本發(fā)明屬于糞腸球菌培養(yǎng)技術領域，涉及一種飼用糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
背景技術：
糞腸球菌，是革蘭氏陽性，人和動物腸道內主要菌群之一，其能產生天然抗生素，有利于機體健康；同時還能產生細菌素等抑菌物質，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環(huán)境；還能抑制腸道內產尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內毒素的含量，使血液中氨和內毒素的含量下降。另外，腸球菌為消化道內正常存在的一類微生物，在腸黏膜具有較強的耐受和定植能力，并且是一種兼性厭氧的乳酸菌，與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比，更適合于生產和應用。
傳統(tǒng)的靜置發(fā)酵法得到的發(fā)酵液中菌體的發(fā)酵密度較低，糞腸球菌活菌數(shù)在5-10億左右，為了得到更多的活菌數(shù)，就需要增加生物反應器的體積或增加發(fā)酵次數(shù)等，從而增加生物量的分離費用，延長生產周期，從而提高生產成本、降低生產效率。
糞腸球菌目前仍難以實現(xiàn)高密度發(fā)酵，難以實現(xiàn)的主要問題是發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，發(fā)酵后期營養(yǎng)物質不足和代謝產物(主要是乳酸)積累抑制菌體生長，導致高密度發(fā)酵難以實現(xiàn)。
技術實現(xiàn)要素：
(一)要解決的技術問題
本發(fā)明的目的是提供一種飼用糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一目的是提供該高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。
(二)技術方案
本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明提供一種飼用糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，所述的糞腸球菌為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分及其含量如下：蔗糖20～30g/L，蛋白胨10～15g/L、酵母粉10～25g/L，K2HPO4 2～3g/L，檸檬酸鈉2～4g/L，Mg2+水溶性化合物0.2～0.4g/L，F(xiàn)e2+水溶性化合物0.1～0.2g/L和Mn2+水溶性化合物20～80mg/L。
其中，所述的Mg2+水溶性化合物為MgSO4，MgCl2中的任一種；所述的Fe2+水溶性化合物為FeSO4，F(xiàn)eCl2，中的任一種；所述的Mn2+水溶性化合物為MnSO4。
本發(fā)明的飼用糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法如下：
(1)按含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中蔗糖單獨溶解；
(2)蔗糖115℃單獨滅菌30分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將蔗糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
本發(fā)明還提供了該飼用糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，主要步驟如下：(1)將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后，以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～10小時
后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0～6.5，當pH超過設定值時，補加50％蔗糖液：當pH低于設定值時，自動流加氨水、KOH或NaOH中的任一種；在溫度37～39℃、轉速50rpm條件下發(fā)酵8～12小時，發(fā)酵過程不通氣或通入N2，維持溶氧小于1％；
(5)當補加50％蔗糖液pH不再降低或發(fā)酵液在600nm波長下的吸光值(即OD600)不再增加時，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達1010cfu/mL以上的發(fā)酵液。
本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法適用于其它腸球菌。本發(fā)明所用糞腸球菌保藏于中國工業(yè)微生物保藏中心，編號為CICC 23215。
(三)有益效果
本發(fā)明采用pH反饋控制補加蔗糖策略，同時降低發(fā)酵液中乳酸的濃度，從而解除乳酸的反饋抑制作用，使用本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法發(fā)酵的糞腸球菌，菌體密度較普通發(fā)酵顯著提高，活菌數(shù)不低于1010cfu/ml，這是現(xiàn)有的技術難以達到的發(fā)酵標準，較普通MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)活菌數(shù)5.1×108cfu/ml，提高40倍，實現(xiàn)了糞腸球菌的高密度發(fā)酵；可以減小生物量的分離費用，縮短生產周期，從而降低生產成本、提高生產效率。
具體實施方式
通過下列實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
蔗糖20g/L，蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，K2HPO4 2g/L，檸檬酸鈉2g/L，MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：55mg/L。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中蔗糖單獨溶解；
(2)蔗糖115℃單獨滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將蔗糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后，以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0，當pH超過6.0時，補加50％蔗糖
液；當pH低于6.0時，自動流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉速50rpm條件下
發(fā)酵10小時，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當補加50％蔗糖液pH不再降低時，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達1.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對照實驗
(1)糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后。以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)10小時，終止發(fā)酵，
得到糞腸球菌活菌數(shù)為4.1×108cfu/ml
3.3結果分析
應用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到糞腸球菌活菌數(shù)達1.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的糞腸球菌活菌數(shù)僅為4.1×108cfu/ml。實驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的糞腸球菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術的近30倍，實現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
實施例2 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
蔗糖20g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L，K2HPO4 3g/L，檸檬酸鈉4g/L， MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：80mg/L。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中蔗糖單獨溶解；
(2)蔗糖115℃單獨滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將蔗糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后，以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0，當pH超過6.0時，補加50％蔗糖
液；當pH低于6.0時，自動流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉速50rpm條件下
發(fā)酵10小時，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當補加50％蔗糖液pH不再降低時，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達1.8×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對照實驗
(1)糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后。以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)10小時， 終止發(fā)酵，
得到糞腸球菌活菌數(shù)為5.1×108cfu/ml
3.3結果分析
應用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到糞腸球菌活菌數(shù)達1.8×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的糞腸球菌活菌數(shù)僅為5.1×108cfu/ml。實驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的糞腸球菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術的35倍，實現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
實施例3 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、糞腸球菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
蔗糖30g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉25g/L，K2HPO42g/L，檸檬酸鈉4g/L，MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：60mg/L。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中蔗糖單獨溶解；
(2)蔗糖115℃單獨滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將蔗糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后，以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.5，當pH超過6.0時，補加50％蔗糖
液；當pH低于6.5時，自動流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉速50rpm條件下
發(fā)酵10小時，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當補加50％蔗糖液pH不再降低時，終止發(fā)酵，即得糞腸球菌活菌數(shù)達2.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對照實驗
(1)糞腸球菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
蔗糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的糞腸球菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時后。以1％接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)10小時，終止發(fā)酵，
得到糞腸球菌活菌數(shù)為5.5×108cfu/ml
3.3結果分析
應用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到糞腸球菌活菌數(shù)達2.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的糞腸球菌活菌數(shù)僅為5.5×108cfu/ml。實驗證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的糞腸球菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術的40倍，實現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
生產中，高密度發(fā)酵的實現(xiàn)可以減小生物量的分離費用，縮短生產周期，降低生產成本、提高生產效率等，這在高效節(jié)能的當代社會具有極其重要的意義。