一種抗人Tim-3的單克隆抗體的抗原結(jié)合部分技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還涉及上述單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的用途，包括制備人Tim-3蛋白免疫檢測(cè)工具、制備治療與Tim-3異常表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物制劑。

背景技術(shù)：
2001年，McIntire等研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的基因家族，結(jié)構(gòu)上含有免疫球蛋白V區(qū)和粘蛋白區(qū)，因此命名為T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子(Tcellimmunoglobulin-andmucin-domain-containingmolecules，Tim)家族。Tim蛋白特定地表達(dá)于Th1或Th2細(xì)胞上，是新的區(qū)分Th1和Th2的重要標(biāo)志，在T細(xì)胞分化、T細(xì)胞效應(yīng)功能以及自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘等疾病中發(fā)揮重要作用。人的Tim基因家族定位在染色體5q33.2上，包括3個(gè)基因，Tim-1、Tim-3、Tim-4。Tim-3基因編碼含有281個(gè)氨基酸的I型膜蛋白，Tim-3蛋白特異性表達(dá)于活化的Th1、Th17效應(yīng)細(xì)胞表面，而不表達(dá)于Th2。細(xì)胞Tim-3蛋白通過與Tim-3配體相互作用調(diào)節(jié)Th1的免疫應(yīng)答。Gal-9是Tim-3的天然配體，Gal-9/Tim-3信號(hào)通路通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡在免疫耐受的誘導(dǎo)及自身免疫病防治中發(fā)揮重要作用。Tim-3參與炎癥發(fā)生發(fā)展過程，并通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化及功能，抑制組織破壞性免疫應(yīng)答，而在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的一種自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦組織和淋巴結(jié)中Tim-3表達(dá)上調(diào)，阻斷Tim-3信號(hào)通路后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞明顯增加。非肥胖癥糖尿病是一種自身免疫性疾病，構(gòu)建非肥胖癥糖尿病小鼠模型，使用Tim-3單克隆處理加速了小鼠非肥胖癥糖尿病發(fā)生，可能機(jī)制為：Tim-3與Tim-3L結(jié)合，對(duì)Th1細(xì)胞產(chǎn)生抑制性信號(hào)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，從而降低炎癥，降低自身免疫應(yīng)答；阻斷了Tim-3信號(hào)通路后促進(jìn)了自身免疫應(yīng)答，加速了炎癥。在一些自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘等疾病中，由于Tim-3表達(dá)的升高，導(dǎo)致Th1細(xì)胞的功能受到抑制，進(jìn)而打破體內(nèi)的免疫平衡，引起病理性的Th2細(xì)胞的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致疾病的發(fā)病。在這種情況下，任何阻斷Tim-3信號(hào)通路的方法均能有利于體內(nèi)免疫平衡的恢復(fù)，緩解疾病的進(jìn)程。例如給哮喘模型動(dòng)物注射抗Tim-3抗體或重組Tim-3融合蛋白均能通過阻斷Tim-3與其配體的結(jié)合，增強(qiáng)Th1細(xì)胞活性，糾正由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的哮喘癥狀，恢復(fù)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞平衡。上述研究資料表明，Tim-3通路具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，Tim-3表達(dá)的異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。盡管研究表明Tim-3的中和抗體在某些疾病模型中發(fā)揮了很好的干預(yù)作用，但是，目前并沒有上市的具有中和活性的Tim-3抗體。因此，提供一種特異性強(qiáng)的Tim-3抗體，對(duì)某些疾病的發(fā)病機(jī)理研究、疾病診斷和治療具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供了一種抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分能夠特異性的結(jié)合Tim-3蛋白，抑制Tim-3蛋白的活性，即本發(fā)明的抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分既具有與Tim-3蛋白結(jié)合的結(jié)合活性又具有中和Tim-3蛋白活性的中和活性。本發(fā)明的目的之二在于提供上述抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的用途。所述用途包括用于制備免疫檢測(cè)工具，還包括制備治療與Tim-3表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物制劑。本發(fā)明的目的之三在于提供一種檢測(cè)人Tim-3的方法。所述方法利用了上述抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分與Tim-3的結(jié)合活性。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分包括輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、輕鏈CDR3、重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3；輕鏈CDR1具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；輕鏈CDR2具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；輕鏈CDR3具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；重鏈CDR1具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；重鏈CDR2具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；重鏈CDR3具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的單克隆抗體，其輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。進(jìn)一步，本發(fā)明的單克隆抗體可以是全單克隆抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或單鏈抗體中的任意一種，只要其能與人Tim-3蛋白結(jié)合并能中和Tim-3的功能活性即可。Fab是指含有一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)和一條重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來(lái)的抗體分子的一部分。Fab’是指包含了部分鉸鏈區(qū)的Fab片段。F(ab’)2指的是Fab’的二聚體。Fv指的是能結(jié)合完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體的最小片段。一個(gè)Fv片段包括一條輕鏈的可變區(qū)結(jié)合到一條重鏈的可變區(qū)。單鏈抗體指的是由輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)直接相連或通過一個(gè)肽鏈連接而成的工程抗體(Houston1988)。本發(fā)明提供的上述單克隆抗體可以由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體L3B的步驟如下：(1)BALB/c小鼠免疫；(2)細(xì)胞融合：取步驟(1)的免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合；(3)篩選雜交瘤細(xì)胞；(4)進(jìn)行抗體類型及亞型鑒定；(5)雜交瘤的培養(yǎng)；(6)單克隆抗體的純化。步驟(1)的詳細(xì)操作過程如下：將溶于PBS的重組人Tim-3抗原溶液與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合乳化，經(jīng)四肢肌肉多點(diǎn)注射，每只每次注射重組Tim-3抗原5μg(總體積50μL)。首次免疫后15d和29d，分別用同樣劑量的重組抗原溶液加弗氏不完全佐劑(IFA)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。融合前72h，尾靜脈加強(qiáng)注射5μg不加佐劑的抗原1次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。制備雜交瘤細(xì)胞使用的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)該具有融合率高，抗體分泌能力穩(wěn)定、對(duì)HAT(Sigma)-RPMI1640培養(yǎng)液敏感等能力。優(yōu)選地，骨髓瘤細(xì)胞首選鼠源骨髓瘤，如MOP-21和MC-11小鼠腫瘤衍生株(THESalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，Calif.USA)，和SP2/0或X63-Ag8-653細(xì)胞株(AmericanTypeCultureCollection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究報(bào)道利用人骨髓瘤和人鼠異源骨髓瘤細(xì)胞株制備人單抗(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，骨髓瘤細(xì)胞選用SP2/0。步驟(2)的詳細(xì)操作過程如下：先把脾臟研磨得到脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按1/6于脾細(xì)胞的數(shù)量取培養(yǎng)的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，混合后離心，經(jīng)50％聚乙二醇(PEG2000)作用1min，使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。加入50mL含有20％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸融合細(xì)胞，將細(xì)胞懸液與等體積的飼養(yǎng)細(xì)胞混合后，分置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200μL/孔)于5％CO2培養(yǎng)箱(ESPECBNA-311)37℃培養(yǎng)。3d后，用含有20％FBS的HT培養(yǎng)基(含有1.361mg黃嘌呤(hypoxanthn，H)、0.388mg胸腺嘧啶核苷(thymidine，T))，加入RPMI1640(GIBCO公司)培養(yǎng)基至100mL，45-50℃條件下溶解后，過濾除菌。半保留換液。雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液用于檢測(cè)針對(duì)特異抗原的單抗的產(chǎn)生。測(cè)定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗結(jié)合特異性的方法有免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，流式細(xì)胞術(shù)(FACS)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，篩選表達(dá)Tim-3抗體的雜交瘤細(xì)胞使用的是間接ELISA方法，該方法的具體操作步驟如下：用10μg/mL重組人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板，于4℃過夜并封閉。依次加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，以及1：500稀釋的50μLHRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。當(dāng)雜交瘤產(chǎn)生的抗體的特異性、親和力和反應(yīng)性確定之后，目的細(xì)胞株可以通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。合適的培養(yǎng)液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，雜交瘤細(xì)胞還可以腹水瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。通過有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的亞克隆化的具體操作步驟如下：用間接ELISA法篩選陽(yáng)性的細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100％陽(yáng)性。雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法：①在克隆化的當(dāng)天或前1天制備滋養(yǎng)細(xì)胞：脫頸處死昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮膚，無(wú)菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mL1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用加20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1mL。②取少許待作克隆化的雜交瘤細(xì)胞移至另一無(wú)菌試管中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。③有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。④將培養(yǎng)板置于37℃的5％CO2孵箱中培養(yǎng)，5天后在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將雜交瘤細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)，具體操作步驟如下：穩(wěn)定的雜交瘤單克隆抗體細(xì)胞株先在CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)96孔培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至24孔，再轉(zhuǎn)移至50mL細(xì)胞瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)。取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL/只液狀石蠟，1-2周后，每只小鼠腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7-10d后收集腹水。3000rpm離心15min，吸取中間澄清部分的液體，0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存。利用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將亞克隆細(xì)胞分泌的單抗從細(xì)胞培養(yǎng)液、腹水或血清中分離出來(lái)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，分離純化單克隆抗體采用的是透析的方法，具體操作過程如下：將腹水用0.02M、pH7.4的PBS(81mL0.2MNa2HPO4，19mL0.2MNaH2PO4，加生理鹽水至1L)對(duì)倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15min，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15min，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12,000rpm離心15min，棄上清。將沉淀溶于適量的PBS中，裝入透析袋中，放入50-100倍含20mMNaCl，pH7.8的120mMTris-HCl緩沖液中4℃攪拌下脫鹽12h左右，期間更換3次以上透析液。取出后分裝-20℃保存。本發(fā)明的單抗還可以通過基因工程重組技術(shù)獲得。利用特異性結(jié)合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如E.coli細(xì)胞、猿猴COS、CHO細(xì)胞、或其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)并表達(dá)目標(biāo)抗體。本發(fā)明的單克隆抗體片段可以利用水解完整的抗體分子獲得(參見Morimoto等人，J.Biochem.Biophys.Methods24：107-117(1992)andBrennan等人，Science229：81(1985))。另外，這些抗體片段也可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(reviewedinHudson，Curr.Opin.Immunol.11：548-557(1999)；Little等人，Immunol.Today，21：364-370(2000))。比如，F(xiàn)ab’片段可以直接從E.coli細(xì)胞中獲得或化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter等人，Bio/Technology，10：163-167(1992))。再如，F(xiàn)(ab’)2片段可以用亮氨酸拉鏈GCN4連接獲得。另外，F(xiàn)v、Fab、Fab’或F(ab’)2片段也可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全知曉制備抗體片段的其它技術(shù)。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)氨基酸序列的DNA編碼序列：SEQIDNO:7所示的氨基酸序列的DNA編碼序列如SEQIDNO:9所示；SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的DNA編碼序列如SEQIDNO:10所示。本發(fā)明還提供了獲得單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列的方法。利用特異性結(jié)合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如E.coli細(xì)胞、猿猴COS、CHO細(xì)胞、或其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)并表達(dá)目標(biāo)抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，獲得單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)核苷酸序列和氨基酸序列的方法的具體操作步驟如下：1、抗人Tim-3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建首先，獲得人Tim-3蛋白，免疫BALB/c小鼠，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。用間接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100％陽(yáng)性。對(duì)所得雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了染色體核型分析，雜交瘤細(xì)胞染色體平均數(shù)目為108條，用雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證明所得雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG2a。2、單克隆抗體L3B的輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)基因的釣取和輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)基因的確定提取所得雜交瘤細(xì)胞的RNA，經(jīng)RT-PCR，用特異性引物分別釣取抗體的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因。采用常規(guī)方法將所得輕鏈可變區(qū)基因轉(zhuǎn)入載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定正確后，進(jìn)行DNA測(cè)序；將所得重鏈可變區(qū)基因轉(zhuǎn)入載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定正確后，進(jìn)行DNA測(cè)序；經(jīng)序列分析、比對(duì)，獲得了單克隆抗體L3B的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因。所得單克隆抗體L3B的輕鏈可變區(qū)基因序列為SEQIDNO:9所示核苷酸序列，重鏈可變區(qū)基因序列為SEQIDNO:10所示核苷酸序列。3、單克隆抗體L3B輕鏈、重鏈可變區(qū)氨基酸序列的確定用www.expasy.org在線軟件將編碼人Tim-3單克隆抗體L3B的輕鏈、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體L3B的輕鏈、重鏈可變區(qū)氨基酸序列分別為SEQIDNO：7所示氨基酸序列、SEQIDNO：8所示氨基酸序列所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)輕鏈CDR1、輕鏈CDR2和輕鏈CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)重鏈CDR1、重鏈CDR2和重鏈CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQIDNO：4、SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示的核苷酸序列。本發(fā)明中“載體”一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)。舉例來(lái)說，載體包括：質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或P1來(lái)源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動(dòng)物病毒等。用作載體的動(dòng)物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。載體還有可能包括協(xié)助其進(jìn)入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的載體質(zhì)粒為pcDNA3.1質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含上述表達(dá)載體。本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”一詞指的是導(dǎo)入載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK293細(xì)胞或人細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞。進(jìn)一步，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種利用基因重組技術(shù)制備前面所述的抗人Tim-3的單克隆抗體L3B的方法，所述方法的具體操作步驟如下：(1)獲得編碼輕鏈的DNA分子，該DNA分子包含具有SEQIDNO:9所示核苷酸序列；獲得編碼重鏈的DNA分子，該DNA分子包含具有SEQIDNO:10所示核苷酸序列；(2)取步驟1所得編碼輕鏈的DNA分子，與第一表達(dá)載體融合，構(gòu)建第一重組表達(dá)載體；取步驟1所得編碼重鏈的DNA分子與第二表達(dá)載體融合，構(gòu)建第二重組表達(dá)載體；(3)取所得步驟2所得第一重組表達(dá)載體、第二重組表達(dá)載體，引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，表達(dá)，純化，即得?，F(xiàn)有技術(shù)中存在多種將核酸引入宿主細(xì)胞的方法。對(duì)于真核細(xì)胞而言，適宜的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如牛痘，對(duì)于昆蟲細(xì)胞，使用桿狀病毒。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞而言，適宜的技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔和使用細(xì)菌噬菌體的轉(zhuǎn)染。例如通過在使基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，在引入之后引起或允許核酸的表達(dá)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，將核酸引入宿主細(xì)胞使用是脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的方法。本發(fā)明提供了一種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物含有：(a)本發(fā)明的單克隆抗體L3B或其抗原結(jié)合部分；和(b)選自下組的偶聯(lián)部分：藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、或酶。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括前面所述的抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分和藥劑學(xué)上可接受的載劑。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載劑”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的活性物質(zhì)相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低藥物組合物的效果。這些載劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPub.Co.，N.J.1991年)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載劑的充分討論。藥劑學(xué)上可接受的載劑包括，例如，一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質(zhì)的組合。藥學(xué)可接受的載劑可進(jìn)一步包括能提高抗體或其活性片段或其同源物的保存期限或效用的微量輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液。前面所述的藥物組合物可以制備成許多不同形式。這些包括，例如，固體、半固體和液體的劑型，例如片劑、丸劑、粉末、溶液、分散液、懸浮液、脂質(zhì)體、栓劑、注射用及輸液用溶液。本發(fā)明的藥物組合物可通過口服以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下等途徑給藥；優(yōu)選的是口服或靜脈內(nèi)注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分或免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常約0.1μg-5mg/kg體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約5mg/kg體重，較佳地該劑量是約1-10μg/kg體重-約1mg/kg體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍內(nèi)的。本發(fā)明的藥物組合物還可包含對(duì)自身免疫性疾病有治療或改善活性的物質(zhì)，或可與其它活性物質(zhì)聯(lián)合使用，以獲得更佳的治療效果。當(dāng)兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時(shí)，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨(dú)給藥的效果。優(yōu)選地，聯(lián)合施用的藥物或其它制劑不干擾本發(fā)明單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的治療活性。本發(fā)明還提供了一種人Tim-3的免疫檢測(cè)工具，所述免疫檢測(cè)工具包括抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的應(yīng)用中的免疫檢測(cè)工具為試劑盒、芯片或試紙。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人Tim-3表達(dá)水平的方法，所述方法包括以下步驟：(1)提取含有人Tim-3蛋白的樣品；(2)將步驟(1)獲取的樣品與前面所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分接觸；(3)檢測(cè)步驟(1)獲取的樣品中Tim-3蛋白與前面所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的反應(yīng)。檢測(cè)方法可以使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)、放射免疫檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)、免疫色譜法、競(jìng)爭(zhēng)法及類似檢測(cè)方法。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，檢測(cè)人Tim-3表達(dá)水平的方法的具體操作步驟如下：(1)4℃條件下，包被本發(fā)明的抗人Tim-3的單克隆抗體16h～18h；(2)加入生物樣品，37℃孵育1h；(3)加入兔抗人Tim-3多克隆抗體(購(gòu)自Abcam公司)，37℃孵育1h；(4)加入HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，經(jīng)37℃孵育0.5h之后，顯色，終止，檢測(cè)；(5)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷生物樣品中所含的人Tim-3的濃度。本發(fā)明還提供了前面所述的抗人Tim-3單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在免疫檢測(cè)工具中的應(yīng)用。所述免疫檢測(cè)工具用來(lái)檢測(cè)樣品中人Tim-3的表達(dá)水平。所述免疫檢測(cè)工具可以是芯片、試劑盒或試紙。本發(fā)明還提供了前面所述的抗人Tim-3單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在制備用于檢測(cè)人Tim-3表達(dá)水平的免疫偶聯(lián)物中的應(yīng)用。所述免疫偶聯(lián)物包括：(a)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分；和(b)選自下組的偶聯(lián)部分：藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、或酶。本發(fā)明還提供了前面所述的抗人Tim-3單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分在制備治療與Tim-3異常表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述疾病包括HIV感染導(dǎo)致的疾病、HCV感染導(dǎo)致的疾病、HBV感染導(dǎo)致的疾病、自身免疫性疾病、膿毒癥。所述藥物制劑包括本發(fā)明的抗人Tim-3單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分和/或藥物學(xué)上可接受的載劑。進(jìn)一步，上述藥物制劑包括前面所述的抗人Tim-3的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分和藥劑學(xué)上可接受的載劑。附圖說明圖1顯示本發(fā)明的單克隆抗體L3B檢測(cè)Tim-3蛋白的靈敏度；圖2顯示本發(fā)明的單克隆抗體L3B對(duì)Tim-3蛋白功能的影響。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下列實(shí)施例中未注明來(lái)源的實(shí)驗(yàn)試劑，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1抗人Tim-3單克隆抗體L3B的制備1、材料福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑，顯色試劑TMB：Sigma公司產(chǎn)品；20％胎牛血清：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；無(wú)血清RPMI1640：Gibco公司產(chǎn)品；SP2/0細(xì)胞：ATCC引進(jìn)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所保存；BALB/c小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；重組人Tim-3(rhTim-3)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所制備。其余試劑均為市購(gòu)。2、方法使用標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)免疫方式和PEG融合方法獲得單克隆抗體，詳細(xì)方法參見：EdHarlow等人，AntibodiesALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988。簡(jiǎn)要過程如下：(1)小鼠免疫：選用4-6周齡的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將溶于PBS的重組人Tim-3抗原溶液與弗氏完全佐劑(CFA)等體積混合乳化，經(jīng)四肢肌肉多點(diǎn)注射，每只每次注射重組Tim-3抗原5μg(總體積50μL)。首次免疫后15d和29d，分別用同樣劑量的重組抗原溶液加弗氏不完全佐劑(IFA)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。融合前72h，尾靜脈加強(qiáng)注射5μg不加佐劑的抗原1次進(jìn)行加強(qiáng)免疫。(2)細(xì)胞融合：將經(jīng)過免疫的小鼠脾臟研磨得到脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按1/6于脾細(xì)胞的數(shù)量取培養(yǎng)的SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，混合后離心，經(jīng)50％聚乙二醇(PEG2000)作用1min，使脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。加入50mL含有20％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸融合細(xì)胞，將細(xì)胞懸液與等體積的飼養(yǎng)細(xì)胞混合后，分置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(200μL/孔)于5％CO2培養(yǎng)箱(ESPECBNA-311)37℃培養(yǎng)。3d后，用含有20％FBS的HT培養(yǎng)基(含有1.361mg黃嘌呤(hypoxanthn，H)、0.388mg胸腺嘧啶核苷(thymidine，T))，加入RPMI1640(GIBCO公司)培養(yǎng)基至100mL，45～50℃條件下溶解后，過濾除菌。半保留換液。(3)用間接ELISA篩選抗人Tim-3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞：用10μg/mL重組人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板，于4℃過夜并封閉。依次加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，以及1：500稀釋的50μLHRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。(4)雜交瘤細(xì)胞免疫球蛋白亞型的確定：用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，對(duì)所得雜交瘤細(xì)胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明上述雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清只能與羊抗鼠IgG2a抗體形成結(jié)合條帶，證明本實(shí)施例所得雜交瘤細(xì)胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG2a。通過上述步驟，篩選到人Tim-3單克隆抗體，命名為L(zhǎng)3B。(5)雜交瘤細(xì)胞克隆化：用間接ELISA法篩選陽(yáng)性的細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100％陽(yáng)性。雜交瘤細(xì)胞的克隆化用有限稀釋法：①在克隆化的當(dāng)天或前1天制備滋養(yǎng)細(xì)胞：脫頸處死昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮膚，無(wú)菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mL1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復(fù)沖洗后吸出腹腔洗液，用加20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1mL。②取少許待作克隆化的雜交瘤細(xì)胞移至另一無(wú)菌試管中，并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。③有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。④將培養(yǎng)板置于37℃的5％CO2孵箱中培養(yǎng)，5d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。(6)雜交瘤的培養(yǎng)：穩(wěn)定的雜交瘤單克隆抗體細(xì)胞株先在CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)96孔培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至24孔，再轉(zhuǎn)移至50mL細(xì)胞瓶中擴(kuò)增培養(yǎng)。取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射0.5mL/只液狀石蠟，1-2周后，每只小鼠腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7-10d后收集腹水。3000rpm離心15min，吸取中間澄清部分的液體，0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存。(7)單克隆抗體的純化：將腹水用0.02M、pH7.4的PBS(81mL0.2MNa2HPO4，19mL0.2MNaH2PO4，加生理鹽水至1L)對(duì)倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15min，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15min，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達(dá)到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12,000rpm離心15min，棄上清。將沉淀溶于適量的PBS中，裝入透析袋中，放入50-100倍含20mMNaCl，pH7.8的120mMTris-HCl緩沖液中4℃攪拌下脫鹽12h左右，期間更換3次以上透析液。取出后分裝-20℃保存。實(shí)施例2人Tim-3單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)基因的釣取1.材料(1)輕鏈可變區(qū)上下游引物輕鏈上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7，其序列分別見序列表SEQIDNO：11、SEQIDNO：12和SEQIDNO：13；輕鏈下游引物MuCK，其序列見序列表SEQIDNO：14，引物在PCR擴(kuò)增時(shí)的使用濃度均為10pmol/μL。(2)重鏈可變區(qū)上下游引物重鏈上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8，其序列見序列表SEQIDNO：15、SEQIDNO16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18；重鏈下游引物MuIgG2a見序列表中SEQIDNO：19，引物在PCR擴(kuò)增時(shí)的使用濃度為10pmol/μL。(3)DNA片段純化試劑盒：OMEGA生物科技公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶：NewEnglandBiolabs產(chǎn)品；載體PGEMTeasy：Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)菌JM109：購(gòu)自Promega公司。其余試劑來(lái)源同實(shí)施例1。2.方法(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)施例1制備的單克隆抗體L3B的細(xì)胞株5×(106～107)個(gè)，離心去除上清，將細(xì)胞均勻彈起。加1mLTRIzol(Invitrogen)反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解，振蕩5min后，加入0.2mL氯仿，振蕩15秒，室溫放置2～3min，2℃-8℃12000r/min，離心15min，取上清于另一新管中，加500μL異丙醇混勻后室溫放置10min，2℃～8℃12000r/min離心10min。75％乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20μL無(wú)RNA酶的去離子水溶解沉淀。(2)取含1μg總RNA的溶液，依次加入AMV5×緩沖液4μL，Oligo(dT)(500ng/μL)0.5μL，2.5mmol/LdNTP2μL，RNasin(50U/μL)0.5μL，補(bǔ)去離子水至20μL、反轉(zhuǎn)錄酶2-5U，42℃延伸1h。95℃變性5min，置冰浴中，所得產(chǎn)物為cDNA第一鏈。分別用特異性引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因。輕鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增體系：取上述所得產(chǎn)物，即反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，Taq酶10×buffer2μL，輕鏈上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7各1μL，下游引物MuCK3μL，2.5mmol/LdNTP4μL，加Taq酶1～2U，補(bǔ)去離子水至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為：94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，將所得擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記為擴(kuò)增產(chǎn)物1。重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增體系：取上述所得產(chǎn)物，即反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，Taq酶10×buffer2μL，重鏈上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8各1μL，下游引物MuIgG2a3μL，2.5mmol/LdNTP4μL，加Taq酶1～2U，補(bǔ)去離子水至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為：94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，將所得擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記為擴(kuò)增產(chǎn)物2。(3)用瓊脂糖凝膠電泳分別分離出擴(kuò)增產(chǎn)物1和擴(kuò)增產(chǎn)物2中欲回收的DNA片段，即目的DNA片段，在長(zhǎng)波紫外光下分別切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，一一標(biāo)記，加入三倍膠體積的化膠液，55℃水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒分別回收擴(kuò)增產(chǎn)物1中目的DNA片段和擴(kuò)增產(chǎn)物2中的目的片段中并將純化的DNA片段溶解在水溶液里，分別標(biāo)記，將回收的PCR產(chǎn)物在T4DNA連接酶緩沖液中按2：1的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接反應(yīng)的總體積為10μL，并一一對(duì)應(yīng)標(biāo)記。(4)取上述所得連接液10μL，加于200μL感受態(tài)細(xì)菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30min，42℃水浴熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)入冰浴2min，加800μLLB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入37℃恒溫?fù)u床，以150r/min的速度搖動(dòng)45min，4000r/min離心1min，棄去800μL上清，取沉淀涂布于含Amp(終濃度為100μg/mL)的固體LB平板，將平板倒置于37℃孵箱12-18h，并一一對(duì)應(yīng)標(biāo)記。(5)在所得上述平板中挑取單個(gè)克隆，接種于含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，并一一對(duì)應(yīng)標(biāo)記。37℃恒溫?fù)u床170r/min，震蕩培養(yǎng)過夜。分別取3mL菌液加入1.5mLEppendorf管中，10000r/min離心1min，棄上清。采用質(zhì)粒提取試劑盒，將沉淀菌體重懸于100μL溶液Ⅰ中，加新鮮配制的溶液Ⅱ200μL，輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150μL溶液Ⅲ，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時(shí)出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4℃，12000r/min離心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酚，劇烈震蕩后，12000r/min離心5min，將上層水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇混勻，于-20℃放置3h。4℃，12000r/min離心10min，棄上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40μL無(wú)菌雙蒸水溶解，進(jìn)行PCR鑒定及DNA測(cè)序分析。通過上述步驟構(gòu)建了含有人Tim-3的單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)基因的載體、重鏈可變區(qū)基因的載體。經(jīng)序列比對(duì)，獲得了編碼單克隆抗體L3B的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和編碼單克隆抗體L3B的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。所得編碼單克隆抗體L3B的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQIDNO：9所示核苷酸序列；所得編碼單克隆抗體L3B的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQIDNO：10所示核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別為SEQIDNO：7所示氨基酸序列、SEQIDNO：8所示氨基酸序列。實(shí)施例3單克隆抗體L3B的表達(dá)和純化1.材料ProteinASepharoseCL4B柱蛋白柱：北京本元正陽(yáng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pcDNA3.1質(zhì)粒：Invitrogen；其余試劑和材料的來(lái)源同實(shí)施例1。2.方法將實(shí)施例2獲得的單克隆抗體L3B輕鏈可變區(qū)基因，輕鏈恒定區(qū)基因裝入pcDNA3.1質(zhì)粒，得含單克隆抗體L3B輕鏈基因的載體；將實(shí)施例2獲得的單克隆抗體L3B重鏈可變區(qū)基因，重鏈恒定區(qū)基因裝入pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得含單克隆抗體L3B重鏈基因的載體。含有單克隆抗體L3B輕鏈基因的載體、重鏈基因的載體共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，進(jìn)行表達(dá)。收集表達(dá)上清，加入1mLpH8.0、0.1mol/L磷酸緩沖液并用1mol/LTRIS-HCL調(diào)整pH至9.0。把小鼠腹水加入已經(jīng)用pH8.0、0.1mol/L磷酸緩沖液平衡好的ProteinASepharoseCL4B蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中檢測(cè)不到雜蛋白為止。用pH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用1mol/LpH8.5TRIS-HCL緩沖液中和，用pH7.2，0.01mol/L的PBS透析72h。取樣在紫外分光光度計(jì)上測(cè)OD260、OD280，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，凍干后于-20℃保存。實(shí)施例4單克隆抗體L3B與人Tim-3結(jié)合特異性的檢測(cè)1.材料膿毒癥患者血清為收集于解放軍總醫(yī)院膿毒癥病人的血液經(jīng)處理獲得；正常人血清為收集于正常人的血液經(jīng)處理獲得；ELISA包被液、PBST、TMB、H2SO4、TNF-α、硫氧環(huán)蛋白均為市售，其余試劑和材料的來(lái)源同實(shí)施例1。2.方法和結(jié)果采用間接ELISA方法考察實(shí)施例3制得的單克隆抗體L3B的特異性。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組1、對(duì)照組2、對(duì)照組3、實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組。其中對(duì)照組1包被無(wú)關(guān)抗原TNF-α1μg/mL，對(duì)照組2包被無(wú)關(guān)抗原硫氧環(huán)蛋白(TRX)1μg/mL；對(duì)照組3包被BSA1μg/mL；實(shí)驗(yàn)組包被膿毒癥病人血清；陽(yáng)性對(duì)照組包被人Tim-3抗原(即重組人Tim-3)1μg/mL；陰性對(duì)照組包被正常人血清。每組樣品用包被液稀釋，每個(gè)樣品包被2孔于ELISA板中，每孔100μL，4℃過夜。PBST洗5遍，封閉，200μL封閉液，37℃，封閉2h，PBST洗5遍。按10μg/mL的終濃度加入單克隆抗體L3B50μL，37℃反應(yīng)1h，PBST洗5遍。加入300×稀釋anti-mouse抗體(KPL公司)，37℃反應(yīng)45min。PBST洗7遍，加入50μL/孔的TMB，室溫避光孵育10min后，加入50μL/孔的1mol/L的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處OD值，計(jì)算每組兩孔數(shù)值的平均值。單克隆抗體L3B特異性檢測(cè)結(jié)果見表1。表1單克隆抗體L3B特異性檢測(cè)結(jié)果根據(jù)表1中數(shù)據(jù)可知，陰性對(duì)照組、對(duì)照組1、對(duì)照組2和對(duì)照組3(三個(gè)無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照)的四個(gè)組別的OD450值差異不顯著，說明實(shí)施例3制得的單克隆抗體L3B不與無(wú)關(guān)蛋白相結(jié)合；與陰性對(duì)照組相比較，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組OD450值差異及其顯著，呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的OD450值相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)組中含有人Tim-3抗原，說明實(shí)施例3制得的單克隆抗體L3B能夠特異性與人Tim-3相結(jié)合，而不與其他蛋白結(jié)合，可以用于制備檢測(cè)人Tim-3的免疫檢測(cè)工具。實(shí)施例5抗人Tim-3的單克隆抗體L3B的靈敏度檢測(cè)1、操作步驟：步驟1：包被單克隆抗體L3B到高親和力ELISA板中，4℃過夜后用含0.2％吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；步驟2：取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品重組人Tim-3蛋白，配置成不同的濃度(濃度分別為0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL和10000ng/mL)，加入到步驟1所得的包被有L3B的ELISA板條中，37℃孵育1h，用含0.2％吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；步驟3：加入兔抗人Tim-3的多克隆抗體，37℃孵育1h，用含0.2％吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；步驟4：加入HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，37℃孵育0.5h之后，用含0.2％吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；加入TMB顯色，1mol/L的硫酸終止后檢測(cè)OD450的值。步驟5：以O(shè)D450值和蛋白濃度做圖，判斷生物樣品中所含的人Tim-3的水平。2、結(jié)果檢測(cè)結(jié)果見圖1，對(duì)其進(jìn)行分析可知，實(shí)驗(yàn)組中隨著蛋白濃度的增加，OD450值逐漸增大，其檢出限為0.1ng/mL到1000ng/mL，與已報(bào)道的人Tim-3的最低檢出限1ng/mL相比，顯著提高了人Tim-3檢測(cè)試劑盒的檢出限和靈敏度。實(shí)施例6單克隆抗體L3B中和活性的檢測(cè)1、應(yīng)用免疫磁珠法建立人外周血CD4+T細(xì)胞增殖模型1.1獲得血液標(biāo)本采集健康人肘靜脈血50mL，加入肝素(10U/mL)抗凝。1.2用淋巴細(xì)胞分離液從血標(biāo)本中分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)(1)用肝素抗凝的50mL靜脈血與50mLRPMI-1640溶液充分混勻稀釋；(2)取8個(gè)50mL規(guī)格的塑料離心管，在各管中加入25mL淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自鼎國(guó)生物科技有限公司)；(3)將上述稀釋的血液用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面；水平離心(2000r/m×20min)；(4)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和RPMI-1640溶液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞；中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。此外，還含有少量血小板；(5)毛細(xì)滴管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，并集中移至1支離心管中；加入10mlRPMI-1640溶液，水平離心(1500r/m×10min)后去上清液，再加入10mlRPMI-1640溶液，水平離心(1500r/m×10min)；(6)末次離心后棄上清液，加入5mL10％FCSRPMI-1640重懸細(xì)胞，鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.5×107個(gè)，調(diào)整濃度為0.5×107個(gè)/mL，平均分裝于5支小試管，在4℃保存待下步使用。1.3用Dynal人CD4+T細(xì)胞陽(yáng)性分選試劑盒(挪威dynal公司)分選CD4+T細(xì)胞按照試劑盒操作說明書進(jìn)行CD4+T細(xì)胞分選。1.4顯微鏡下觀察細(xì)胞(1)形態(tài)：細(xì)胞形態(tài)均一，邊緣清晰，細(xì)胞體明亮無(wú)異常，無(wú)細(xì)菌等生物生長(zhǎng)；(2)活度，0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液染色，3min內(nèi)用血球記數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞，依據(jù)公式：活細(xì)胞率(％)＝活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100％，得出分選的CD4+細(xì)胞活度為97％。2、CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)及定向分化將上述分離的CD4+T淋巴細(xì)胞以5×105的密度置于96孔板中，充分混勻，同時(shí)加入anti-CD3(終濃度為2.5μg/mL)、anti-CD28(終濃度為5μg/mL)、IL-2(終濃度為100ng/mL)(三種試劑購(gòu)自美國(guó)eBio-science)刺激細(xì)胞增殖，另外加入終濃度為10ng/mL的白細(xì)胞介素-12(IL-12)和終濃度為10μg/mL的anti-IL-4(兩種試劑購(gòu)自美國(guó)eBio-science)誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化成Th1細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)5d。3、CD4+T定向分化細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)分別將培養(yǎng)5d后的所有定向分化細(xì)胞分為三組，進(jìn)行下列干預(yù)實(shí)驗(yàn)：(1)空白對(duì)照組：細(xì)胞培養(yǎng)液總不加入任何藥物；(2)人重組半乳素凝集素-9(rGal-9)(購(gòu)自艾美捷科技有限公司)：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為7.5μg/mL的rGal-9；(3)rGal-9+Tim-3單克隆抗體組：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為7.5μg/mL的rGal-9和終濃度為2μg/mL的Tim-3的單克隆抗體；繼續(xù)培養(yǎng)6h后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(LifeTechnologies)中說明書記載的操作步驟進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，每組細(xì)胞三個(gè)平行樣。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三批，計(jì)算平均值。5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為基準(zhǔn)(即對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100％)，計(jì)算其余各組的相對(duì)存活率。所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，*代表P<0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。6、結(jié)果結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，加入rGal-9的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率降低，在此基礎(chǔ)上加入Tim-3的單克隆抗體L3B細(xì)胞存活率回升。上述結(jié)果表明，rGal-9與CD4+T分化細(xì)胞表面表達(dá)的Tim-3蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Tim-3的單克隆抗體通過干擾rGal-9與Tim-3蛋白的相互作用，抑制了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，由此證明本發(fā)明制備的Tim-3的單克隆抗體L3B不僅具有與Tim-3蛋白結(jié)合的結(jié)合活性，而且具有中和Tim-3蛋白活性的中和活性。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。