本發(fā)明涉及對(duì)低水平放射線反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因的檢測(cè)方法，更詳細(xì)而言，涉及對(duì)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠照射低水平放射線，然后采集胸腺并檢測(cè)共同或單獨(dú)表達(dá)的dna修復(fù)相關(guān)基因，并進(jìn)行擴(kuò)增，然后測(cè)定表達(dá)量的方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)中，為了找出對(duì)低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線敏感的基因而利用了多種方法，但是沒(méi)有確認(rèn)到分子性的蛋白質(zhì)水平，對(duì)于本發(fā)明中提出的基因，不僅確認(rèn)了rna，還確認(rèn)了蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異。并且，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于dna損傷和修復(fù)相關(guān)的基因，沒(méi)有對(duì)照射低水平放射線的健康的小鼠和發(fā)生癌癥的小鼠進(jìn)行比較來(lái)確認(rèn)，本發(fā)明中發(fā)掘出的基因并未在現(xiàn)有技術(shù)中被已知為對(duì)低水平放射線敏感的基因。對(duì)低水平放射線敏感的基因表達(dá)譜的發(fā)掘中的現(xiàn)有技術(shù)如下所示。i)對(duì)人骨髓性白血病細(xì)胞株照射2～50cgy放射線，然后確認(rèn)cdkn1a、gadd45a、mdm2、btg2、phlda3等基因的表達(dá)(amundson等，2003)ii)為了用于放射線事故時(shí)的劑量評(píng)價(jià)，對(duì)人血液照射0.5、2、8gy，然后發(fā)現(xiàn)根據(jù)劑量反應(yīng)的fdxr、cdkn1a、phpt1、bbc3、sesn1基因(paul和amundson，2008)iii)對(duì)c57bl/6j小鼠以0.032～13μgy/分鐘照射放射線485天，然后采集腎臟和睪丸，并通過(guò)微陣列(microarray)發(fā)現(xiàn)了對(duì)低水平放射線敏感的基因(taki等，2009)iv)對(duì)c57bl/6j雄性小鼠以17～20mgy/天、0.86～1.0mgy/天照射放射線401～485天(8gy、0.4gy或0.02gy)，然后采集肝并利用微陣列和逆轉(zhuǎn)錄核酸擴(kuò)增法發(fā)現(xiàn)了對(duì)低水平放射線敏感的基因(uehara等，2010)v)利用微陣列和定量核酸擴(kuò)增法在照射低水平放射線的黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)39個(gè)對(duì)低水平放射線敏感的基因(seong等，2011)vi)對(duì)人血液照射0、0.02、0.1、0.5、1、2、4gy放射線，然后通過(guò)微陣列發(fā)掘出共9個(gè)對(duì)低水平放射線敏感的基因，并且為了用于生物學(xué)劑量評(píng)估，按劑量進(jìn)行照射后按時(shí)間選取表達(dá)量具有差異的基因組(knops等，2012)。vii)對(duì)斑馬魚(zebradanio)胚胎和成體照射0.1或1gy的放射線，然后利用肝的mrna實(shí)施微陣列和定量核酸擴(kuò)增法，并發(fā)掘出對(duì)放射線敏感的基因(jaafar等，2013)viii)通過(guò)微陣列在照射5～500mgy的放射線的人血液中發(fā)掘出對(duì)低水平放射線敏感的基因(nosel等，2013)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明人在研究因放射線引起的癌癥時(shí)，通常利用細(xì)胞株的研究結(jié)果難以直接適用于人或動(dòng)物來(lái)解釋，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況下，一般利用最多的是小鼠，但由于癌發(fā)病率低，并且低水平放射線的影響直到表現(xiàn)為人體影響方面有很多限制，因此為了彌補(bǔ)這種缺點(diǎn)，利用胸腺癌模型akr/j小鼠和通常用在癌癥研究中的正常icr小鼠，并通過(guò)以下方法分析個(gè)體之間的差異，從而完成了本發(fā)明。1)對(duì)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠照射低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線，然后在胸腺中發(fā)掘出對(duì)低水平放射線敏感的基因表達(dá)譜(profile)，然后，2)以dna修復(fù)相關(guān)基因?yàn)橹行倪M(jìn)行鑒定后對(duì)其功能進(jìn)行分析?？偨Y(jié)而言，本發(fā)明的目的在于提供對(duì)低水平放射線反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因的檢測(cè)方法，其包括以下步驟：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對(duì)在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進(jìn)行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測(cè)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨(dú)表達(dá)的dna修復(fù)相關(guān)基因；以及(5)對(duì)所述步驟(4)中檢測(cè)出的基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)定表達(dá)量。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供對(duì)低水平放射線反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因的檢測(cè)方法，其包括以下步驟：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對(duì)在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進(jìn)行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測(cè)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨(dú)表達(dá)的dna修復(fù)相關(guān)基因；以及(5)對(duì)所述步驟(4)中檢測(cè)出的基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)定表達(dá)量。所述步驟(1)的特征在于，低水平放射線劑量為0.7mgy/小時(shí)。所述步驟(1)的特征在于，使在0.7mgy/小時(shí)的低水平放射線環(huán)境中的累計(jì)劑量達(dá)到1.7gy來(lái)進(jìn)行飼養(yǎng)。所述步驟(5)的特征在于，用選自cyp11a1、ptgs2、rnd3、plxncl及cyp2el中的引物對(duì)dna修復(fù)相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增。所述步驟(5)的特征在于，通過(guò)維恩圖、定量核酸擴(kuò)增法、特殊蛋白質(zhì)檢測(cè)檢查及統(tǒng)計(jì)程序sas測(cè)定表達(dá)量。發(fā)明效果根據(jù)如上所述的本發(fā)明提供包括以下步驟的對(duì)低水平放射線反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因的檢測(cè)方法：(1)在低水平放射線環(huán)境中飼養(yǎng)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠；(2)采集所述步驟(1)中飼養(yǎng)的胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠的胸腺；(3)對(duì)在所述步驟(2)中采集的胸腺的基因進(jìn)行分析；(4)在所述步驟(3)中分析的基因中檢測(cè)胸腺癌模型akr/j小鼠和正常icr小鼠中共同或單獨(dú)表達(dá)的dna修復(fù)相關(guān)基因；以及(5)對(duì)所述步驟(4)中檢測(cè)出的基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)定表達(dá)量。通過(guò)提供上述方法能夠帶來(lái)以下效果：能夠用作評(píng)價(jià)產(chǎn)業(yè)及醫(yī)療從事人員的放射線暴露與致癌之間的相關(guān)性的低水平放射線dna修復(fù)指標(biāo)基因，并且不僅能夠用作評(píng)價(jià)癌癥患者的癌癥進(jìn)展及治療程度的低水平放射線dna修復(fù)基因，而且還能夠用作評(píng)價(jià)放射線和致癌的因果關(guān)系的低水平dna修復(fù)指標(biāo)。附圖說(shuō)明圖1為對(duì)于在實(shí)驗(yàn)例1的dna損傷/修復(fù)相關(guān)基因中對(duì)低水平放射線顯示種類特異性反應(yīng)的基因，利用核酸擴(kuò)增法確認(rèn)相對(duì)表達(dá)量的圖表。圖2為示出實(shí)驗(yàn)例2的照射低水平放射線的akr/j和jcr小鼠的胸腺蛋白質(zhì)的分析結(jié)果的圖表。((1)低水平放射線dna修復(fù)基因(cyp11a、rnd3、plxnc1)蛋白質(zhì)量，(2)加樣對(duì)照(loadingcontrol)，(3)特殊蛋白質(zhì)檢測(cè)法的定量分析，測(cè)定各條帶(band)的密度后用β-微管蛋白(tubulin)密度值來(lái)定量化)圖3為圖示化了低水平放射線照射所引起的小鼠胸腺的分子變化。具體實(shí)施方式下面，將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。通常而言，已知高劑量放射線會(huì)引起dna損傷、產(chǎn)生癌癥，然而，另一方面，已知低劑量放射線會(huì)修復(fù)受損的dna、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、促進(jìn)免疫活性和抗氧化功能，從而抑制癌癥。然而，未滿足聯(lián)合國(guó)原子輻射效應(yīng)科學(xué)委員會(huì)(unscear，2000)提出的低劑量率放射線(6≥mgy/h)標(biāo)準(zhǔn)的情況較多。此外，利用細(xì)胞株而確保的研究結(jié)果難以直接適用于人體來(lái)解釋，即使是在利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況下，對(duì)于低水平放射線對(duì)dna修復(fù)帶來(lái)的影響，在現(xiàn)有技術(shù)中也沒(méi)有確認(rèn)到蛋白質(zhì)水平。本發(fā)明中，在低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線環(huán)境下飼養(yǎng)akr/j小鼠和正常小鼠(icr)，并在達(dá)到開(kāi)始死亡的時(shí)期(100天)時(shí)，采集胸腺并分析了基因。此外，采集了在相同的條件下飼養(yǎng)的正常小鼠(icr)的胸腺，并分析了基因。最終，對(duì)兩種小鼠中共同或單獨(dú)表達(dá)的dna修復(fù)相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)蛋白質(zhì)檢測(cè)最終發(fā)掘出基因組(genome)、蛋白質(zhì)組(proteome)。下面，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。這些實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不解釋為被限定于這些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例1本發(fā)明中，從日本靜岡縣實(shí)驗(yàn)室(shizuokalaboratory)中心購(gòu)入雌性(7周齡)akr/j和icr小鼠，并在附有特定病原菌的設(shè)施中飼養(yǎng)1周而使其穩(wěn)定化。各組利用5只小鼠并在低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線環(huán)境下飼養(yǎng)100天(累計(jì)劑量為共1.7gy)，然后采集胸腺并在液體氮中急速冷凍后實(shí)施了基因分析。比較照射低水平放射線的akr小鼠和icr小鼠的胸腺，并發(fā)掘出對(duì)低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因并解釋了功能。利用維恩圖、定量核酸擴(kuò)增法、特殊蛋白質(zhì)檢測(cè)檢查及統(tǒng)計(jì)程序sas(方差分析(anova)，t-檢驗(yàn)(t-test))進(jìn)行了分析。另外，為了對(duì)于在照射低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線的小鼠胸腺中產(chǎn)生敏感反應(yīng)的dna修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)量，所使用的引物堿基序列如下述表1所示。表1基因號(hào)基因名稱正向(5'→3')反向(5'→3')nm_019779cyp11a1cctggaagaaagaccgaatctgcttgatgcgtctgtgtaanm_011198ptgs2agaacctgcagtttgctgtggctcctgcttgagtatgtcgnm_028810pnd3tatgacaacgtccgtccactcctggatttcacctttccacnm_018797plxnc1tcctcatcccatgaagaacacgctgctaagcactctgaacnm_021282cyp2eltctcttcaacaaacgcttcgccagggagtactcagcaggt實(shí)驗(yàn)例1.dna損傷/修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)量測(cè)定對(duì)akr/j和icr小鼠照射低水平(0.7mgy/小時(shí))放射線，然后在癌癥發(fā)生初期階段(100天)采集胸腺，然后利用核酸擴(kuò)增法確認(rèn)了在dna損傷/修復(fù)相關(guān)基因中對(duì)低水平放射線顯示種類特異性反應(yīng)的基因的相對(duì)表達(dá)量。其結(jié)果如圖1所示，在照射低水平放射線的akr/j小鼠中，cyp11a1、ptgs2、rnd3、plxnc1等對(duì)低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應(yīng)，在icr小鼠中，cyp2e1等對(duì)低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應(yīng)。實(shí)施例2.照射低水平放射線的akr/j和icr小鼠胸腺的蛋白質(zhì)分析對(duì)于實(shí)施例1中的照射低水平放射線的情況下的蛋白質(zhì)和作為對(duì)照組的照射高水平放射線(0.8gy/分鐘，總劑量：4.5gy)的小鼠胸腺的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析。其結(jié)果如圖2所示，鑒定了在照射低水平放射線的akr/j小鼠中cyp11a1、rnd3、plxnc1等對(duì)低水平放射線產(chǎn)生了種類特異性的敏感反應(yīng)。以上，對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)記述，這些具體的記述只是優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的范圍并不限定于此，這對(duì)具有本領(lǐng)域常規(guī)知識(shí)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明確的。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍定義為附上的權(quán)利要求及其等價(jià)物。序列表自由文本(freetext)附上電子文件。當(dāng)前第1頁(yè)12