本發(fā)明本發(fā)明涉及細胞測量機構和具有該細胞測量機構的自動細胞培養(yǎng)裝置、以及細胞測量方法。

背景技術：

以往，細胞培養(yǎng)中大部分的操作都是通過手工操作來進行，細胞培養(yǎng)操作繁雜且花費時間，因此需要大量的人力成本。特別是，細胞計數(shù)和細胞存活率測定為繁雜且困難的操作，必須要求操作者的熟練度。

對此，提出了如專利文獻1所示的細胞計數(shù)器那樣，基于進行了臺盼藍色素染色的培養(yǎng)細胞的圖像數(shù)據(jù)，自動計算細胞數(shù)的計數(shù)和細胞存活率等的方法。

此外，專利文獻2中，示出了通過使用多波長的激光光源和多次流入光學測定(流式細胞儀)對全血中的紅血球、白血球、血小板進行鑒定和定量的方法。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特表2013-517460號公報

專利文獻2：日本特表2012-525589號公報

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

如果使用專利文獻1所記載的細胞計數(shù)器來嘗試細胞數(shù)的計數(shù)，則與利用以往的血球計數(shù)板的計數(shù)相比精度提高。但是，根據(jù)我們的實驗結果，在細胞懸浮液的細胞濃度為1×10⁵細胞/ml以下和5×10⁶細胞/ml以上的濃度區(qū)域內(nèi)，計數(shù)結果的可靠性極端降低了。在將細胞培養(yǎng)裝置應用于再生醫(yī)療、細胞治療時，需要測量細胞濃度為1×10⁵細胞/ml以下的樣本。然而，專利文獻1的細胞計數(shù)器在該濃度區(qū)域內(nèi)的測量精度低，無法適用。此外，細胞存活率是通過細胞輪廓的對比度來判斷細胞的生死，但是活性降低了的細胞(以下，低活性的活細胞)的細胞輪廓的對比度低，難以判斷生死。也就是說，無法測量繼代培養(yǎng)中細胞懸浮液中的細胞存活率。

此外，就使用了專利文獻2所示的流式細胞儀的細胞測量方法而言，需要對每一個細胞進行測定，因此需要大量的時間。

另一方面，以再生醫(yī)療或細胞治療為目的進行細胞培養(yǎng)時，由于不能確認安全性，因此無法對供于治療的細胞進行染色。因此，就必須用色素對細胞進行染色的專利文獻1的細胞測量方法而言，難以適用于這樣的細胞培養(yǎng)。此外，在如上所述的專利文獻2的細胞測量方法中，測量需要大量的時間，因此變得難以適用于細胞培養(yǎng)裝置。

對此，本發(fā)明提供一種不依賴于操作者的熟練度、并且不對培養(yǎng)細胞進行染色、能夠高精度且迅速地實行至少細胞存活率的測量的細胞測量機構和具有該細胞測量機構的細胞培養(yǎng)裝置、以及細胞測量方法。

用于解決問題的方法

為了解決上述課題，本發(fā)明的細胞測量機構的特征在于，具有：使細胞懸浮液流通的流路；將上述流路內(nèi)的細胞懸浮液進行輸送的液體驅(qū)動部；基于從光源向在上述流路內(nèi)流動中的細胞懸浮液進行照射光的照射所得到的前向散射光強度以及透過率和/或側向散射光強度，求出至少上述細胞懸浮液中的細胞存活率的運算部。

此外，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)裝置的特征在于，具有：培養(yǎng)細胞并使細胞增殖，并將增殖的細胞剝離的擴增培養(yǎng)機構；以及細胞測量機構，所述細胞測量機構具有：使含有由上述擴增培養(yǎng)機構剝離的細胞的細胞懸浮液流通的流路；將上述流路內(nèi)的細胞懸浮液進行輸送的液體驅(qū)動部；運算部，該運算部基于從光源向在上述流路內(nèi)流動中的細胞懸浮液進行照射光的照射所得到的前向散射光強度以及透過率和/或側向散射光強度，計算至少上述細胞懸浮液中的細胞存活率。

此外，本發(fā)明的細胞測量方法的特征在于，是求出細胞懸浮液中的至少細胞存活率的細胞測量方法，具有：

對于在流體單元內(nèi)流通的細胞懸浮液，由光源從與上述細胞懸浮液的流動正交的方向進行照射光的照射的工序；對從上述細胞懸浮液散射的前向散射光強度進行測定的工序；對透過上述細胞懸浮液的上述照射光的透過率進行測定的工序；基于上述測定的前向散射光強度和預先儲存的表示活細胞濃度與上述前向散射光強度的關系的第一校正曲線，求出上述細胞懸浮液中的活細胞濃度的工序；基于上述測定的上述透過率和預先儲存的表示死細胞濃度與上述透過率的關系的第二校正曲線，求出上述細胞懸浮液中的死細胞濃度的工序；側向基于上述求出的活細胞濃度和死細胞濃度，求出上述細胞懸浮液中的細胞存活率的工序。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種不依賴于操作者的熟練度、并且不對培養(yǎng)細胞進行染色、能夠高精度且迅速地實行至少細胞存活率的測量的細胞測量機構和具有該細胞測量機構的細胞培養(yǎng)裝置、以及細胞測量方法。

例如，能夠在配設于細胞培養(yǎng)裝置內(nèi)的流體單元內(nèi)，通過非染色來迅速地測量含有繼代培養(yǎng)細胞的細胞懸浮液中的細胞存活率。

上述之外的課題、構成和效果，通過以下的實施方式的說明而變得明確。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一個實施方式涉及的細胞培養(yǎng)裝置的整體構成圖。

圖2為表示caco-2細胞的顯微鏡圖像，即包含活細胞、死細胞和低活性的活細胞的圖像的圖。

圖3為圖1所示的測定部的光學系統(tǒng)的概略構成圖。

圖4為圖1所示的控制部的概略構成圖。

圖5為表示caco-2細胞懸浮液中的活細胞濃度與前向散射光強度的關系的圖，為校正曲線(1)的說明圖。

圖6為表示caco-2細胞懸浮液中的各死細胞濃度中，來自光源的照射光的波長與透過率t的關系的光譜圖。

圖7為表示caco-2培養(yǎng)基中的死細胞濃度與透過率t的關系的圖，為校正曲線的說明圖。

圖8為表示caco-2活細胞懸浮液中的死細胞濃度與透過率t的關系的圖，為校正曲線(2)的說明圖。

圖9為表示caco-2細胞懸浮液中的培養(yǎng)液和各細胞存活率中，來自光源的照射光的波長與側向散射光強度的關系的光譜圖。

圖10為表示caco-2活細胞懸浮液中的細胞存活率與側向散射光強度的關系的圖，為校正曲線(3)的說明圖。

圖11為根據(jù)本發(fā)明的一實施例涉及的實施例1的細胞測量機構的細胞存活率計算處理的流程圖。

圖12為根據(jù)本發(fā)明的另一實施例涉及的實施例2的細胞測量機構的細胞存活率計算處理的流程圖。

圖13為根據(jù)本發(fā)明的另一實施例涉及的實施例3的細胞測量機構的細胞存活率計算處理的流程圖。

具體實施方式

本發(fā)明人等潛心研究的結果是：在再生醫(yī)療或細胞治療中使用的培養(yǎng)細胞(繼代培養(yǎng)細胞等)的情況下，根據(jù)每個患者或被檢者的細胞活性的不同或培養(yǎng)狀態(tài)(繼代培養(yǎng)環(huán)境等)，混入粒徑小的死細胞、垂死的細胞或低活性的活細胞。得到了以下見解：這些細胞與具有活性的活細胞大小不同，因此僅通過例如對于流通通過流體單元中的活細胞懸浮液利用光源進行照射光的照射而得到的散射光，難以求出正確的細胞數(shù)或細胞存活率。這里，本發(fā)明人等得到了以下見解：通過使用前向散射光強度和透過率、或者前向散射光強度和透過率以及側向散射光強度，從而識別大小不同的上述各種細胞、即具有活性的活細胞、低活性的活細胞和死細胞，能夠高精度且迅速地得到細胞數(shù)或細胞存活率。

本說明書中，分別合并或單獨地將細胞懸浮液中的活細胞(viablecell)記為vc、將活細胞的濃度記為cvc、將細胞懸浮液中的死細胞(deadcell)記為dc、將死細胞的濃度記為cdc、將細胞懸浮液中的低活性的活細胞(subvitalcell)記為sc、將低活性的活細胞的濃度記為csc。

圖1為表示本發(fā)明的一個實施方式涉及的細胞培養(yǎng)裝置的整體構成圖。圖1中，用實線表示使細胞懸浮液流通的流路，用虛線表示發(fā)送或接收控制信號或測量信號的信號線。細胞培養(yǎng)裝置1由如下機構構成：培養(yǎng)并使細胞增殖、并將增殖的細胞剝離的擴增培養(yǎng)機構15；使由擴增培養(yǎng)機構15剝離的細胞分散并進行測定的細胞測量機構16；將由細胞測量機構16分散的細胞懸浮液向擴增培養(yǎng)機構15進行輸送的細胞接種機構17；以及控制部18。予以說明的是，如后所述，控制部18與細胞測量機構16協(xié)同工作，具有基于所測量的前向散射光強度、透過率和側向散射光強度，通過運算求出細胞懸浮液中的細胞存活率等的功能。該點中，控制部18構成細胞測量機構16的一部分。此外，控制部18還具有控制擴增培養(yǎng)機構15、細胞測量機構16和細胞接種機構17的功能。以下，將控制部18具有求出細胞懸浮液中的細胞存活率、活細胞濃度(cvc)、和死細胞濃度(cdc)的功能的構成作為一個例子進行說明，但不限于此。例如，可以在細胞測量機構16內(nèi)設置具有上述功能的控制運算部，此外，也可以設為在后述的測定部6配設控制運算部的構成。

擴增培養(yǎng)機構15放置于未圖示的co2培養(yǎng)箱內(nèi)。同樣地，也可以設為細胞測量機構16和細胞接種機構17也放置于co2培養(yǎng)箱內(nèi)的構成。細胞培養(yǎng)裝置1內(nèi)的流路內(nèi)設為封閉體系的無菌狀態(tài)，在細胞培養(yǎng)裝置1的運行中，導入流路內(nèi)的空氣例如通過hepa過濾器(未圖示)，在維持了無菌狀態(tài)的環(huán)境下實施包含細胞的繼代操作等在內(nèi)的細胞培養(yǎng)。

關于在構成擴增培養(yǎng)機構15的擴增培養(yǎng)容器2中培養(yǎng)的細胞，從細胞供給部10，使用液體驅(qū)動部例如注射泵等而被導入。適量的細胞培養(yǎng)液從培養(yǎng)液供給部3通過液體驅(qū)動部例如擠壓泵7而被導入，流通通過三通閥8和流路內(nèi)，供給至擴增培養(yǎng)容器2。然后，對于在擴增培養(yǎng)容器2中培養(yǎng)的細胞，按照在導入的細胞培養(yǎng)液中成為均一濃度的方式，搖動容器，然后靜置數(shù)日。對于所培養(yǎng)的細胞，于co2培養(yǎng)箱內(nèi)在適當?shù)臈l件下，在擴增培養(yǎng)容器2內(nèi)培養(yǎng)數(shù)日。擴增培養(yǎng)容器2中，為了能夠觀察培養(yǎng)細胞的增殖狀態(tài)而設置有顯微鏡。這是因為，如果培養(yǎng)細胞在100％融合的狀態(tài)、即在擴增培養(yǎng)容器2的整個底面區(qū)域增殖，則不進行在此之上的增殖，存在培養(yǎng)細胞的活性降低或死亡的擔憂。一般而言，希望在達到70％～80％的融合的時刻將培養(yǎng)細胞剝離。細胞洗滌溶液供給部11在內(nèi)部容納有pbs(磷酸鹽緩沖液)或hepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩沖液等適合于細胞的洗滌液。例如，通過注射泵，從細胞洗滌液供給部11向擴增培養(yǎng)容器2內(nèi)導入洗滌液，從而將滯留時間長的細胞培養(yǎng)液、死細胞或廢物等擠出。被擠出的含有死細胞的細胞培養(yǎng)液通過擠壓泵7而作為廢液14向細胞培養(yǎng)裝置1的封閉體系外排出。細胞剝離溶液供給部12容納胰蛋白酶、膠原酶、分散酶等蛋白質(zhì)水解酶。將這些蛋白質(zhì)水解酶向擴增培養(yǎng)容器2導入并放置一定時間。利用這些蛋白酶，增殖了的培養(yǎng)細胞和與擴增培養(yǎng)容器2的底面粘接的整合蛋白等蛋白質(zhì)分解，培養(yǎng)細胞從擴增培養(yǎng)容器2剝離。細胞剝離溶液抑制劑供給部13容納胰蛋白酶抑制劑或細胞培養(yǎng)液等酶活性抑制劑。通過將這些細胞剝離溶液抑制劑向擴增培養(yǎng)容器2導入，從而使培養(yǎng)細胞剝離后的蛋白質(zhì)分解酶的活性停止，實現(xiàn)酶活性對培養(yǎng)細胞的損傷的降低。

試樣導入部4通過擠壓泵7、三通閥8而回收從擴增培養(yǎng)容器2的底面剝離的培養(yǎng)細胞。此時，在擴增培養(yǎng)容器2底面的培養(yǎng)細胞的殘渣多時，利用從培養(yǎng)液供給部3導入的細胞培養(yǎng)液進行預洗，然后回收到試樣導入部4，從而能夠提高培養(yǎng)細胞的回收率。

回收至試樣供給部4的培養(yǎng)細胞通過注射泵(未圖示)等液體驅(qū)動部和三通閥8而作為細胞懸浮液被導入細胞測量機構16的循環(huán)流路內(nèi)。細胞測量機構16由分散部5、作為液體驅(qū)動部的擠壓泵7以及測定部6構成。這些分散部5、擠壓泵7和測定部6通過循環(huán)流路而被連接。根據(jù)培養(yǎng)的細胞種類不同，其凝集性不同，假設在培養(yǎng)凝集性高的細胞種類時，導入到細胞測量機構16的循環(huán)流路內(nèi)的細胞懸浮液所含的培養(yǎng)細胞(以下簡稱為細胞)成為塊狀而流通通過循環(huán)流路。對此，利用作為液體驅(qū)動部的擠壓泵7、通過三通閥8而向分散部5導入，從塊狀分散后，細胞懸浮液向測定部6導入。這里，分散部5是通過例如在流路內(nèi)設置流路直徑急劇縮小的狹窄部、或孔板等隔板而形成。細胞懸浮液流通通過這些狹窄部或孔板時，塊狀的細胞通過剪切力(sheerstress)而被分散。予以說明的是，培養(yǎng)低凝集性的細胞種類時，不是必須在細胞測量機構16內(nèi)配設分散部5，只要通過以循環(huán)流路連接測定部6、擠壓泵7和三通閥8，來構成細胞測量機構16即可。

關于細胞接種機構17，在一端為擴增培養(yǎng)容器2、另一端為通過三通閥8與細胞測量機構16內(nèi)的循環(huán)流路連接的流路中，具備通過三通閥8而連接的細胞接種試樣調(diào)整部9。細胞接種試樣調(diào)整部9是為了對流通通過細胞測量機構16內(nèi)的循環(huán)流路內(nèi)的細胞懸浮液中的細胞濃度而配設的。也就是說，按照細胞懸浮液中的細胞濃度成為所期望的細胞濃度的方式，驅(qū)動作為液體驅(qū)動部的擠壓泵7，通過一端連接至擴增培養(yǎng)容器2的流路，將含有從擴增培養(yǎng)容器2的底面剝離的細胞的細胞懸浮液通過三通閥8而加入到細胞接種試樣調(diào)整部9內(nèi)。然后，利用擠壓泵7的驅(qū)動，從培養(yǎng)液供給部3通過三通閥8將期望量的細胞培養(yǎng)液導入至細胞接種試樣調(diào)整部9，與已經(jīng)加入的細胞懸浮液混合并稀釋。然后，將稀釋后的細胞懸浮液向細胞測量機構16的循環(huán)流路進行輸送，利用后文詳述的測定部6，測量前向散射光強度、透過率和側向散射光強度。

這里，針對細胞懸浮液所含的活細胞(vc)、低活性的活細胞(sc)和死細胞(dc)進行說明。圖2中示出作為人大腸癌細胞株的caco-2細胞的顯微鏡圖像。圖2所示的顯微鏡圖像是在以下的條件下所得到的caco-2細胞的圖像。將caco-2細胞培養(yǎng)為100％融合以上，不將粘接的細胞剝離而回收漂浮于培養(yǎng)液中的細胞。該狀態(tài)的培養(yǎng)細胞大部分活性降低，剝離細胞的一部分，細胞培養(yǎng)液中漂浮著大量死細胞。獲取細胞培養(yǎng)液的一部分，使用細胞計數(shù)器測定細胞濃度和存活率，則細胞濃度為5×10⁵細胞/ml，存活率為20％。將該試樣滴加于載玻片，用蓋玻片固定后，使用倒置顯微鏡以物鏡20倍進行拍攝的圖像，就是圖2所示的顯微鏡圖像。如圖2所示，觀察尚具有活性的活細胞(vc)19、低活性的活細胞(sc)20、不具有活性的死亡了的死細胞(dc)21?；罴毎?vc)19為發(fā)白色光，粒徑大，與此相比，死細胞(dc)21整體上著色為黑色，大多成為非粒子狀。此外，不明確細胞膜，對細胞內(nèi)部的結構變化的情況進行觀察。雖然看起來大，但是不為粒子狀，因此難以散射光。可知，低活性的活細胞(sc)20為活細胞(vc)19與死細胞(dc)21的中間的狀態(tài)，雖然發(fā)白色光，但其粒徑比活細胞(vc)19小。

圖2所示的活細胞(vc)、低活性的活細胞(sc)和死細胞(dc)為caco-2細胞時，在此先對依賴于細胞種類的粒徑的不同進行說明。關于活細胞(vc)的粒徑，就nih/3t3細胞而言為約10μm，上述人大腸癌細胞株(caco-2細胞)或人口腔粘膜上皮細胞為約14μm，人骨骼肌成肌細胞為約20μm。此外，人骨髓間充質(zhì)干細胞為約10～50μm，人軟骨細胞為約10μm。

接下來，針對圖1所示的構成細胞測量機構16的測定部6進行說明。圖3中示出測定部6的光學系統(tǒng)的概略構成圖。本實施方式中的測定部6具備：在內(nèi)部流通細胞懸浮液的流體單元23、按照相對于流通通過流體單元23的細胞懸浮液的流動方向正交的方式配設的光源22，隔著流體單元23而與光源22相對置，即按照檢測器的受光面與從光源照射的照射光的光軸相對的方式配設的透過率檢測器25。此外，測定部6具有：在透過率檢測器25側、相對于照射光的光軸具有規(guī)定的角度θ(前向散射檢測角度)而配設的前向散射光檢測器24，以及配設于與照射光的光軸垂直的軸上、該軸穿過流體單元23的大致中心、配設于與流體單元23離開規(guī)定的距離的位置的側向散射光檢測器26。這里，作為光源22，例如可以使用分光光度計、散射光度計、熒光光度計、流式細胞儀或粒度分布測定裝置等所使用的激光光源、led光源、鎢燈或氙燈等。

這里，前向散射光是相對于光源22的光軸向前方方向散射的光，測量的前向散射光強度反映粒子的大小。此外，與光軸所成的角，即前向散射檢測角度θ依賴于粒徑。因此，例如按照最適合于上述每個細胞種類的活細胞(vc)的粒徑的方式，預先調(diào)整前向散射檢測角度θ，配設前向散射光檢測器24。這樣一來，若按照與細胞種類的活細胞(vc)的粒徑相適應的角度測定散射的前向散射光強度，則只要是相同大小的粒徑的活細胞(vc)，散射光強度與活細胞(vc)的濃度(cvc)就成比例。此外，在前向散射光的測定中，需要根據(jù)細胞(活細胞(vc))的大小來選擇光源波長。在符合細胞粒徑的波長時，前向散射光強度容易依賴于細胞濃度變化，越是粒徑大的細胞，越希望照射長波長的光。來自光源22的照射光優(yōu)選像激光那樣的平行光。

此外，在細胞從活性高的狀態(tài)向活性低的狀態(tài)、即從活細胞(vc)向死細胞(dc)變化的過程中，細胞內(nèi)部的顏色變得發(fā)黑。因此，隨著細胞懸浮液中的死細胞(dc)的含有率增加，透過細胞懸浮液的光量衰減。由此，通過利用透過率檢測器25測定透過率，能夠獲得死細胞(dc)的濃度(cdc)。透過率測定中，在紫外光附近，細胞懸浮液中的所有有機成分的吸收重疊，因此變得難以正確地僅評價死細胞(dc)。此外，在通過圖1所示的培養(yǎng)液供給部3向擴增培養(yǎng)容器2導入的細胞培養(yǎng)液中，為了ph判定而添加酚紅等ph指示劑。因此，細胞培養(yǎng)液被著色為黃色～紅色，在可見光區(qū)域的波長時，受到細胞培養(yǎng)液的顏色的影響，透過率大幅降低。考慮到這些，如果在長波長區(qū)域利用透過率檢測器25檢測透過率，則能夠不受到阻礙成分的影響而穩(wěn)定地測量活細胞懸浮液中的死細胞(dc)的濃度(cdc)。

另外，就活細胞(vc)和死細胞(dc)而言，細胞內(nèi)的顆粒密度、內(nèi)部結構不同。側向散射光是以相對于如上所述的光源22的光軸呈90°的角度檢測的光，反映粒子的密度、形態(tài)。因此，通過對細胞內(nèi)的物質(zhì)進行照射光的照射，則散射的側向散射光強度的不同會反映細胞存活率。若測定細胞懸浮液中的側向散射光光譜，則在紫外區(qū)域(230nm～310nm附近)檢測到來自細胞質(zhì)的有機成分的平緩的峰，如接近可見光區(qū)域的波長，則如上所述，受到細胞培養(yǎng)液的顏色的影響。因此，依賴于細胞內(nèi)粒子的側向散射光優(yōu)選在紫外區(qū)域的短波長側進行測量。

圖4中示出圖1所示的控制部18的概略構成圖。如上所述，本實施方式中，作為一個例子，示出控制部18與細胞測量機構16協(xié)同工作，具有基于所測量的前向散射光強度、透過率和側向散射光強度，通過運算求出細胞懸浮液中的細胞存活率等的功能的情況。

控制部18具備運算處理部18a、運算程序存儲部18b、i/o界面18c和校正曲線數(shù)據(jù)庫(db)，具有將它們通過內(nèi)部總線18e相互連接的構成。i/o界面18c設為能夠獲取由構成上述測定部6的前向散射光檢測器24測量的前向散射光強度、由構成上述測定部6的透過率檢測器25測量的透過率、以及由構成上述測定部6的側向散射光檢測器26測量的側向散射光強度，并且能夠向構成測定部6的光源22發(fā)送照射光的發(fā)射指令(照射時機等)。運算程序存儲部18b存儲有活細胞濃度運算程序、死細胞濃度運算程序和細胞存活率運算程序。此外，校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中，預先存儲有表示活細胞濃度(cvc)與前向散射光強度的關系的、活細胞濃度(cvc)的運算中所使用的校正曲線(1)。表示死細胞濃度(cdc)與透過率t的關系的、死細胞濃度(cdc)的運算中所使用的校正曲線(2)也同樣地被預先存儲。此外，表示細胞存活率與側向散射光強度的關系的、細胞存活率的運算中所使用的校正曲線(3)也被預先存儲。予以說明的是，作為存儲于運算程序存儲部18b的程序，可以將活細胞濃度運算程序、死細胞濃度運算程序和細胞存活率運算程序組裝為一個程序而存儲。

運算處理部18a通過例如一個cpu或多個并列連接的cpu等處理器來實現(xiàn)。關于利用運算處理部18a的具體處理，后面在實施例中描述。運算處理部18a從運算程序存儲部18b讀取活細胞濃度運算程序，通過內(nèi)部總線18e獲取從i/o界面18c取得的前向散射光強度，并執(zhí)行活細胞濃度運算程序。并且，參照校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，使用校正曲線(1)求出活細胞懸浮液中的活細胞濃度(cvc)。此外，運算處理部18a從運算程序存儲部18b讀取死細胞濃度運算程序，通過內(nèi)部總線18e獲取從i/o界面18c取得的透過率t，并執(zhí)行死細胞濃度運算程序。并且，參照校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，使用校正曲線(2)求出活細胞懸浮液中的死細胞濃度(cdc)。進一步，當細胞懸浮液中所含的低活性的活細胞(sc)的數(shù)量無限小、可以無視時，使用上述活細胞濃度(cvc)和死細胞濃度(cdc)求出細胞存活率。

此外，與上述不同的活細胞懸浮液中所含的低活性的活細胞(sc)包含不能無視的程度的數(shù)量時，運算處理部18a在與上述同樣地求出活細胞濃度(cvcc)和死細胞濃度(cdc)后，執(zhí)行以下的處理。運算處理部18a從運算程序存儲部18b讀取細胞存活率運算程序，通過內(nèi)部總線18e獲取從i/o界面18c取得的側向散射光強度，并執(zhí)行細胞存活率運算程序。并且，參照校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，使用校正曲線(3)，進一步基于活細胞濃度(cvc)和死細胞濃度(cdc)求出細胞存活率。

如此，控制部18使用由測定部6測量的前向散射光強度、透過率t和/或側向散射光強度，并且使用預先存儲于校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中的校正曲線(1)～(3)，求出活細胞懸浮液中的細胞存活率，從而能夠不依賴于操作者的熟練度、并且不對培養(yǎng)細胞進行染色、高精度且迅速地執(zhí)行至少細胞存活率的測量。

予以說明的是，如上所述的本實施方式的細胞培裝置1求出活細胞濃度(cvc)和死細胞濃度(cdc)，因此也能夠求出活細胞(vc)數(shù)和死細胞(dc)數(shù)。此外，關于低活性的活細胞(sc)，通過對由前向散射光檢測器24所得到的前向散射光強度和由透過率檢測器25所得到的透過率t預先設定規(guī)定的閾值，從而能夠求出低活性的活細胞濃度(csc)、進一步還有低活性的活細胞(sc)數(shù)。關于閾值的設定，準備預先已知濃度的標準樣品，測定前向散射光強度和透過率t，從而得到最適當?shù)拈撝怠?/p>

以下，關于預先存儲于校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中的校正曲線(1)～(3)，以人大腸癌細胞株(caco-2細胞)的情況為例進行說明。

<表示活細胞濃度(cvc)與前向散射光強度的關系的校正曲線(1)>

圖5為表示caco-2細胞懸浮液中的活細胞濃度與前向散射光強度的關系的圖，為校正曲線(1)的說明圖。圖5所示的校正曲線(1)是將圖3所示的前向散射角度θ設為20°時的校正曲線。

首先，準備caco-2細胞懸浮液中活細胞(vc)成為活細胞濃度(cvc)100％的標準試樣，進一步準備活細胞濃度(cvc)不同的多個標準試樣。并且，將前向散射檢測角度θ調(diào)整為20°，分別使活細胞濃度(cvc)不同的標準試樣流通通過流體單元23內(nèi)，利用前向散射檢測器24測量前向散射光強度。并且，橫軸取活細胞濃度(cvc)、縱軸取所測量的前向散射光強度，進行繪制。將繪制得到的各活細胞濃度(cvc)時前向散射光強度的測定值近似為直線，制成圖5所示的校正曲線，作為校正曲線(1)存儲于圖4所示的校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中。予以說明的是，這里，將caco-2細胞的活細胞(vc)作為標準試樣而準備了多個活細胞濃度(cvc)的試樣，但不限于此。例如，也可以準備與caco-2細胞的活細胞(vc)相同粒徑的膠乳粒子，將該膠乳粒子作為標準試樣分別以不同濃度混合于細胞培養(yǎng)液，與上述同樣地測定前向散射光強度，從而制成校正曲線(1)。

<表示死細胞胞濃度(cdc)與透過率t的關系的校正曲線(2)>

圖6為表示caco-2細胞懸浮液中的各死細胞濃度時來自光源的照射光的波長與透過率t的關系的光譜圖。

首先，將caco-2細胞導入培養(yǎng)容器，收集不粘接于培養(yǎng)容器的底面而漂浮于細胞培養(yǎng)液中的細胞，攪拌后靜置10分鐘。然后，在液面附近進行分取，利用細胞計數(shù)器測定分取的細胞，得到83％為粒徑約5μm的死細胞(dc)。使用該死細胞(dc)，按照死細胞濃度(cdc)為1.5～6.0×10⁵細胞/ml、活細胞濃度(cvc)為1.8×10⁶細胞/ml的方式調(diào)制細胞懸浮液標準試樣，測定各死細胞濃度(cdc)時的透過率t光譜。其結果是如圖6所示，橫軸取來自光源的照射光的波長、縱軸取透過率t，得到死細胞濃度(cdc)為0細胞/ml、1.5×10⁵細胞/ml、3.0×10⁵細胞/ml、和6.0×10⁵細胞/ml時的光譜。

如圖6的光譜圖所示，在波長400nm以下的波長區(qū)域和450～600nm的波長區(qū)域中，在任一死細胞濃度(cdc)試樣中，透過率t均大幅減少。這是因為，波長400nm以下時，發(fā)生由細胞質(zhì)帶來的吸收，此外在450～600nm的波長區(qū)域，發(fā)生由上述那樣的ph指示劑的添加導致細胞培養(yǎng)液的著色而帶來的吸收。在該波長區(qū)域以外，作為能夠測定變黑的細胞、即死細胞(dc)帶來的照射光的吸收的波長區(qū)域，優(yōu)選為650～750nm的最適波長區(qū)域δλ。將求出該最適波長區(qū)域δλ內(nèi)的波長700nm時的透過率t的結果示于以下的表1。

[表1]

如表1所示，活細胞懸浮液中的死細胞濃度(cdc)為0細胞/ml時，得到透過率t為100.6％，死細胞濃度(cdc)為1.5×10⁵細胞/ml時，得到透過率t為96.5％，死細胞濃度(cdc)為3.0×10⁵細胞/ml時，得到透過率t為93.8％，死細胞濃度(cdc)為6.0×10⁵細胞/ml時，得到透過率t為89.3％。由此，將死細胞濃度(cdc)為0細胞/ml的試樣(細胞培養(yǎng)液等)流通通過流體單元23，利用透過率檢測器25預先測定透過率t，將該測定值作為基線存儲于存儲部(未圖示)，從而得到照射光波長700nm時的各活細胞懸浮液中的死細胞濃度(cdc)時透過率t的測量值與基線的差分，能夠?qū)⒂苫罴毎麘腋∫褐械乃兰毎?dc)帶來的透過率t的減少進行輸出。

圖7表示caco-2培養(yǎng)基中的死細胞濃度(cdc)與透過率t的關系。此外，圖8表示caco-2活細胞懸浮液中的死細胞濃度(cdc)與透過率t的關系。在圖7和圖8的任一者中，如上所述，將照射光的波長設為700nm，將死細胞濃度(cdc)為0細胞/ml的標準試樣的透過率t作為基線，求出與各死細胞濃度(cdc)的標準試樣的透過率t的差分，制成校正曲線。確認到，培養(yǎng)基中的校正曲線和活細胞懸浮液中的校正曲線的斜率相同，不受到活細胞懸浮液的影響，隨著黑色的死細胞(dc)的個數(shù)增加，透過率t衰減。由此，將圖8所示的表示死細胞濃度(cdc)與透過率t的關系的校正曲線作為校正曲線(2)存儲于圖4所示的校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中。予以說明的是，這里，將caco-2細胞的死細胞(dc)作為標準試樣而準備了多個死細胞濃度(cdc)的試樣，但不限于此。例如，也可以準備與caco-2細胞的死細胞(dc)相同粒徑的黑色粒子，將該黑色粒子作為標準試樣分別以不同的濃度混合于細胞培養(yǎng)液，與上述同樣地測定透過率t，從而制成校正曲線(2)。這里，作為黑色粒子，可使用例如磁性粒子、碳黑等。

<表示細胞存活率與側向散射光強度的關系的校正曲線(3)>

圖9為表示caco-2細胞懸浮液中的細胞培養(yǎng)液和各細胞存活率時來自光源的照射光的波長與側向散射光強度的關系的光譜圖。

首先，作為活細胞懸浮液標準試樣，調(diào)制細胞存活率0％、即僅細胞培養(yǎng)液的(空白：blank)的標準試樣、細胞存活率25％、細胞存活率40％、細胞存活率70％的細胞懸浮液標準試樣。并且，使該各細胞存活率的細胞懸浮液標準試樣流通通過流體單元23內(nèi)，利用側向散射光檢測器26測定側向散射光檢測強度。其結果是如圖9所示，橫軸取來自光源的照射光的波長、縱軸取側向散射光強度，得到細胞存活率為0％(僅細胞培養(yǎng)液)、25％、40％、70％時的光譜。

如圖9的側向散射光光譜圖所示，在紫外區(qū)域(230nm～310nm附近)，針對每種細胞存活率，相對于照射光的波長的側向散射光強度發(fā)生不同。但是，在紫外區(qū)域外，針對每種細胞存活率的側向散射光強度沒有不同，在此無法識別各細胞存活率。這是因為，如果接近如上所述的可見光區(qū)域的波長，則受到細胞培養(yǎng)液的顏色的影響。因此，依賴于細胞內(nèi)粒子的側向散射光優(yōu)選在紫外區(qū)域的短波長側進行測量。將波長280nm時側向散射光強度的測定結果示于以下的表2。

[表2]

如表2所示，活細胞懸浮液中的細胞存活率為0％時，得到側向散射光強度為17.48，細胞存活率為25％時，得到側向散射光強度為19.76，細胞存活率為40％時，得到側向散射光強度為24.31，細胞存活率為70％時，得到側向散射光強度為32.85％。由此，僅使細胞培養(yǎng)液流通通過(細胞存活率：0％)流體單元23，利用側向散射光檢測器26預先測定側向散射光強度，將該測定值作為基線存儲于存儲部(未圖示)。并且，通過得到照射光波長280nm時的各活細胞懸浮液中的細胞存活率時側向散射光強度與基線的差分，從而能夠?qū)⒒罴毎麘腋∫褐械募毎婊盥实脑黾硬糠诌M行輸出。予以說明的是，不必須限于輸出相對于基線的差分(增加部分)的構成，也可以是輸出由側向散射光檢測器26測定的側向散射光強度本身的構成。

圖10表示caco-2活細胞懸浮液中的細胞存活率與側向散射光強度的關系。如上所述，將照射光的波長設為280nm，將細胞存活率為0％(僅細胞培養(yǎng)液)的標準試樣的側向散射光強度作為基線，求出與各細胞存活率的標準試樣的側向散射光強度的差分，制成校正曲線，作為校正曲線(3)存儲于圖4所示的校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中。予以說明的是，如圖10所示，可確認側向散射光強度與細胞存活率成比例。

如上所述，根據(jù)本實施方式的細胞測量機構16和細胞培養(yǎng)裝置1，能夠不依賴于操作者的熟練度、并且不對培養(yǎng)細胞進行染色、高精度且迅速地執(zhí)行至少細胞存活率的測量。

此外，除了細胞存活率之外，還能夠求出活細胞濃度(cvc)、死細胞濃度(cdc)、活細胞(vc)數(shù)和死細胞(dc)數(shù)。此外進一步，對于低活性的活細胞(sc)也同樣地能夠求出低活性的活細胞濃度(csc)和低活性的活細胞(sc)數(shù)。

以下，使用附圖對本發(fā)明的實施例進行說明。

實施例1

本實施例的細胞培養(yǎng)裝置1與上述圖1所示的構成同樣，構成細胞測量機構16的測定部6與上述圖3所示的構成同樣，此外，控制部18的構成與上述圖4所示的構成同樣，省略重復的說明。予以說明的是，以下，將控制部18與細胞測量機構16協(xié)同工作，具有基于所測量的前向散射光強度、透過率和側向散射光強度、通過運算求出細胞懸浮液中的細胞存活率等的功能的情況作為一個例子進行說明，但不限于此，例如可以在細胞測量機構16內(nèi)設置具有上述功能的控制運算部，此外，還可以設為在后述的測定部6中配設控制運算部的構成。

此外，以下，作為培養(yǎng)細胞，以人大腸癌細胞株(caco-2細胞)為例，以預先將與圖3所示的光源22的光軸所成的角、即前向散射檢測角度θ調(diào)整為20°并測定的情況為例進行說明。予以說明的是，如上所述，前向散射檢測角度θ依賴于細胞種類的活細胞(vc)的粒徑。caco-2細胞以外的其他細胞種類的測定中最適當?shù)那跋蛏⑸錂z測角度θ可調(diào)整至約5°～45°的范圍內(nèi)。

圖11中表示利用本實施例的細胞測量機構16的細胞存活率計算處理的流程圖。首先，圖4所示的運算處理部18a從運算程序存儲部18b通過內(nèi)部總線18e讀取活細胞濃度運算程序和死細胞濃度運算程序(步驟s101)。

步驟s102中，運算處理部18a通過i/o界面18c和內(nèi)部總線18e獲取由構成測定部6的前向散射光檢測器24測定的前向散射光檢測強度。這里，獲取的前向散射光檢測強度為利用擴增培養(yǎng)機構15進行培養(yǎng)和增殖，使含有剝離后的caco-2細胞的活細胞懸浮液流通通過流體單元23內(nèi)，利用來自光源22的照射光而向前向散射的前向散射光的強度。

步驟s103中，運算處理部18a接入校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，參照圖5所示的表示caco-2細胞懸浮液中的活細胞濃度(cvc)與前向散射光強度的關系的校正曲線(1)。運算處理部18a利用該校正曲線(1)提取出與測定的前向散射光強度相對應的活細胞濃度(cvc)，從而進行活細胞濃度(cvc)的計算(步驟s104)。

接下來，在步驟s105中，運算處理部18a通過i/o界面18c和內(nèi)部總線18e獲取由構成測定部6的透過率檢測器25測定的透過率t。并且，運算處理部18a再次接入校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，參照圖8所示的表示caco-2細胞懸浮液中的死細胞濃度(cdc)與透過率t的關系的校正曲線(2)(步驟s106)。運算處理部18a利用該校正曲線(2)提取與測定的透過率t相對應的死細胞濃度(cdc)，進行該死細胞濃度(cdc)的計算(步驟s107)。予以說明的是，前向散射光強度是相對的信號，與此相對，透過率t是可以作為絕對值處理的信號。對此，與上述校正曲線(2)的制成時同樣地，在測定時也預先僅使細胞培養(yǎng)液(與細胞存活率0％等同)流通通過流體單元23，將此時測定的透過率t作為基線而存儲。并且，設定為將活細胞懸浮液向流體單元23流通時所得到的透過率t與基線的差分、即透過率t的減少進行輸出的構成。換言之，這是因為，由透過率檢測器24得到的透過率t是根據(jù)參考光進行背景修正(背景的噪聲去除)后的信號。

步驟s108中，運算處理部18a使用由步驟s104得到的活細胞濃度(cvc)和由步驟s107得到的死細胞濃度(cdc)，計算(cvc/(cvc+cdc))，求出caco-2細胞懸浮液中的細胞存活率。

予以說明的是，本實施例中，作為培養(yǎng)細胞的caco-2細胞的剪切力(sheerstress)強，容易維持高細胞存活率，并且，是由剪切力帶來的活性降低的影響小的細胞，因此，caco-2細胞懸浮液中的活細胞濃度(cvc)、死細胞濃度(cdc)和低活性的活細胞濃度(csc)可以推定為以下的關系。

低活性的活細胞濃度(csc)<<(cvc+csc+cdc)

cdc≈(csc+cdc)

如上所述，本實施例中，基于通過用光源對活細胞懸浮液進行照射光的照射而得得到的前向散射光檢測強度和透過率，可以獲得活細胞懸浮液中以未知的濃度而含有的活細胞、即細胞存活率。予以說明的是，除了細胞存活率以外，還能夠得到活細胞濃度(cvc)、死細胞濃度(cdc)、活細胞(vc)數(shù)和死細胞(dc)數(shù)。

根據(jù)本實施例，能夠不依賴于操作者的熟練度、并且不對培養(yǎng)細胞進行染色、高精度且迅速地執(zhí)行至少細胞存活率的測量。

此外，根據(jù)本實施例，為取得基線修正后的透過光的構成，利用簡易的測定部的構成，能夠得到與雙光束分光光度計同樣的測量精度。

實施例2

圖12為表示作為本發(fā)明的另一實施例的實施例2的細胞存活率計算流程圖。本實施例中，在細胞存活率的計算中，使用由構成測定部6的側向散射光檢測器26測定的側向散射光強度，在這一點上與實施例1不同。以下，對于與實施例1同樣的構成，省略其說明。

如圖12所示，步驟s101中，運算處理部18a通過內(nèi)部總線18e從運算程序存儲部18b讀取活細胞濃度運算程序和死細胞濃度運算程序，此外進一步還讀取細胞存活率運算程序。此后的步驟s102直至步驟s107為止，與實施例1同樣地執(zhí)行。

通過步驟s107進行死細胞濃度(cdc)計算后，運算處理部18a通過i/o界面18c和內(nèi)部總線18e讀取由構成測定部6的側向散射光檢測器26測定的側向散射光強度(步驟s109)。

步驟s110中，運算處理部18a接入校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，參照圖10所示的表示caco-2細胞懸浮液中的細胞存活率與側向散射光強度的關系的校正曲線(3)。

步驟s111中，運算處理部18a使用由步驟s104得到的活細胞濃度(cvc)和由步驟s107得到的死細胞濃度(cdc)，對參照的校正曲線(3)的y截距進行修正。具體而言，預先使用實際試樣的細胞種類(這里為caco-2細胞)，準備細胞存活率約100％的細胞懸浮液。并且，利用前向散射光檢測器24和側向散射光檢測器26測定并求出該細胞懸浮液中的活細胞濃度(cvc)與側向散射光強度的關系。予以說明的是，細胞存活率約100％的細胞懸浮液可以通過離心分離操作而將懸浮液中的廢物、小的死細胞除去而得到。但是，關于再生醫(yī)療、細胞治療所使用的樣本、株化了的初代培養(yǎng)細胞等，根據(jù)細胞種類，在細胞剝離操作、離心分離操作的過程中容易受到損傷、細胞活性降低，無法維持細胞存活率約100％。這種情況下，求出細胞剝離、離心分離操作中所得到的細胞懸浮液的平均最大細胞存活率。例如，就人口腔粘膜上皮細胞而言，最大細胞存活率為85～90％左右。求出最大細胞存活率時活細胞濃度(cvc)與側向散射光強度的關系，存儲于存儲部。使用該最大細胞存活率時活細胞濃度(cvc)與側向散射光強度的關系，由步驟s104和步驟s107得到的活細胞濃度(cvc)和死細胞濃度(cdc)來求出最大細胞存活率時的側向散射光強度。使用該求出的側向散射光強度的值，對校正曲線(3)的y截距進行修正。

接下來，步驟s112中，運算處理部18a使用修正后的校正曲線(3)來提取與測定的側向散射光強度相對應的細胞存活率，從而進行細胞存活率的計算(步驟s112)。予以說明的是，將由步驟s111修正了y截距的校正曲線(3)代替校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中已經(jīng)存儲的校正曲線(3)而進行存儲。也就是說，更新為修正后的校正曲線(3)并存儲。

本實施例中也與實施例1同樣地，作為培養(yǎng)細胞的caco-2細胞的剪切力(sheerstress)強，容易維持高細胞存活率，并且，是由剪切力帶來的活性降低的影響小的細胞，因此，caco-2細胞懸浮液中的活細胞濃度(cvc)、死細胞濃度(cdc)和低活性的活細胞濃度(csc)推定為以下的關系。

低活性的活細胞濃度(csc)<<(cvc+csc+cdc)

cdc≈(csc+cdc)

根據(jù)本實施例，除了實施例1的效果之外，通過修正校正曲線(3)并計算細胞存活率，能夠進一步高精度地測量細胞存活率。

實施例3

圖13表示作為本發(fā)明的另一實施例的實施例3的細胞存活率計算流程圖。實施例1和實施例2中，對于活細胞懸浮液中的低活性的活細胞濃度(csc)為低到可以無視的情況、即可以為設想cdc≈(csc+cdc)的情況進行了說明。本實施例中，對不設想為cdc≈(csc+cdc)時活細胞懸浮液中的細胞存活率進行計算，在這一點上與實施例1和實施例2不同。以下，對于實施例1和實施例2同樣的構成，省略其說明。

一般而言，活細胞懸浮液試樣中的低活性的活細胞(sc)的粒徑比活細胞(vc)的粒徑小，比死細胞(dc)的粒徑大。因此，即使假設低活性的活細胞(sc)的粒徑與死細胞(dc)的粒徑基本相同，對于為了計算活細胞濃度(cvc)而使用的校正曲線(1)也沒有影響。但是，假設與活細胞(vc)的粒徑接近的大小的低活性的活細胞(sc)大量存在于活細胞懸浮液中時，對校正曲線(1)的斜率產(chǎn)生影響。

如圖13所示，運算處理部18a與上述的實施例1同樣地執(zhí)行步驟s101直至步驟s107為止。然后，運算處理部18a利用由步驟s104得到的活細胞濃度(cvc)和由步驟s107得到的死細胞濃度(cdc)，計算低活性的活細胞濃度(csc)和總細胞數(shù)，即活細胞(vc)數(shù)+死細胞(dc)數(shù)+低活性的活細胞(sc)數(shù)(步驟s201)。

步驟s202中，運算處理部18a計算以下內(nèi)容(步驟s202)。

((cvc+csc+cdc)-cdc)/(cvc+csc+cdc)

并且，比較上述計算結果與cvc/(cvc+cdc)(與圖11所示的步驟s108同樣)。比較結果大幅不同，從而判明與活細胞(vc)的粒徑接近的大小的低活性的活細胞(sc)大量存在于活細胞懸浮液中。此外，由步驟s104可知，使用校正曲線(1)計算的活細胞濃度(cvc)不是正常值。在此，進入用于修正校正曲線(1)的處理。

首先，步驟s203中，將活細胞懸浮液放置一定時間(δt)。在該δt的期間，低活性的活細胞(sc)的一部分成為死細胞(dc)，低活性的活細胞(sc)數(shù)從δt放置前的時刻ta時的個數(shù)減少到δt經(jīng)過后的時刻tb時的個數(shù)。此外，死細胞(dc)數(shù)從δt放置前的時刻ta時的個數(shù)增加到δt經(jīng)過后的時刻tb時的個數(shù)。

步驟s204中，運算處理部18a將從側向散射光強度得到的細胞存活率作為x軸，將由透過率t得到的細胞存活率作為y軸，對時刻ta和時刻tb的各細胞存活率進行繪制。關于將這些被繪制的兩點間連接的直線的斜率，假設當?shù)突钚缘幕罴毎麧舛?csc)為“0”時，直線的斜率成為“1”。但是，實際的直線的斜率從“1”背離。因此，計算由低活性的活細胞(sc)產(chǎn)生的這種背離、即直線的斜率的差分，作為偏差。

步驟s205中，運算處理部18a使用步驟s204中求出的偏差，對存儲于校正曲線數(shù)據(jù)庫18d的校正曲線(1)進行修正，使用修正后的校正曲線(1)，再次提取出與測定的前向散射光強度相對應的活細胞濃度(cvc)，從而計算活細胞濃度(cvc)。予以說明的是，將由步驟s205修正的校正曲線(1)代替校正曲線數(shù)據(jù)庫18d中已經(jīng)存儲的校正曲線(1)而進行存儲。也就是說，更新為修正后的校正曲線(1)并存儲。

步驟s206中，基于由步驟s205計算的活細胞濃度(cvc)和由步驟s107得到的死細胞濃度(cdc)，通過以下來計算細胞存活率。

(cvc+csc)/(cvc+csc+cdc)

根據(jù)本實施例，除了實施例1的效果之外，即使在活細胞懸浮液中大量存在低活性的活細胞(sc)時，也能高精度地求出細胞存活率。

予以說明的是，可設為如下的構成：代替本實施例的步驟s205，基于由步驟s204得到的偏差，改變前向散射檢測角度θ，按照與存儲于校正曲線數(shù)據(jù)庫18d的校正曲線(1)的斜率一致的方式，調(diào)整前向散射光檢測器24的配置位置。

此外，預先準備與活細胞(vc)的粒徑小的膠乳粒子，將該膠乳粒子作為近似的低活性的活細胞(sc)，添加至校正曲線(1)的制成時所使用的標準試樣。并且，求出對于作為存儲于校正曲線數(shù)據(jù)庫18d的校正曲線(1)的、活細胞濃度(cvc)與前向散射光強度的關系所帶來的影響。并且，制成向標準試樣添加了濃度不同的膠乳粒子時的校正曲線，重新存儲至校正曲線數(shù)據(jù)庫18d，從而在活細胞懸浮液中大量存在低活性的活細胞(sc)時，可以作為活細胞濃度(cvc)的計算所使用的校正曲線。在該情況下，所使用的膠乳粒子的粒徑優(yōu)選設為活細胞(vc)的粒徑±數(shù)μm，即使最低也優(yōu)選使用一種以上粒徑的膠乳粒子。

實施例1至實施例3中，作為培養(yǎng)細胞的一個例子，示出了caco-2細胞，但在培養(yǎng)其他細胞種類、例如nih/3t3細胞、人口腔粘膜上皮細胞、人骨骼肌成肌細胞、人骨髓間充質(zhì)干細胞或人軟骨細胞等各種細胞時也同樣可以適用。

予以說明的是，本發(fā)明不限定于上述實施例，還包含各種變形例。例如，上述實施例是為了易懂地說明本發(fā)明而詳細說明的實施例，并不必限定為具備所說明的全部構成。此外，某一實施例的構成的一部分可以被替換成另一實施例的構成，此外，可以在某一實施例的構成中加入另一實施例的構成。此外，對于各實施例的構成的一部分，可以進行另一實施例的構成的追加、刪除、替換。

符號說明

1：細胞培養(yǎng)裝置；2：擴增培養(yǎng)容器；3：培養(yǎng)液供給部；4：試樣導入部；5：分散部；6：測定部；7：擠壓泵；8：三通閥；9：細胞接種試樣調(diào)制部；10：細胞供給部；11：細胞洗滌溶液供給部；12：細胞剝離溶液供給部；13：細胞剝離溶液抑制劑供給部；14：廢液；15：擴增培養(yǎng)機構；16：細胞測量機構；17：細胞接種機構；18：控制部；18a：運算處理部；18b：運算程序存儲部；18c：i/o界面；18d：校正曲線數(shù)據(jù)庫(db)；18e：內(nèi)部總線；19：活細胞；20：低活性活細胞；21：死細胞；22：光源；23：流體單元；24：前向散射光檢測器；25：透過率檢測器；26：側向散射光檢測器。