一種D-乳酸氧化酶及其在D-乳酸檢測中的應用技術領域本發(fā)明涉及一種乳酸氧化酶及其應用，尤其涉及一種新型D-乳酸氧化酶及其在D-乳酸檢測中的應用。

背景技術：
乳酸廣泛存在于自然界中，如酸奶、糖蜜、葡萄酒、蘋果以及動植物體內。乳酸有L-乳酸和D-乳酸兩種光學異構體。D-乳酸在人體血液中的異常積累會導致D-乳酸血癥，D-乳酸血癥必須通過快速測定急性癥狀發(fā)生時的D-乳酸水平進行確診。另外，D-乳酸是也一種重要的平臺化合物，廣泛應用于醫(yī)藥、化工、生物合成等領域，因此在工業(yè)生產中也經常涉及到D-乳酸的檢測。然而，目前快速測定乳酸濃度的乳酸生物傳感器僅能夠檢測L-乳酸，因此迫切需要一種特異性快速檢測D-乳酸的方法，如D-乳酸生物傳感器。目前被廣泛使用的L-乳酸生物傳感器通常是基于過氧化氫的安培檢測法，即將L-乳酸氧化酶固定在過氧化氫電極上進行L-乳酸檢測，直接檢測的信號是過氧化氫，過氧化氫是由固定在電極表面的L-乳酸氧化酶催化L-乳酸直接被氧氣氧化而生成的。但由于到目前為止尚無能夠以分子氧為電子受體催化D-乳酸氧化的D-乳酸氧化酶的報道，一定程度上阻礙了D-乳酸生物傳感器的開發(fā)，因而目前D-乳酸的檢測通常使用D-乳酸檢測試劑盒或液相色譜分析，但與利用L-乳酸生物傳感器檢測L-乳酸相比，這兩種D-乳酸檢測方法仍存在檢測費用較高、檢測過程復雜、耗時相對較長等不足。目前已有文獻報道了幾種基于D-乳酸脫氫酶的D-乳酸生物傳感器，例如Montagné等利用NAD-依賴型的D-乳酸脫氫酶結合NADH氧化酶和NAD+的方法制備的D-乳酸生物傳感器(Montagnéetal.,1995,Anal.Chim.Acta.,315:297-302)，Pohanka等利用來源于酵母的細胞色素c依賴型的D-乳酸脫氫酶結合添加人工電子受體吩嗪硫酸甲酯(PMS)的方法制備的D-乳酸生物傳感器(Pohankaetal.,2008,FoodTechnol.Biotechnol.46:107–110)，山東省科學院生物研究所利用從美國sigma公司購買的來源于菠菜的乙醇酸脫氫酶(EC1.1.1.26)制備的D-乳酸生物傳感器(專利公開號：CN101349668A)。但檢索發(fā)現目前尚無利用以分子氧為直接電子受體催化D-乳酸氧化的D-乳酸氧化酶及利用其制備的D-乳酸生物傳感器的報道。

技術實現要素：
針對上述現有技術中D-乳酸檢測手段的不足，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶能夠以分子氧為直接電子受體氧化D-乳酸生成丙酮酸和過氧化氫；以及該酶在D-乳酸檢測中的應用。本發(fā)明所述的新型D-乳酸氧化酶，其特征在于，所述D-乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；該酶為可溶性蛋白，輔因子為FAD，其最適溫度為55℃，最適pH為8.0，在pH7.0～9.0范圍內具有60％以上的酶活；該酶能夠以分子氧為直接電子受體催化D-乳酸氧化生成丙酮酸和過氧化氫，當D-乳酸濃度在0.1～1.3mmol/L范圍內時，該酶催化生成的過氧化氫濃度與初始D-乳酸濃度呈線性相關；該酶對D-乳酸的表觀Km和Vmax分別為3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，該酶對另一底物O2的表觀Km和Vmax分別為0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。編碼上述D-乳酸氧化酶的基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，該基因來源于氧化葡萄糖酸桿菌621H，NCBI數據庫中該基因的基因座標簽(Locus_tag)為GOX2071。進一步的，上述的D-乳酸氧化酶基因還包括能夠編碼具有與來源于氧化葡萄糖酸桿菌621H的D-乳酸氧化酶相同功能蛋白的SEQIDNO.1序列的變異形式。這些變異形式包括：若干個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’末端添加若干個核苷酸。上述D-乳酸氧化酶以如下方法制得：(1)將來源于氧化葡萄糖酸桿菌621H的D-乳酸氧化酶基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)克隆到大腸桿菌表達載體pET25b中，轉化表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)，氨芐青霉素抗性篩選獲得含有D-乳酸氧化酶基因重組質粒的重組菌株；(2)將上述重組菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，當OD600nm達到0.4～0.8后加入終濃度1mmol/L的IPTG誘導表達，誘導表達時間為6小時，誘導表達溫度為37℃；(3)利用Souce30Q陰離子交換柱進行D-乳酸氧化酶的初步純化，利用洗脫緩沖液梯度洗脫，收集含有D-乳酸氧化酶的洗脫液；(4)將上述含有D-乳酸氧化酶的洗脫液，進一步利用HisTrapNi親和層析柱純化，獲得D-乳酸氧化酶電泳純的純酶。本發(fā)明所述的D-乳酸氧化酶在制備通過測定過氧化氫濃度來檢測D-乳酸的生物傳感器中的應用。本發(fā)明所述的新型D-乳酸氧化酶與廣泛報道的L-乳酸氧化酶的催化特性相似，但催化的底物構型完全相反。本發(fā)明所述的D-乳酸氧化酶能夠以分子氧為直接電子受體氧化D-乳酸生成丙酮酸和過氧化氫，生成的過氧化氫可用作D-乳酸生物傳感器過氧化氫電極的直接檢測信號；該酶為可溶性蛋白，純化和保存過程無需添加表面活性劑，因此更易于固定于生物傳感器的電極表面；最適pH8.0，在pH7.0～9.0范圍內仍具有60％以上的酶活，且在pH7.0～9.0范圍內穩(wěn)定性非常好，這一可應用的pH寬度也涵蓋了正常人體血液中的pH范圍(7.35～7.45)；該酶最適溫度為55℃，在50℃以下穩(wěn)定性較好，具有較好的應用潛力。使用Clark-型液相氧電極(Oxytherm,Hansatech，英國)測定本發(fā)明所述的D-乳酸氧化酶的表觀動力學參數，結果如下，該酶對D-乳酸的表觀Km和Vmax分別為3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，該酶對另一底物O2的表觀Km和Vmax分別為0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。在一定濃度本發(fā)明所述的D-乳酸氧化酶(0.35U/mL)催化下，D-乳酸濃度在一定范圍內(如0.1～1.3mmol/L)時，初始反應液中的D-乳酸濃度與生成的過氧化氫濃度呈線性相關，因此非常有望通過將該酶固定到能夠直接檢測過氧化氫濃度的過氧化氫電極表面，以制備新型的D-乳酸生物傳感器，從而實現D-乳酸的廉價、簡便、快速的定量檢測。綜上，本發(fā)明具有的突出特點是：(1)本發(fā)明首次提供了一種能夠以分子氧為直接電子受體氧化D-乳酸的D-乳酸氧化酶，該酶氧化D-乳酸生成的過氧化氫可用作D-乳酸生物傳感器過氧化氫電極的直接檢測信號。(2)本發(fā)明所提供的D-乳酸氧化酶為可溶性蛋白，易于固定到生物傳感器的電極表面。(3)本發(fā)明所提供的D-乳酸氧化酶具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性、具有良好的線性檢測范圍。(4)本發(fā)明為制備具有廣泛應用前景的D-乳酸生物傳感器提供了新的有效酶源，在制備D-乳酸生物傳感器及D-乳酸的檢測領域具有應用價值。附圖說明圖1為重組D-乳酸氧化酶的SDS-PAGE圖譜。其中，泳道M為標準分子量蛋白，泳道1為包含空質粒pET25b的E.coliBL21(DE3)對照菌株粗酶液，泳道2為包含重組質粒pET25b-GOX2071的大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株誘導表達后的粗酶液，泳道3為重組D-乳酸氧化酶陰離子交換柱Source30Q的初步純化結果，泳道4為重組D-乳酸氧化酶使用HisTrapNi親和層析柱進一步純化結果。圖2為重組D-乳酸氧化酶的最適pH(A)和pH穩(wěn)定性(B)檢測結果。圖3為重組D-乳酸氧化酶的最適溫度(A)和溫度穩(wěn)定性(B)檢測結果。圖4為重組D-乳酸氧化酶催化的底物D-乳酸和產物H2O2的濃度對應關系。具體實施方式下面通過實施例進一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明保護內容不僅限于此。實施例1：包含氧化葡萄糖酸桿菌621HD-乳酸氧化酶基因的大腸桿菌重組表達菌株的構建1、氧化葡萄糖酸桿菌621HD-乳酸氧化酶基因GOX2071的PCR擴增采用常規(guī)的方法制備氧化葡萄糖酸桿菌621H的基因組DNA，該過程可參考科學出版社出版的《精編分子生物學指南》中細菌基因組的小量制備的方法，提取氧化葡萄糖酸桿菌621H的基因組DNA；設計引物，引入能插入質粒pET25b(Novagen)的NdeI和XhoI限制性酶切位點，引物序列如下：上游引物5’-AAGCATATGCCGGAACCAGTCATGA-3’，攜帶一個NdeI位點；下游引物5’-CAACTCGAGGCCCGTGTAAACAGCA-3’，攜帶一個XhoI位點。以提取氧化葡萄糖酸桿菌621H的基因組DNA，利用上述引物進行PCR擴增。擴增獲得的D-乳酸氧化酶基因GOX2071序列長度為1434bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、包含D-乳酸氧化酶基因GOX2071的重組質粒的構建將上述PCR擴增獲得的產物利用BIOMIGA膠回收試劑盒進行回收，PCR回收產物與pET25b質粒分別使用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切，酶切產物分別進行膠回收后，使用T4DNA連接酶(Thermo)22℃連接1小時，連接產物熱激轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素抗性平板，篩選陽性重組菌株，并利用適用于pET25b的通用引物T7和T7Ter測序。測序由北京六合華大基因公司完成，將測序結果進行序列比對分析，PCR產物與預期相符，核酸序列為1434bp，編碼477個氨基酸，如SEQIDNO.1所示。測序正確的菌株即為構建獲得的含有重組質粒pET25b-GOX2071的大腸桿菌重組克隆菌株。3.包含D-乳酸氧化酶基因GOX2071的重組表達菌株的構建將上述篩選到的正確的大腸桿菌重組克隆菌株接種于5mL含有終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6～12小時，提取重組質粒，取重組質粒30～100μg，熱激轉化100μL大腸桿菌BL21(ED3)感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素抗性平板，篩選陽性重組菌株并提取質粒進行測序，測得序列如SEQIDNO.1所示，測序正確的重組表達菌株命名為大腸桿菌BL21(pET25b-GOX2071)。4.包含D-乳酸氧化酶基因GOX2071的重組表達菌株的保存將上述重組菌株大腸桿菌BL21(pET25b-GOX2071)在添加100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6～12小時，于無菌超凈臺內取1mL菌液加入已滅過菌的1.5mL離心管中，6,000rpm離心3分鐘，棄上清，加入1mL已滅菌的20％甘油重懸菌體，于-20℃保存。實施例2：氧化葡萄糖酸桿菌621H重組D-乳酸氧化酶在大腸桿菌重組菌株中的表達將實施例1獲得的重組菌株大腸桿菌BL21(pET25b-GOX2071)的甘油管，以1％接種量接種于5mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6～12小時后，以1％接種量轉接至100mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6～12小時，之后再次以2.5％接種量轉接至1L含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，當OD600nm達到0.4～0.8后加入終濃度1mmol/L的IPTG誘導表達，37℃誘導表達6小時。誘導培養(yǎng)結束后，6,000rpm離心10分鐘收集菌體，菌體沉淀使用67mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌兩次后，使用陰離子交換柱結合緩沖液BufferA(pH7.4，20mmol/L磷酸鈉)重懸菌體細胞，調節(jié)菌體濃度至OD600nm為25，加入1mmol/LPMSF和10％甘油，于冰上超聲破碎，破碎流程為工作6秒，間歇6秒，工作15分鐘，菌體破碎液12,000rpm4℃下離心30～60分鐘除去完整細胞和細胞碎片，所獲得的上清液即為含有重組D-乳酸氧化酶的粗酶液。實施例3：氧化葡萄糖酸桿菌621H重組D-乳酸氧化酶的純化1、利用Souce30Q陰離子交換柱對D-乳酸氧化酶的初步純化將實施例1獲得的含有重組D-乳酸氧化酶的粗酶液，使用0.22μm孔徑的濾頭過濾后，上BufferA平衡過的陰離子交換柱Source30Q，使用陰離子交換柱洗脫緩沖液BufferB梯度洗脫，洗脫梯度為40％，50％，65％，100％，收集含有D-乳酸氧化酶的65％梯度洗脫液，即獲得初步純化的重組D-乳酸氧化酶(圖1)。上述陰離子交換柱洗脫緩沖液BufferB的配方為：20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L氯化鈉，pH7.4。2、利用HisTrapNi親和層析柱對D-乳酸氧化酶進一步的純化將上述含有D-乳酸氧化酶的洗脫液，使用AmiconUltra-4超濾濃縮管濃縮后，加入濃縮液2倍體積的HisTrap結合緩沖液，混勻過濾后上HisTrapHP(5mL)Ni親和層析柱，按照10％，40％，100％HisTrap洗脫緩沖液的梯度洗脫，收集含有D-乳酸氧化酶的40％梯度洗脫液，即獲得電泳純的重組D-乳酸氧化酶(圖1)。上述HisTrap結合緩沖液配方為：20mmol/L磷酸鈉，20mmol/L咪唑，500mmol/L氯化鈉，pH7.4。上述HisTrap洗脫緩沖液配方為：20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L咪唑，500mmol/L氯化鈉，pH7.4。3、重組D-乳酸氧化酶溶液的脫鹽與保存將上一步HisTrapNi親和層析柱純化后獲得的含有D-乳酸氧化酶的40％梯度洗脫液用AmiconUltra-4超濾濃縮后，加入濃縮液15倍體積的50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)，再次脫鹽濃縮，所得濃縮液直接使用液氮速凍后置于-80℃保存，用于后續(xù)的酶學性質鑒定和應用研究。實施例4：氧化葡萄糖酸桿菌621H重組D-乳酸氧化酶的酶學性質1.利用人工電子受體3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)還原法測定pH和溫度對重組D-乳酸氧化酶的影響利用人工電子受體MTT還原法測定重組D-乳酸氧化酶活力的方法如下，使用UltrospecTM2100pro紫外可見分光光度計測定，常規(guī)的MTT還原法酶活測定體系(0.8mL)為：50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)，10mmol/LD-乳酸，0.2mmol/LMTT，0.2mmol/LPMS，適量酶液。檢測溫度為30℃，檢測波長為578nm，讀數間隔2秒，讀數時間30秒。其中，MTT的還原速率直接反映D-乳酸氧化酶氧化D-乳酸的速率，MTT的還原速率通過在578nm處的光吸收來測定。用不同pH的緩沖液配置酶反應體系，按照上述酶活測定方法測定不同pH下的相對酶活。結果表明，酶的最適pH為8.0(圖2A)。將酶在上述不同pH的緩沖液中保存30分鐘后，按照上述常規(guī)的MTT還原法酶活測定體系，測定相對酶活，結果表明酶在pH7.0～9.0的范圍內最穩(wěn)定(圖2B)。上述不同pH的緩沖液分別為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH4.0～8.0，0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH8.0～11.0。按照上述常規(guī)的MTT還原法酶活測定體系，在不同溫度下測定相對酶活，結果表明，酶的最適反應溫度為55℃(圖3A)。將酶在上述不同溫度下保存30分鐘后，在30℃下測定相對酶活，結果表明，酶在50℃以下穩(wěn)定性較好(圖3B)。上述不同的溫度分別為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃。2.重組D-乳酸氧化酶的表觀動力學參數的測定重組D-乳酸氧化酶活力使用帶有自動控溫裝置的Clark型液相氧電極(Oxytherm,Hansatech,英國)進行測定。測定體系(0.5mL)為：50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)，20mmol/LD-乳酸，適量酶液。反應室內轉子轉速為900rpm，檢測溫度為30℃。重組D-乳酸氧化酶的酶活力定義為：將每分鐘催化1μmol的O2還原所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。重組D-乳酸氧化酶對D-乳酸的表觀動力學參數，采用空氣-飽和的50mmol/LTris-HCl緩沖液(即固定濃度的O2)和不同濃度的D-乳酸進行測定；對O2的表觀動力學參數，采用固定濃度的D-乳酸(20mmol/L)和含有不同濃度O2的50mmol/LTris-HCl緩沖液進行測定。結果顯示，該酶對D-乳酸的表觀Km和Vmax分別為3.62±0.53mmol/L和0.52±0.05U/mg，該酶對另一底物O2的表觀Km和Vmax分別為0.16±0.01mmol/L和0.97±0.03U/mg。實施例5：氧化葡萄糖酸桿菌621H重組D-乳酸氧化酶的應用分別向酶標儀配置的96孔板的各孔中，加入90μL使用50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)稀釋至0.35U/mL的重組D-乳酸氧化酶酶液，隨后用排槍加入10μL不同濃度的D-乳酸，立即吹吸混勻，室溫反應1分鐘，立即用排槍加入10μL3mol/L硫酸溶液終止反應。將反應液轉移至1.5mL離心管，4℃13,000rpm離心15分鐘除去變性蛋白沉淀，上清液中的過氧化氫濃度使用碧云天公司的過氧化氫檢測試劑盒測定，具體測定步驟如下：取80μL上清液加入新的96孔板中，加入100μL冰上解凍的過氧化氫檢測試劑，輕輕振蕩混勻，室溫放置30分鐘后，立即使用酶標儀測定560nm下的吸光值。利用過氧化氫檢測試劑盒配備的1mol/L過氧化氫標準品進行標準曲線的繪制，標準曲線范圍選擇1μmol/L～50μmol/L。根據標準曲線分別計算上述反應過程中生成的過氧化氫濃度。結果顯示，在一定濃度的重組D-乳酸氧化酶催化作用下，D-乳酸濃度在一定范圍內(如0.1～1.3mmol/L)時，底物D-乳酸濃度與生成的過氧化氫濃度呈線性關系(圖4)，表明重組D-乳酸氧化酶適宜通過固定到能夠直接檢測過氧化氫濃度的過氧化氫電極表面，以制備新型的D-乳酸生物傳感器，用于D-乳酸的檢測。