本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術領域，具體涉及抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的化合物及其在減少酸性重金屬礦坑水產生方面的應用。

背景技術：

酸性礦坑水(acid mine drainage，AMD)主要是由于金屬硫化礦在空氣、水和微生物等的作用下，發(fā)生溶浸、氧化、水解等一系列物理化學反應而形成。目前，酸性礦坑水的污染已經(jīng)成為全世界最為嚴重的環(huán)境問題之一，酸性礦坑水具有極低的pH(pH≤2.0)和高濃度的重金屬離子，因此會對礦區(qū)周圍的生態(tài)環(huán)境造成嚴重的污染。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，A.ferrooxidans)是酸性礦坑水環(huán)境中最為常見的浸礦細菌之一。當A.ferrooxidans以生物膜的形式存在于金屬硫化礦表面時，可以極大的促進金屬硫化礦的分解和金屬離子的溶出，導致大量含有高濃度重金屬離子的酸性礦坑水產生，因此A.ferrooxidans形成的生物膜在酸性礦坑水產生的過程中起著非常重要的作用?？刂扑嵝缘V坑水的方法大致可分為物理方法、化學方法以及生物方法三大類。其中最常用的是化學方法，即通過投放抑菌劑或殺菌劑抑制浸礦細菌的活性，從而防治酸性礦坑水的污染，但是，這種方法并不能作為一種長期的控制方法。原因在于：細菌的再生使人們必須不斷的加入這些殺菌劑或者抑菌劑，這樣不僅會導致嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌耐藥性的產生，還會對礦區(qū)水體生物產生毒性，造成二次污染。

本發(fā)明公開了一類能夠抑制嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的化合物，該類化合物在不影響嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌正常生長的情況下，可以抑制該菌生物膜的形成，從而降低了嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌對硫化礦的侵蝕速度，顯著降低了硫化礦區(qū)酸性重金屬礦坑水的產生。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術中存在的缺點，提供一系列?；呓z氨酸內酯的類似物，該類化合物可以作為氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的抑制劑。

本發(fā)明的另一個目的是提供?；呓z氨酸內酯的類似物在抑制硫化礦區(qū)酸性重金屬礦坑水產生中的應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種?；呓z氨酸內酯類化合物，其化學結構通式為：

其中n＝0，或1，或2，或3，或4，或5；X＝F，或Cl，或Br，或NO₂，或CF₃，或CH₃，或CH₃O。

其中優(yōu)選n＝0，或1，或2；X＝Br，或NO₂，X為苯環(huán)對位上的取代基。

進一步地，本發(fā)明中用于抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜的?；呓z氨酸內酯類似物是下述化合物中的一種：

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-溴苯丁酰胺(No.1)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-溴苯乙酰胺(No.2)

N-(3-環(huán)丁內酯)-2-溴苯乙酰胺(No.3)

N-(3-環(huán)丁內酯)-3-溴苯乙酰胺(No.4)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-氯苯乙酰胺(No.5)

N-(3-環(huán)丁內酯)-3-氟苯乙酰胺(No.6)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-氟苯乙酰胺(No.7)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-硝基苯乙酰胺(No.8)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-三氟甲基苯乙酰胺(No.9)

N-(3-環(huán)丁內酯)-4-溴苯丙酰胺(No.10)

本發(fā)明公開的?；呓z氨酸內酯類化合物可用于抑制嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成，所述?；呓z氨酸內酯類化合物的使用量為1-1000μM，優(yōu)選10-100μM。

本發(fā)明公開的?；呓z氨酸內酯類化合物可用于抑制酸性重金屬礦坑水的產生，所述酸性重金屬礦坑水來源于金屬硫化礦礦區(qū)，所述的化合物的使用濃度優(yōu)選100μM。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明合成的化合物對氧化亞鐵硫桿菌生物膜的形成具有較高的抑制活性，并且對于酸性重金屬礦坑水的產生同樣具有良好的抑制效果。此外，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明是通過抑制氧化亞鐵硫桿菌生物膜的形成，減少細菌和礦石之間的相互作用，從而達到抑制酸性重金屬礦坑水產生的目的。該類化合物與傳統(tǒng)的殺菌劑或抑菌劑相比，制備過程簡單，抑制作用長效，無二次污染，不會產生由殺菌劑或抑菌劑引起的耐藥性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的化合物對氧化亞鐵硫桿菌Fe²⁺氧化百分率的影響，其中，細菌處理組；細菌+10μM化合物處理組；細菌+100μM化合物處理組。

圖2為本發(fā)明的化合物對氧化亞鐵硫桿菌生物膜形成的影響，其中，細菌處理組；細菌+10μM化合物處理組；細菌+100μM化合物處理組。

圖3為本發(fā)明的化合物對浸礦體系中鎳離子濃度的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(△)細菌+100μM No.1化合物處理組；(▼)細菌+100μM No.2化合物處理組；(◆)細菌+100μM No.8化合物處理組。

圖4為本發(fā)明的化合物對浸礦體系中銅離子濃度的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(△)細菌+100μM No.1化合物處理組；(▼)細菌+100μM No.2化合物處理組；(◆)細菌+100μM No.8化合物處理組。

圖5為本發(fā)明的化合物對浸礦體系中pH變化的影響，其中，(□)無菌處理組；(■)細菌處理組；(△)細菌+100μM No.1化合物處理組；(▼)細菌+100μM No.2化合物處理組； (◆)細菌+100μM No.8化合物處理組。

具體實施方式

以下提供具體實施例以實現(xiàn)本發(fā)明所述的技術方案，但不限于這些實施例。

實施例1氧化亞鐵硫桿菌生物膜抑制劑的合成

式中，

No.1：R₁＝Br，R₂＝H，R₃＝H，n＝2；

No.2：R₁＝Br，R₂＝H，R₃＝H，n＝0；

No.3：R₁＝H，R₂＝H，R₃＝Br，n＝0；

No.4：R₁＝H，R₂＝Br，R₃＝H，n＝0；

No.5：R₁＝Cl，R₂＝H，R₃＝H，n＝0；

No.6：R₁＝H，R₂＝F，R₃＝H，n＝0；

No.7：R₁＝F，R₂＝H，R₃＝H，n＝0；

No.8：R₁＝NO₂，R₂＝H，R₃＝H，n＝0；

No.9：R₁＝CF₃，R₂＝H，R₃＝H，n＝0；

No.10：R₁＝Br，R₂＝H，R₃＝H，n＝1；

其中No.1、No.2、No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8、No.9、No.10分別為一種?；呓z氨酸內酯類化合物類似物。

具體合成步驟為：

(1)在冰水浴條件下，將169mg(0.93mM)的(R)-(+)-α-氨基-γ-丁內酯鹽酸鹽和相應的0.93mM的有機酸置于10mL干燥的CH₂Cl₂溶液中混合均勻，之后加入267mg(1.5mM)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和68mg(0.6mM)的4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，攪拌30min之后撤去冰浴，在室溫條件下繼續(xù)攪拌反應20h；

(2)反應后的溶液經(jīng)CH₂Cl₂稀釋至終體積100mL，在分液漏斗中用等體積的10％(v/v)的HCl溶液和飽和NaCl溶液分別洗滌上述溶液3遍。之后收集有機相溶液，加入無水MgSO₄除去有機相中殘留的水分，經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀50℃干燥后得到粗產物。粗產物經(jīng)SiO₂柱層析，TLC監(jiān)測，乙酸乙酯：石油醚＝1.5:1洗脫，洗脫液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀50℃旋蒸、油泵減壓抽濾之后得到目的產物No.1-No.10。

實施例2化合物對氧化亞鐵硫桿菌正常生長的影響

實驗材料：A.ferrooxidans ATCC23270購自American Type Culture Collection(ATCC)。

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌在正常生長的過程中將Fe²⁺氧化為Fe³⁺獲取能量進行生長。通過重鉻酸鉀滴定法檢測溶液中Fe³⁺的含量，反映化合物對細菌Fe²⁺氧化能力的影響，從而保證用藥濃度不會影響細菌的正常生長。實驗方法如下：

(1)在250mL三角瓶中加入100mL pH 1.8的9K培養(yǎng)基(9K培養(yǎng)基配制方法：將3.0g(NH₄)SO₄，0.1g KCl，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.01g Ca(NO₃)₂，44.67g FeSO₄·7H₂O溶于1000mL蒸餾水中，并用稀硫酸調整pH至2.0，并過濾除菌)，然后將實驗分為三組，第一組以不加化合物作為空白對照組；第二組加入已經(jīng)過濾除菌的終濃度為10μM的化合物；第三組加入終濃度為100μM的化合物。

(2)每個實驗組做三個平行，然后按照10％(v/v)的接種量接種連續(xù)培養(yǎng)20h的A.ferrooxidans ATCC23270，最后將三角瓶放入恒溫搖床中，150r/min，30℃振蕩培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)24h之后，用重鉻酸鉀滴定法測定培養(yǎng)基中Fe²⁺含量。吸取1mL培養(yǎng)液，用5mL蒸餾水稀釋，同時加入3mL混酸溶液(體積比為H₃PO₄：H₂SO₄：H₂O＝15：15：70)來消除Fe³⁺對指示劑顯色的影響，再加入50μL二苯胺磺酸鈉指示劑，用0.01M的K₂Cr₂O₇滴定樣品，樣品溶液從無色變?yōu)樽仙礊榈味ńK點，記錄到達滴定終點消耗K₂Cr₂O₇標準液的體積；

(3)最終通過計算溶液中剩余Fe²⁺的含量，計算Fe²⁺氧化百分率，并用SPSS 13.0軟件 進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義，結果如圖1所示。

從圖1中可以看出，連續(xù)培養(yǎng)24h之后，與空白不加藥處理組相比，10個化合物處理組中，10μM和100μM濃度的化合物均未對細菌Fe²⁺氧化百分率產生影響，差異不具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，所以兩個用藥濃度均不會影響細菌的生長。

實施例3生物膜抑制劑抑制活性檢測

(1)9000r/min，10℃離心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌體，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗滌菌體兩遍，最后重懸于含2g/L Fe²⁺，pH 2.0的基礎鹽溶液(不含F(xiàn)eSO₄的9K培養(yǎng)基)中，并且將細菌懸液的細菌密度調至1.0×10⁸cells/mL；

(2)將上述細菌懸液分為三組，第一組以不加化合物作為空白對照組；第二組加入已經(jīng)過濾除菌的終濃度為10μM的化合物；第三組加入終濃度為100μM的化合物。將細菌懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，150μL/孔，每個實驗組做8個平行。然后將96孔細胞培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱中，30℃靜置培養(yǎng)48h，形成生物膜；

(3)48h之后，倒掉孔內菌液，每孔用無菌去離子水洗滌兩遍，洗去游離的細菌。每孔加入0.5％的結晶紫溶液150μL，室溫條件下染色15min。之后洗去殘留的結晶紫染料，每孔中加入150μL的33％的冰乙酸溶液，溶解生物膜-結晶紫混合物，用多功能酶標儀讀取570nm吸光度值；

(4)實驗數(shù)據(jù)用mean±SD表示，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義，如圖2所示。從圖2中可以看出，與空白不加藥處理組相比，在100μM處理濃度時，No.1-No.10化合物均對A.ferrooxidans ATCC23270菌體生物膜的形成具有抑制效果，該差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

實施例4化合物對酸性重金屬礦坑水產生的抑制作用

隨機選取對A.ferrooxidans ATCC23270生物膜形成抑制作用的No.1、No.2、No.8進行酸 性重金屬礦坑水產生的抑制作用的評估實驗。

(1)9000r/min，10℃離心15min收集得到A.ferrooxidans ATCC23270菌體，用pH 2.0的稀硫酸溶液洗滌菌體沉淀兩遍，最后重懸于pH 2.0的基礎鹽溶液中，并且將A.ferrooxidans ATCC23270菌懸液的菌體密度調至1.0×10⁸cells/mL。在250mL三角瓶中加入100mL菌懸液中，并且按照5％(w/v)的礦漿濃度，加入粒徑為50-100μm的鎳黃鐵礦顆粒粉末5g；

(2)鎳黃鐵礦的金屬溶出實驗分為5個實驗組，分別為：純細菌處理組、100μL的No.1+細菌處理組、100μL的No.2+細菌處理組、100μL的No.8+細菌處理組以及無菌處理組，每組實驗組做三個平行。所有樣品于搖床150r/min，30℃培養(yǎng)，溶出過程持續(xù)44天，每2天用pH計測定樣品中的pH。此外，每隔一段時間取礦石浸出液1mL，1000r/min低速離心5min后去除礦石殘渣，上清用pH 2.0的稀硫酸稀釋后，用原子吸收發(fā)射光譜測定樣品中Ni²⁺，Cu²⁺含量，結果如圖3、圖4、圖5所示。

(3)從圖3和4中可以看出，在沒有細菌存在的情況下，礦石中Ni和Cu的溶出過程十分緩慢，而在有細菌存在的情況下，溶液中可溶性Ni和Cu的含量要遠遠大于無菌對照組。而用100μM的No.1、No.2、No.8這三個化合物處理之后，溶液中可溶性Ni和Cu的含量雖然略高于無菌處理組，但是卻遠遠低于純細菌處理組。此外，如圖5所示，加藥處理之后浸礦體系的pH較純細菌培養(yǎng)組有所升高，說明浸礦體系中的產酸量有所減少，而且這種抑制作用可以持續(xù)60天以上。因此，No.1、No.2、No.8三個化合物可以抑制細菌對礦石中金屬的溶出作用，并且可以減少酸的產生，所以對AMD的產生具有一定的抑制效果。