電泳(圖27)分析，并且使用Illumina測序來測序。分析來自Illumina測序的配對末端讀數(shù)以確定T細(xì)胞受體(TCR)生殖系TCRCDR3并且推斷全長序列。測序產(chǎn)生21,207,225個已過濾的配對末端讀數(shù)。所述DNA條形碼用于基于正向讀數(shù)序列向個別T細(xì)胞內(nèi)的TCR的轉(zhuǎn)錄物指定配對讀數(shù)。所述正向讀數(shù)內(nèi)所述DNA條形碼的鑒別使用python腳本進(jìn)行。關(guān)于各正向讀數(shù)，與固定序列1的編輯距離使用全局/局部比對計算。需要2或更小的編輯距離或棄去所述讀數(shù)對。根據(jù)固定序列1的位置和條形碼部分1(BC1)和條形碼部分2(BC2)的已知長度，從所述正向讀數(shù)推斷出候選BC1和BC2序列。檢查BC1和BC2以驗證其分別滿足用于漢明(16,11)或漢明(12,7)DNA條形碼的漢明條件(關(guān)于指定序列的序列和彼此的相對位置參看表18)?；贐C1和BC2，向特異性T細(xì)胞指定配對讀數(shù)。結(jié)果，向T細(xì)胞指定3,712,013個讀數(shù)對。向T細(xì)胞指定的配對讀數(shù)接著使用程序blastn以10-5的e值截止與V、J和恒定生殖系TCR序列的已知變體進(jìn)行比較。如果所述對的任一讀數(shù)由blast計分為對生殖系的一次碰撞，那么所述生殖系和相關(guān)等位基因的計數(shù)關(guān)于(由BC1、BC2鑒別的細(xì)胞的)對應(yīng)的TCRα或β鏈的增量為一。除了關(guān)于各生殖系等位基因組合和特異性細(xì)胞，還計分對其造成一次碰撞的序列的清單。關(guān)于由BC1和BC2的獨特組合鑒別的各細(xì)胞，接著基于上文指示的計數(shù)的大多數(shù)指定關(guān)于α和β鏈的v、j和/或恒定生殖系等位基因組成，并且關(guān)于各生殖系，選擇具有與其締合的最長HSP的序列作為所述轉(zhuǎn)錄物中關(guān)于所述生殖系的代表性部分。接著，使用以下步驟確定CDR3區(qū)的組成。關(guān)于各j生殖系，可能時確定滿足模式FG*G的4種氨基酸(AA)的序列的位置，并且鑒別在其序列的最后10個AA中具有CA的組合的v生殖系的清單。關(guān)于各細(xì)胞，在關(guān)于j翻譯的代表性序列的所有三個框中探尋j生殖系的4種AA的模式和所述CA組合。所述CDR3被確定為在CA與所述4種AA的模式之間的AA序列。所述TCR的推定AA序列通過組合v生殖系的AA序列直至CA，隨后組合所述CDR3序列，隨后組合由所述4種AA的模式開始的j生殖系的AA序列來獲得。使用類似方法，確定所述CDR3的核苷酸序列和所述TCR的推定全長核苷酸序列。通過基于D生殖系與所述CDR3的核苷酸序列之間的全局-局部比對評估編輯距離來分析所述D生殖系和D等位基因。向所述TCR指定D生殖系/等位基因，限制條件是與最接近生殖系序列的編輯距離小于或等于2。表24顯示關(guān)于經(jīng)過處理的樣品的概述統(tǒng)計學(xué)，包括編條形碼細(xì)胞、具有指定的TCRα或β鏈的細(xì)胞、具有指定的TCRα和β的細(xì)胞的估計數(shù)目，和推斷的全長α或β鏈的數(shù)目。表24.TCRα和β鏈P.實施例16：擴(kuò)增來自編條形碼核酸的細(xì)胞亞型特異性基因并且測序編條形碼T細(xì)胞cDNA如實施例15中所述產(chǎn)生。簡單地說，PBMC用1X伊屋諾霉素和PMA在AIMV培養(yǎng)基中共刺激持續(xù)3小時。表達(dá)CD3、CD4或CD8的T細(xì)胞經(jīng)過磁性標(biāo)記并且單獨地使用MACS試劑盒(MiltenyiBiotec)分離并且穿過液體器件。含有細(xì)胞和條形碼的乳液如實施例14中在50℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3分鐘并且在42℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3小時。所述乳液接著用苯酚/氯仿混合物破乳并且使用Amicon100kDa柱(Millipore)濃縮。接著使用表21中的熱循環(huán)條件，連同如表25中列出的關(guān)于T細(xì)胞靶向子集基因(例如CD4、CD8和干擾素γ(IFNγ))的特異性引物執(zhí)行在不同循環(huán)下的PCR1和PCR2。反應(yīng)混合物制備如下：表25.除了用于PCR1和PCR2中的序列以外用于PCR1和PCR2的T細(xì)胞靶向基因反向引物序列。PCR2產(chǎn)物接著準(zhǔn)備如實施例15中用于Illumina測序，并且所述產(chǎn)物在Illumina測序之前用瓊脂糖凝膠電泳(圖27)分析。分析來自Illumina測序的配對末端讀數(shù)以基于基因特異性標(biāo)記物確定T細(xì)胞亞型。測序產(chǎn)生19,205,611個已過濾的配對末端讀數(shù)。所述DNA條形碼用于基于正向讀數(shù)序列向個別T細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄物指定配對讀數(shù)。所述正向讀數(shù)內(nèi)所述DNA條形碼的鑒別使用python腳本進(jìn)行。關(guān)于各正向讀數(shù)，與固定序列1的編輯距離使用全局/局部比對計算。需要2或更小的編輯距離或棄去所述讀數(shù)對。根據(jù)固定序列1的位置和條形碼部分1(BC1)和條形碼部分2(BC2)的已知長度，從所述正向讀數(shù)推斷出候選BC1和BC2序列。檢查BC1和BC2以驗證其分別滿足用于漢明(16,11)或漢明(12,7)DNA條形碼的漢明條件。關(guān)于滿足所述漢明條件的正向讀數(shù)，基于X、固定序列2和分子條形碼的已知長度推斷出候選分子條形碼(關(guān)于指定序列的序列和彼此的相對位置參看表18)。如果所述分子條形碼序列無“C”核苷酸，那么向T細(xì)胞(基于BC1和BC2)和所述T細(xì)胞內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)錄物(基于所述分子條形碼)指定配對讀數(shù)。向個別T細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄物指定3,902,569個讀數(shù)對。向T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物指定的配對讀數(shù)接著使用程序blastn以10-6的e值截止并且設(shè)定百分率_同一性至98與標(biāo)記物基因的已知剪切變體進(jìn)行比較。如果所述對的任一讀數(shù)由blast計分為一次碰撞，那么來自所述T細(xì)胞的對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物(由BC1、BC2和所述分子條形碼鑒別)與所述標(biāo)記物基因建立聯(lián)系。關(guān)于由BC1和BC2的獨特組合鑒別的各細(xì)胞，通過對由與給定標(biāo)記物基因相關(guān)的讀數(shù)對觀察到的不同分子條形碼的數(shù)目計數(shù)來確定可見來自所述給定標(biāo)記物基因的轉(zhuǎn)錄物的不同次數(shù)?；谒鰳?biāo)記物基因確定檢測到的各類型的T細(xì)胞的數(shù)目。將其中確定至少一個CD4轉(zhuǎn)錄物和一個IFNγ轉(zhuǎn)錄物被指定的T細(xì)胞計數(shù)為Th1細(xì)胞。將其中確定至少一個CD4轉(zhuǎn)錄物被指定并且無IFNγ轉(zhuǎn)錄物被指定的T細(xì)胞計數(shù)為非Th1CD4樣品。將其中確定至少一個CD8轉(zhuǎn)錄物和一個IFNγ轉(zhuǎn)錄物被鑒別的T細(xì)胞計數(shù)為IFNγ+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。將其中確定至少一個CD8轉(zhuǎn)錄物和無IFNγ轉(zhuǎn)錄物被指定的T細(xì)胞計數(shù)為IFNγ-細(xì)胞毒性T細(xì)胞。表26顯示檢測到的CD4T細(xì)胞的總數(shù)，Th1CD4T細(xì)胞、總的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和IFNγ+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)目通過使用此處所述的程序處理三種不同樣品產(chǎn)生。表26.子集概述。對象CD4CD4Th1IFNγ-CD8IFNγ+CD8SBJCT3190310SBJCT4261431SBJCT5280262Q.實施例17：執(zhí)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)編條形碼T細(xì)胞cDNA如實施例15中所述產(chǎn)生。簡單地說，PBMC用1X伊屋諾霉素和PMA在AIMV培養(yǎng)基中共刺激持續(xù)3小時。表達(dá)CD3、CD4或CD8的T細(xì)胞經(jīng)過磁性標(biāo)記并且單獨地使用MACS試劑盒(MiltenyiBiotec)分離并且穿過液體器件。含有細(xì)胞和條形碼的乳液如實施例14中在50℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3分鐘并且在42℃下反轉(zhuǎn)錄持續(xù)3小時。所述乳液接著用苯酚/氯仿混合物破乳并且使用Amicon100kDa柱(Millipore)濃縮。執(zhí)行單一輪的PCR以擴(kuò)增整個轉(zhuǎn)錄組，條件顯示如下：整個轉(zhuǎn)錄組PCR條件H2O28.525μL5xQ5緩沖液12μLMg++0.375μLDMSO2.4μLdNTP1.25μL指數(shù)sID(2.5μM)5.00μLPCR1_短_n_v2(10μM)1.25μLPCR1-RV-N-v2(10μM)1.25μLET-SSB0.625μLBSA0.625μLTipp1.2μLQ5酶0.5μL模板5μL總計60μL熱循環(huán)條件使用PCR的5個循環(huán)，在與上文相同的PCR條件和熱循環(huán)條件下，但使用FW2-n-V2作為正向引物將銜接子添加至文庫中。接著匯集樣品，使用Ampure珠粒清潔并且準(zhǔn)備使用NexteraXTDNA制備試劑盒(Illumina)，使用制造商的說明書進(jìn)行Illumina測序，除了使用5ngDNA模板，并且在擴(kuò)增步驟期間替代地使用定制內(nèi)部引物，所述試劑盒將DNA片段化成較小片段。所用的內(nèi)部引物Next_i5_n_v2和Next_i7_n確保將僅擴(kuò)增含有所述條形碼的片段化片段。運行凝膠并且顯示于圖29中。表27.用于整個轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增和文庫制備的額外引物使用IlluminaNextSeq儀器對編條形碼擴(kuò)增子文庫測序。分析配對末端讀數(shù)以將配對讀數(shù)與個別細(xì)胞聯(lián)系在一起，并且鑒別在那些細(xì)胞中表達(dá)的基因。測序產(chǎn)生371,918,220個已過濾的配對末端讀數(shù)。所述DNA條形碼用于基于正向讀數(shù)序列向個別細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄物指定配對讀數(shù)。所述正向讀數(shù)內(nèi)所述DNA條形碼的鑒別使用python腳本進(jìn)行。關(guān)于各正向讀數(shù)，與固定序列1的編輯距離使用全局/局部比對計算。需要2或更小的編輯距離或棄去所述讀數(shù)對。根據(jù)固定序列1的位置和BC1和BC2的已知長度，從所述正向讀數(shù)推斷出候選BC1和BC2序列。檢查BC1和BC2以驗證其分別滿足用于漢明(16,11)或漢明(12,7)DNA條形碼的漢明條件。關(guān)于滿足所述漢明條件的正向讀數(shù)，基于X、固定序列2和分子條形碼的已知長度推斷出候選分子條形碼。如果所述分子條形碼序列無“C”核苷酸，那么向細(xì)胞(基于BC1和BC2)和所述細(xì)胞內(nèi)的特異性轉(zhuǎn)錄物(基于所述分子條形碼)指定配對讀數(shù)。向個別細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄物指定37,110.172個讀數(shù)對。向細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物指定的配對讀數(shù)接著使用程序blastn以10-6的e值截止并且設(shè)定百分率_同一性至98與如Ensembl(www.ensembl.org)的release78中所報告的基因的已知剪切變體進(jìn)行比較。如果所述對的任一讀數(shù)由blast計分為一次碰撞，那么來自所述細(xì)胞的對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物(由BC1、BC2和所述分子條形碼鑒別)與所述基因建立聯(lián)系。如果存在超過一次blast碰撞，那么通過發(fā)現(xiàn)對正向和反向讀數(shù)具有HSP長度的最大總和的基因來選擇最佳匹配。在兩種不同基因之間建立聯(lián)系的情況下，將所述讀數(shù)對指定至基因被視為不明確的并且不進(jìn)行進(jìn)一步考慮。關(guān)于由BC1和BC2的獨特組合鑒別的各細(xì)胞，通過對由與給定基因相關(guān)的讀數(shù)對觀察到的不同分子條形碼的數(shù)目計數(shù)來確定可見來自所述給定基因的轉(zhuǎn)錄物的不同次數(shù)。表33顯示在使用這種程序處理四種樣品后最經(jīng)常檢測到的基因。所述表顯示Ensembl基因ID、所述基因的Ensembl描述和其中檢測到所述基因的細(xì)胞的數(shù)目。R.實施例18：將條形碼銜接子并入第一鏈cDNA的5’端中這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。例如通過液滴發(fā)生器器件將細(xì)胞和條形碼銜接模板一起放在反應(yīng)容器中，由此大多數(shù)反應(yīng)容器僅具有一種細(xì)胞和一種模板分子，或一種細(xì)胞和一種條形碼銜接模板珠粒，并且所述反應(yīng)容器為油包水液滴，如實施例14中。所述條形碼銜接序列包含固定序列、條形碼序列、任選地存在的UMI，和寡聚(dT)或隨機或半隨機序列(分別為表28中的條形碼_銜接子_5c_寡聚dT和條形碼_銜接子_5c_隨機體)或其組合。所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)包含固定序列、任選地存在的UMI和第一鏈cDNA互補序列(表28中的5’銜接子)。所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在以下反應(yīng)條件下在50℃下執(zhí)行3分鐘，隨后在42℃下執(zhí)行3小時：RT反應(yīng)混合物當(dāng)所述條形碼銜接子引發(fā)RT反應(yīng)并且并入第一鏈cDNA的5’端中時，編條形碼在所述RT反應(yīng)期間發(fā)生。條形碼銜接子由RNAP或DNAP產(chǎn)生(在條形碼銜接模板上具有適當(dāng)RNA啟動子或鏈置換DNAP識別位點，如通過切口酶產(chǎn)生的切口)，因為反轉(zhuǎn)錄能夠利用DNA和RNA作為引物(圖8和9)。所述乳液如實施例14中被破乳，并且所得編條形碼核酸文庫接著匯集并且使用正向和反向引物擴(kuò)增，所述引物包含與固定序列互補的序列，所述固定序列如實施例17中分別通過編條形碼反應(yīng)中的5’銜接子和條形碼_銜接子_5c_寡聚dT或條形碼_銜接子_5c_隨機體添加。反應(yīng)條件顯示如下：熱循環(huán)條件所關(guān)注的靶標(biāo)基因也可通過使用包含基因特異性序列的正向引物并且使用包含與如實施例14和16中通過編條形碼反應(yīng)中的條形碼_銜接子_5c_寡聚dT或條形碼_銜接子_5c_隨機體添加的固定序列互補的序列的反向引物執(zhí)行擴(kuò)增來擴(kuò)增。關(guān)于在兩個連續(xù)PCR反應(yīng)中擴(kuò)增TCRα和β鏈的反應(yīng)條件顯示如下，其中PCR1的產(chǎn)物在用于PCR2中之前稀釋50倍：PCR1和PCR2的熱循環(huán)條件所述文庫接著準(zhǔn)備用于下一代測序，如在Illumina或IonTorrent平臺上。表28.引物序列S.實施例19：在PCR期間將條形碼銜接子并入5’端中這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。例如通過液滴發(fā)生器器件將細(xì)胞和條形碼銜接模板一起放在反應(yīng)容器中，由此大多數(shù)反應(yīng)容器僅具有一種細(xì)胞和一種模板分子，或一種細(xì)胞和一種條形碼銜接模板珠粒，并且所述反應(yīng)容器為油包水液滴，如實施例14中。所述模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)包含固定序列、任選地存在的UMI和第一鏈cDNA互補序列(表29中的5’銜接子)。3’銜接序列包含固定序列、任選地存在的UMI，和寡聚(dT)或隨機或半隨機序列(分別為表29中的3’_銜接子_寡聚dT和3’_銜接子_隨機體)或其組合。使用細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在以下反應(yīng)條件下在50℃下執(zhí)行3分鐘，隨后在42℃下執(zhí)行3小時，隨后在標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)條件下執(zhí)行：RT反應(yīng)混合物5’_PCR_條形碼_銜接_引物由條形碼_銜接_模板使用DNAP(在條形碼銜接模板上具有適當(dāng)鏈置換DNAP識別位點，如通過切口酶產(chǎn)生的切口)產(chǎn)生。此處，Klenow片段用作DNAP并且Nt.BbvCI用作切口核酸內(nèi)切酶，并且所述識別位點為“CCTCAGC”。在反轉(zhuǎn)錄后，具有與添加至第一鏈cDNA的銜接序列互補的其3’端的引物用于擴(kuò)增，其中正向引物為由條形碼銜接模板產(chǎn)生的5’_PCR_條形碼_銜接_引物，并且反向引物為3’_PCR_引物。當(dāng)所述條形碼銜接子(5’_PCR_條形碼_銜接_引物)為正向引物并且所述條形碼銜接子并入第一鏈cDNA的5’端中時，編條形碼在所述PCR反應(yīng)期間發(fā)生(圖11)。所關(guān)注的靶標(biāo)基因也可通過使用作為正向引物的5’_PCR_條形碼_銜接_引物和包含基因特異性序列的反向引物執(zhí)行擴(kuò)增來擴(kuò)增。所述文庫接著匯集并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如在Illumina或IonTorrent平臺上。表29.引物序列T.實施例20：在PCR期間將條形碼銜接子并入3’端中這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。這一實施例類似于實施例19，除了由條形碼銜接模板產(chǎn)生的條形碼銜接子用作PCR中的反向引物。如實施例19中執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄，并且在PCR中，5’_PCR_引物為正向引物，并且3’_PCR_條形碼_銜接_引物由條形碼_銜接_模板產(chǎn)生并且用作反向引物(圖12)。使用細(xì)胞和條形碼銜接模板珠粒的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在以下反應(yīng)條件下在50℃下執(zhí)行3分鐘，隨后在42℃下執(zhí)行3小時，隨后在標(biāo)準(zhǔn)PCR循環(huán)條件下執(zhí)行：RT反應(yīng)混合物所關(guān)注的靶標(biāo)基因也可通過使用包含基因特異性序列的正向引物和作為反向引物的3’_PCR_條形碼_銜接_引物執(zhí)行擴(kuò)增來擴(kuò)增。所述文庫接著匯集并且準(zhǔn)備用于下一代測序，如在Illumina或IonTorrent平臺上。表30.引物序列U.實施例21：對來自非細(xì)胞來源的RNA編條形碼在本發(fā)明的實施方案中，對反應(yīng)容器中的所有RNA均編條形碼，限制條件是所述反應(yīng)中所用的引物可結(jié)合于特定RNA并且起始針對特定RNA的反轉(zhuǎn)錄。因此，也可對外源引入的RNA編條形碼。在這一實施例中，對使用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA編條形碼。SpikeIn序列根據(jù)IDT排序并且用PhusionDNA聚合酶使用作為引物的SPIKEIN-FW和SPIKEIN-RV進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得具有5’T7RNAP啟動子序列和3’聚A尾的雙鏈材料。所述產(chǎn)物接著用QiagenMinElute試劑盒凈化并且所述DNA產(chǎn)物用于由LifeTechnologies的T7MEGAScript試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。因此獲得的RNA接著通過使用Amicon30kDA柱(Millipore)用10mMTris洗滌并且濃縮來凈化。在八個96孔板的各孔中，單一記憶B細(xì)胞連同0.5ng酵母tRNA(LifeTechnologies)和0.1pgSpike-InRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在每孔10μL反應(yīng)中，反應(yīng)為：所述反應(yīng)在55℃下孵育3分鐘，并且接著在42℃下孵育2小時。96孔板中的各孔具有在孔ID-銜接子中不同的孔條形碼。所述反應(yīng)接著通過結(jié)合第一鏈cDNA與結(jié)合于生物素標(biāo)記的寡聚dT的抗生蛋白鏈菌素順磁C1Dynabeads(LifeTechnologies)，并且接著使用磁鐵來拉開所述第一鏈cDNA，并且用BWB緩沖液(2MNaCl于TE中)將其洗滌3次，并且接著用10mMTris洗滌3次來凈化，并且再懸浮于15μL10mMTris中。進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增以擴(kuò)增重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因。不同板條形碼序列添加至不同板中的所有匯集的編條形碼cDNA中。關(guān)于PCR1的每孔：來自PCR1的產(chǎn)物稀釋50倍并且用于PCR2。關(guān)于PCR2的每孔反應(yīng)：將所得擴(kuò)增材料的量標(biāo)準(zhǔn)化并且如實施例11中關(guān)于454測序來制備。用于這一實施例中的引物可發(fā)現(xiàn)于表13、14和32中。獲得的454讀數(shù)基于板-和孔-ID條形碼分類。因此，讀數(shù)可分類返回特定板中的初始孔。在剪去所述條形碼序列后，讀數(shù)用Newbler組裝。關(guān)于各重疊群，我們執(zhí)行所述重疊群與所述Spike-In序列的Smith-Waterman比對，關(guān)于匹配使用計分矩陣2，關(guān)于錯誤匹配使用計分矩陣-1，關(guān)于間隙開口使用計分矩陣-1并且關(guān)于間隙延伸使用計分矩陣-1。具有>800的分?jǐn)?shù)的任何重疊群均被視為匹配。我們對各板上觀察到匹配的孔的數(shù)目計數(shù)。所述Spike-In序列在大多數(shù)孔中檢測到(表31)。表31.檢測到Spike-In序列的孔表32.所用的序列[孔-條形碼]＝SEQIDNOS:47606-47711；[板-條形碼]＝SEQIDNOS:47712-47719。V.實施例22：對來自非細(xì)胞來源的RNA編條形碼以鑒別細(xì)胞群體這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。如實施例21所示，可對外源引入的RNA編條形碼。在這一實施例中，使用編條形碼RNA來鑒別特異性細(xì)胞群體。Spike-InDNA如實施例21中產(chǎn)生，除了SPIKEIN-FW具有5’NH2修飾。其使用All-in-One抗體-寡核苷酸綴合試劑盒(Solulink)綴合于抗CD4抗體。使用體外轉(zhuǎn)錄由Spike-InDNA產(chǎn)生的RNA也可替代地綴合于抗CD4抗體。如實施例15中制備T細(xì)胞并且測序，其中額外步驟為所述T細(xì)胞與所述Spike-In綴合的抗CD4抗體一起孵育，接著在液滴發(fā)生器上運行所述T細(xì)胞并且隨后對所述RNA編條形碼。獲得的讀數(shù)基于指數(shù)-ID和通過條形碼銜接子添加的條形碼分類。因此，讀數(shù)可分類返回初始反應(yīng)容器。進(jìn)行所述重疊群與所述Spike-In序列的Smith-Waterman比對，關(guān)于匹配使用計分矩陣2，關(guān)于錯誤匹配使用計分矩陣-1，關(guān)于間隙開口使用計分矩陣-1并且關(guān)于間隙延伸使用計分矩陣-1。具有>800的分?jǐn)?shù)的任何重疊群均被視為匹配。我們接著對其中觀察到匹配的反應(yīng)容器計數(shù)。關(guān)于其中檢測到所述Spike-In序列的反應(yīng)容器，所述T細(xì)胞接著被鑒別為CD4T細(xì)胞(圖14A)?？墒褂门c不同Spike-In序列偶聯(lián)的多種抗體，其中末端結(jié)果為具有不同細(xì)胞表面抗原的不同細(xì)胞可在相同實驗運行中得到鑒別。W.實施例23：對來自非細(xì)胞來源的RNA編條形碼以鑒別抗原特異性B細(xì)胞這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。在這一實施例中，對外源引入的RNA編條形碼并且用于鑒別抗原特異性B細(xì)胞。Spike-InDNA如實施例21中產(chǎn)生，除了SPIKEIN-FW具有5’NH2修飾。其使用All-in-One抗體-寡核苷酸綴合試劑盒(Solulink)綴合于流感血球凝集素抗原。使用體外轉(zhuǎn)錄由Spike-InDNA產(chǎn)生的RNA也可替代地綴合于血球凝集素。來自流感疫苗免疫小鼠的B細(xì)胞如實施例8中制備并且進(jìn)行測序，其中額外步驟為所述B細(xì)胞在對其編條形碼之前與所述Spike-In綴合的抗原一起孵育。獲得的讀數(shù)基于指數(shù)-ID和通過條形碼銜接子添加的條形碼分類。因此，讀數(shù)可分類返回初始反應(yīng)容器。進(jìn)行所述重疊群與所述Spike-In序列的Smith-Waterman比對，關(guān)于匹配使用計分矩陣2，關(guān)于錯誤匹配使用計分矩陣-1，關(guān)于間隙開口使用計分矩陣-1并且關(guān)于間隙延伸使用計分矩陣-1。具有>800的分?jǐn)?shù)的任何重疊群均被視為匹配。我們接著對其中觀察到匹配的反應(yīng)容器計數(shù)。關(guān)于其中檢測到所述Spike-In序列的反應(yīng)容器，所述B細(xì)胞接著被鑒別為血球凝集素特異性的(圖14B)?？墒褂门c不同Spike-In序列偶聯(lián)的多種抗原，其中末端結(jié)果為對不同抗原具特異性的不同B細(xì)胞可在相同實驗運行中得到鑒別。X.實施例24：對來自非細(xì)胞來源的RNA編條形碼以鑒別抗原特異性T細(xì)胞這一實施例描述了基于預(yù)測結(jié)果而非實際獲得的結(jié)果的本發(fā)明的實施方案。在這一實施例中，對外源引入的RNA編條形碼并且用于鑒別抗原特異性B細(xì)胞。Spike-InDNA如實施例21中產(chǎn)生，除了SPIKEIN-FW具有5’NH2修飾。其使用All-in-One抗體-寡核苷酸綴合試劑盒(Solulink)綴合于特定肽-MHC抗原。使用體外轉(zhuǎn)錄由Spike-InDNA產(chǎn)生的RNA也可替代地綴合于肽-MHC復(fù)合物。如實施例15中制備T細(xì)胞并且測序，其中額外步驟為所述T細(xì)胞與所述Spike-In綴合的抗CD4抗體一起孵育，接著在液滴發(fā)生器上運行所述T細(xì)胞并且隨后對所述RNA編條形碼。獲得的讀數(shù)基于指數(shù)-ID和通過條形碼銜接子添加的條形碼分類。因此，讀數(shù)可分類返回初始反應(yīng)容器。進(jìn)行所述重疊群與所述Spike-In序列的Smith-Waterman比對，關(guān)于匹配使用計分矩陣2，關(guān)于錯誤匹配使用計分矩陣-1，關(guān)于間隙開口使用計分矩陣-1并且關(guān)于間隙延伸使用計分矩陣-1。具有>800的分?jǐn)?shù)的任何重疊群均被視為匹配。我們接著對其中觀察到匹配的反應(yīng)容器計數(shù)。關(guān)于其中檢測到所述Spike-In序列的反應(yīng)容器，所述T細(xì)胞接著被鑒別為抗原特異性的(圖14C)?？墒褂门c不同Spike-In序列偶聯(lián)的多種不同肽-MHC，其中末端結(jié)果為識別不同肽-MHC的不同T細(xì)胞可在相同實驗運行中得到鑒別。表33.最經(jīng)常觀察到的基因。應(yīng)了解，本文所述的實施例和實施方案僅是出于說明性目的并且根據(jù)其的各種修改或變化將被推薦給本領(lǐng)域技術(shù)人員并且將包括在本申請的精神和范圍以及隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文所引用的所有公布、序列登錄號、專利和專利申請針對所有目的以引用的方式整體并入本文。當(dāng)前第1頁1 2 3