本發(fā)明屬于化學領(lǐng)域中具有生物活性的聚合物。更具體地，本發(fā)明涉及基于N-吡咯烷酮的內(nèi)二聚體，所述N-吡咯烷酮含有作為終端片段的氰基戊酸或氫原子，其通式(I)為：

其中單體單元是4-乙烯基吡啶的片段(4VP)，其中Х是

或2-甲基-5-乙烯基吡啶(2-M-5-VP)，

其中X是，

其中單體單元(即4-VP或2-М-5-VP片段)的含量是20-90mol％，內(nèi)二聚體的粘均分子量Mμ是10350kDa，并且酸度指數(shù)是(0.1-5.6)·10-3mg KOH/g。

所提到的內(nèi)二聚體具有活性，使其能夠作為治療肺塵埃沉著病的藥物。

背景技術(shù)：

專利RU 2415876(公開號10.04.2011)描述了一種N-吡咯烷酮內(nèi)二聚物的合成，其中2-甲基-5-乙烯基吡啶單體的含量為25-90mol.％，粘均分子量是46-150kDa，在制造流感疫苗時用作輔料。這種指定的內(nèi)二聚體是通過N-吡咯烷酮和2-甲基-5-乙烯基吡啶的自由基共聚作用獲得的，以偶氮二腈異丙基甲酸(0.4％)作為共聚反應(yīng)引發(fā)劑，過氧化氫(0.2％)和環(huán)己烷(5.4-7.1％)作為分子量調(diào)節(jié)劑，并使用乙醚回收所需的產(chǎn)物。

最接近本發(fā)明的是《Molecular design of polyvinylpyrrolidone-conjugated interleukin-6for enhancement of in vivo thrombopoietic activity in mice》(S.Tsunoda et al./Journal of Controlled Release,68(2000)335-341)，該文章描述了含有氰基戊酸殘基終端片段和氫原子的N-吡咯烷酮聚合物，其分子量的范圍為2至15.2kDa，采用凝膠滲透色譜法測定，根據(jù)通式(II)制備：

通過N-吡咯烷酮的自由基聚合法制備所述聚合物，使用4,4'-偶氮雙(4-腈異丙基甲酸)作為聚合引發(fā)劑和氰基戊酸的來源，使用3-巰基丙酸片段作為自由基鏈終止過程控制劑的載體以及終端氫原子的來源。為進行處理，將所有組分溶解在二甲基甲酰胺中并在60℃下溫育6小時。通過改變反應(yīng)物中異油酸(4％)與3-巰基丙酸的比例可以調(diào)節(jié)所述聚合物的分子量(表1)。表1。

用于合成各種數(shù)量載體自由基的聚乙烯吡咯烷酮的平均分子量

使用Spectra/Por MWCO53500(美國加州Spectrum公司)薄膜分離經(jīng)過過濾的聚合物。通過凝膠滲透色譜法，使用聚乙二醇作為標準試劑，測定了聚乙烯基吡咯烷酮的平均分子量(Mn)。

所描述的方法無法獲得分子式(I)所示N-VP和4-VP或2M-5-VP的內(nèi)二聚體，而是生成聚乙烯基吡咯烷酮和聚乙烯吡啶均聚物的混合物，因為N-VP和4-VP或2M-5-VP聚合的常數(shù)差異超過一個數(shù)量級。

與本發(fā)明類似的，將聚合物用作塵肺治療劑的化合物是聚乙烯基吡啶氧化物系N-2-乙烯基-和4-乙烯基吡啶，參閱《聚(乙烯基吡啶氧化物)用于塵肺治療》，Research British journal of industrial medicine，1971，28,72-77，Katznelson B.A.，Alekseev O.G.，Privalova L.I.，Polzik E.V?！皦m肺病：發(fā)病機理和生物防治”。葉卡捷琳堡市俄羅斯科學院烏拉爾分院，1995年。

本發(fā)明的目的是推動將基于N-乙烯基吡咯烷酮內(nèi)二聚物的生物活性化合物用于于塵肺的治療塵肺病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的作者已進行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)N-乙烯基吡咯烷酮(N-VP)和4-乙烯基吡啶(4-VP)或2-甲基-5-乙烯基吡啶(2-M-5-VP)的內(nèi)二聚體含有氰基戊酸殘基或作為末端片段的氫原子，與已知的類似物不同，這可能對于塵肺的治療是有用的。

研究者發(fā)現(xiàn)，N-VP和乙烯基吡啶的聚合常數(shù)之差超過一個數(shù)量級，如果以含量小于4wt％的4,4'-偶氮雙(4-腈異丙基甲酸)作為聚合反應(yīng)引發(fā)劑和酸性部分氰基戊酸的來源，以含量最高為1wt％的巰基丙酸作為自由基載體，鏈反應(yīng)終止劑和末端氫原子的來源，環(huán)己烷作為分子量調(diào)節(jié)劑，可獲得具有通式(I)的內(nèi)二聚體：

通過改變反應(yīng)成分的比例并通過已制備的混合物補償反應(yīng)消耗，改變所述內(nèi)二聚體的分子量。對于初始混合物的組成成分，應(yīng)該注意的是N-二VP和乙烯基吡啶的恒定聚合反應(yīng)差異超過一個數(shù)量級。記錄發(fā)現(xiàn)的因素和模式，以獲得根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)二聚體。

因此根據(jù)本發(fā)明，基于含有作為終端片段的氰基戊酸或氫原子的N-乙烯基吡咯烷酮的內(nèi)二聚體符合通式(I)：

其中單體單元是4-乙烯基吡啶的片段

(4VP)，如果Х是

或2-甲基-5-乙烯基吡啶(2-M-5-VP)的片段，

如果Х是，

其中，作為4-VP或2M-5-VP片段的單體單元的含量是20-90mol％，內(nèi)二聚體的平均分子量Mμ是10.350kDa，酸度值是(0.1-5.6)·10-3mgKOH/g。

通常，作為4-VP或2-M-5-VP片段的單體單元的含量是25-40mol％，內(nèi)二聚體的平均分子量Mμ是15-30kDa，酸度值是(1.87-3.7)·10-3mgKOH/g。

同時，本發(fā)明提供了一種通過哺乳動物塵肺的方法，其中為需要治療的

哺乳動物提供治療有效量的，含有氰基戊酸殘基和氫原子作為末端片段的N-乙烯基吡咯烷酮，如通式(I)所示：

其中單體單元是4-乙烯基吡啶的片段

(4VP)，如果Х是

或2-甲基-5-乙烯基吡啶(2-M-5-VP)的片段，

如果Х是，

其中，作為4-VP或2-M-5-VP片段的單體單元的含量是20-90mol％，內(nèi)二聚體的平均分子量Mμ是10.350kDa，酸度值是(0.1-5.6)·10-3mgKOH/g。

為了獲得通式(I)所示的內(nèi)二聚物，在存在4,4'-偶氮雙(4-腈異丙基甲酸)(AIBN)和3-巰基丙酸的條件下，進行N-VP和VP-4或2-M-5-VP的自由基共聚反應(yīng)。N-VP和4-VP或2-M-5-VP的內(nèi)二聚物比例恒定，末端片段氰基戊酸和氫原子可以補償混合物中消耗的成分。在乙醚(DE)中通過沉淀分離反應(yīng)產(chǎn)物。

最初反應(yīng)混合物中含有83.5-92.0wt％N-VP，1.5-9.5wt％VP，6.5-7.0wt％CH，0-1wt％3-MP.4，和1-4wt％AIBN，其中VP是4-VP或2-M-5-VP。

配制合物含有7-72wt％N-VP，28-93wt％2-M-5-VP，0-1wt％3-MP和1-4wt％AIBN。每20分鐘計算一次配制混合物的量，即反應(yīng)混合物中單體的測定濃度比例。所述共聚反應(yīng)的溫度為65-70℃。反應(yīng)后，單體的轉(zhuǎn)化率約20％，將反應(yīng)物質(zhì)冷卻至20℃，并在乙醚中沉淀。

所獲得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征在于，特別是，含有吡啶環(huán)的單體單元數(shù)量(n)，平均分子量和酸度值。通過NMR光譜測定含有吡啶環(huán)的單體單元數(shù)量，例如1H-、13C-或15N-NMR，某些核的信號的積分強度之比。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員可獲得這個問題的解決方案。

可以根據(jù)內(nèi)二聚體的內(nèi)部粘度計算粘均分子量。選擇過程和粘度測量條件使用的是本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員可以獲得的常規(guī)方法。例如，可以在由85％(體積)DMF和15％(體積)0.1M溴化鋰水溶液組成溶劑中測定特性粘度。

酸度值(X)定義為中和1g內(nèi)二聚物所含所有羰基所需的氫氧化鉀(KOH)的毫克數(shù)。為確定酸值(mg KOH/g)，對聚合物和氫氧化鈉的水溶液進行電位滴定，并根據(jù)下式進行計算：

Х＝V·5.6·10-3/m,

其中V-達到等當點時消耗的0.0001N氫氧化鈉溶液的體積，ml；m-聚合物樣品的質(zhì)量，g；5.6·10-3-對應(yīng)于1ml 0.0001N滴定溶液的氫氧化鉀的質(zhì)量。

如果需要提高根據(jù)本發(fā)明的某類內(nèi)二聚體的活性，通過凝膠色譜等方法可以進一步對分子量分布范圍較寬的反應(yīng)產(chǎn)物進行分級。實施分級的條件對于本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員是公知的。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠在合成階段調(diào)節(jié)內(nèi)二聚物的粘均分子量Mμ的范圍，改變3-巰基丙酸和環(huán)己烷的含量。

根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)二聚物無毒，并且可用于塵肺治療，通過體內(nèi)研究已經(jīng)證實。研究方法以及實驗動物(可能使用白色遠交小鼠或近交系白鼠)的選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。試驗動物出現(xiàn)內(nèi)二聚體毒性跡象，例如死亡，體重減輕，步態(tài)和行為變化，尿液變色，糞便量變化，眼和耳狀態(tài)，牙齒和皮毛腐爛，注射部位皮膚過敏。

具體實施方式

以下是本發(fā)明的說明性實施例，確認其工業(yè)適用性，目標的實現(xiàn)并促進對其本質(zhì)有更準確和完整的理解。對研究方法等進行可能的改動和變化，也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其結(jié)構(gòu)式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

在實施例和表2中，VP是4-VP或2-M-5-VP，這是每種情況下唯一確定的。

實施例1制備N-乙烯基吡咯烷酮(N-VP)，含有氰基戊酸殘基和氫原子作為末端片段的4-乙烯基吡啶(4-VP)。

向反應(yīng)器中加入含有2.30kg N-VP(89.56wt.％))、45g VP(1.75wt.％),100g環(huán)己烷(3.89wt％),21g 3-巰基丙酸(3-MP)(0.82wt％)和102.0g AIBN(3.97wt％)的初始反應(yīng)混合物。將反應(yīng)物加熱至60-70℃，并在給定溫度下進行合成反應(yīng)，定期取樣進行色譜分析(HPLC Sferisorb C-18.5μm，4.6×250mm，EtOH/H2O 6:94,2.5ml/min(50℃)，254nm)，并加入含有450g N-VP(75.13wt％)，120.0g VP(20.03wt％)，6g3-巰基丙酸(3-MP)(1.0wt％)和23g AIBN(3.84wt％)的混合物。

當單體轉(zhuǎn)化率達到20-25％時，將反應(yīng)物冷卻至20℃，在二乙醚(DE)中沉淀。使用2L DE在過濾器中清洗所需產(chǎn)物，首先在40～60℃的常壓條件下通過過濾和干燥進行分離，然后放入80-90℃的真空爐中。獲得570克無定形白色粉末，易溶于水(pH＝6.9-7.0的10wt％水溶液),總含量為EP mol％的22份，粘均分子量為28kDa，酸度值為1.47·10-3mg KOH/g。

實施例2-9在實施例1所描述的條件下進行內(nèi)二聚體的合成和分離。表2中列出了原料和配制混合物的成分，內(nèi)二聚體產(chǎn)物中VP的含量(mol％)，和內(nèi)二聚體的平均分子量范圍Mμ。

表2

實施例10根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)二聚體的體內(nèi)急性毒性研究

分組進行研究，每組包括6只體重19-22g的健康白色小鼠。將根據(jù)實施例1-9獲得的內(nèi)二聚體溶解在5wt％無菌等滲氯化鈉溶液中，每只小鼠給予1.0ml此溶液。如果在7天觀察期內(nèi)，一組中沒有小鼠死亡，則認為此化合物通過測試。在對實施例1-9獲得的內(nèi)二聚體進行的研究中，沒有觀察到小鼠死亡。

實施例11研究了根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)二聚體作為治療塵肺病的藥物。

本研究使用了63只重210-230g的白色大鼠。為了使試驗大鼠染上塵肺，使其吸入含8-10％游離SiO2的煤煙，粉塵顆粒的尺寸達到5微米(85％)，氣管內(nèi)注射50ml 1ml的生理鹽水溶液。

根據(jù)每個實施例1-9制備的內(nèi)二聚體被溶解在1wt％無菌等滲溶液中，氣管內(nèi)給藥，劑量為每30天給予25mg/kg，或在第30，45和60天分次給藥。

為了研究根據(jù)每個實施例1-9制備的內(nèi)二聚體的效應(yīng)，實驗動物被分為21組，每組有3只大鼠：

對照組-沒有給予藥物和無煙煤粉塵的動物。

第1組-單次氣管內(nèi)給藥50mg無煙煤粉塵的動物。

第2-10組-氣管內(nèi)給藥50mg無煙煤粉塵30天后，每天給予根據(jù)實施例1-9的內(nèi)二聚體25mg/kg。

第11-20組-氣管內(nèi)給藥50mg無煙煤粉塵后，分次給予根據(jù)實施例1-9的內(nèi)二聚體：30天后-0mg/kg；45天后-5mg/kg；60天后-10mg/kg。

每月通過生理測試、生化測試、免疫測試和形態(tài)學研究對實驗動物進行一次檢查。對結(jié)果進行統(tǒng)計學處理。通過下列指標可以確定藥物是否富有顯著的治療效果：

-對照組動物體重的變化動態(tài)；

-觀測結(jié)束時，氧消耗量和總和閾值指數(shù)與對照組相當；

-外周血、血紅蛋白、血清總蛋白形態(tài)含量的波動限制與對照組保持同一水平；

-改變氧化還原過程(巰基含量和過氧化氫酶指數(shù))，轉(zhuǎn)氨過程(ALT、ACT)并在觀察期結(jié)束時恢復(fù)血膽堿酯酶的活性；

-形態(tài)學研究表明肺氣腫斑塊數(shù)量下降，肺泡間孔增厚的數(shù)量下降，浸潤和水腫減少，無細胞纖維結(jié)節(jié)。

每月一次的檢查表明，對照組動物的體重均勻增加。在未給予內(nèi)二聚體的組中(第1組)，從氣管內(nèi)給予無煙煤粉塵之后的第2個月開始，觀察到顯著地體重下降。對于單次給予25mg/kg內(nèi)二聚體進行組(第2-10組)，從氣管內(nèi)給予無煙煤粉塵之后的第4個月開始觀察到體重下降。對于分次(10-5-10mg/kg)給藥25mg/kg內(nèi)二聚體的組(11-20)，從6個月開始，體重增加與對照組沒有不同。

在沒有經(jīng)過內(nèi)二聚體治療第1組中，從氣管內(nèi)給予無煙煤粉塵的第1個月開始，一直可以觀察到大鼠的耗氧量增加。在第2-10組中，每次給予實驗動物25mg/kg內(nèi)二聚體，給予無煙煤粉塵之后的第1.3個月和第4個月開始，檢測到耗氧量的增加；6個月之后，各組的耗氧量與對照組沒有不同。在分次使用內(nèi)二聚體治療的第11-20組中，整個觀測期間內(nèi)動物耗氧量與對照組沒有顯著不同。

在使用內(nèi)二聚體治療的第2-20組中，外周血、血紅蛋白、血清總蛋白水平的波動限制仍然可以控制。

形態(tài)學研究表明，在接受肺部內(nèi)二聚物治療的第2-20組中，3個月后，與沒有接受內(nèi)二聚體的第1組相比，肺氣腫斑塊數(shù)量下降，肺泡間孔增厚的數(shù)量下降，浸潤和水腫減少，無細胞纖維結(jié)節(jié)。

因此，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)二聚體可用于治療哺乳動物的塵肺。