本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種優(yōu)化型HLA-I類轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法,特別涉及一種提高HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠HLA-I分子抗原提呈能力的方法。

背景技術(shù)：

MHC I類分子的抗原提呈途徑包括三個(gè)階段：抗原肽段的產(chǎn)生、肽段轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肽段與MHC I類分子的結(jié)合和展示。首先，抗原蛋白在細(xì)胞漿中被蛋白酶體降解成3-22個(gè)殘基的短肽。這些短肽經(jīng)過熱休克蛋白HSP90的進(jìn)一步修剪，由抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter associated with antigen presentation，TAP)選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)至粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum，RER)腔內(nèi)。在RER內(nèi)，分子伴侶鈣聯(lián)蛋白(calnexin，CNX)促進(jìn)游離的MHC I重鏈的折疊，并且募集另一分子伴侶ERp57促進(jìn)MHC I類分子結(jié)構(gòu)域中二硫鍵的形成；隨后，β2-微球蛋白(β2m)與MHC I重鏈結(jié)合，CNX解離，MHC I與分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)結(jié)合。當(dāng)TAP相關(guān)蛋白Tapasin(TAP-associated glyprotein)把TAP轉(zhuǎn)運(yùn)到MHC I類分子附近時(shí)，MHC I類分子重鏈/β2m/ERp57/CRT/Tapasin/TAP共同形成了多肽裝載復(fù)合體(peptide-loading complex，PLC)。多肽由TAP轉(zhuǎn)運(yùn)入RER后，PLC中的MHC I類分子對多肽進(jìn)行捕獲。MHC I類分子正確組裝并結(jié)合了多肽后穩(wěn)定性增加，并被從PLC中釋放出來，進(jìn)入分泌途徑到達(dá)細(xì)胞表面，在此接受CTL的監(jiān)視從而觸發(fā)可能的免疫應(yīng)答。因此，MHC I類分子抗原加工遞呈過程是一個(gè)多分子參與的復(fù)雜過程，其中參與的分子都將影響著機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

鑒于MHC I類分子的重要性，目前，多種人源MHC I類分子轉(zhuǎn)基因小鼠(即HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠)已被構(gòu)建并用于人重要病毒CTL表位的篩選、鑒定和免疫治療評價(jià)，如流感病毒、SARS病毒等，為疫苗的開發(fā)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。但是，鑒于體內(nèi)抗原加工和遞呈過程的復(fù)雜性和多因素性，單獨(dú)HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用往往會造成表位的漏選和錯(cuò)選，影響表位篩選的正確性。有文獻(xiàn)指出，由HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中篩選出來的牛痘病毒(VACV)表位多肽僅有1/3能與人體試驗(yàn)結(jié)果相符(Kotturi MF,et al.(2009)Of mice and humans:how good are HLA transgenic mice as a model of human immune responses？Immunome Res 5:3.)。

另外，已知HLA-A3超家族(包含HLA-A11、HLA-A33、HLA-A68等)在中國人群HLA分型中占著最大比例(約52.7％)(Sette,A.and J.Sidney(1999)Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and-B polymorphism.Immunogenetics 50(3-4):201-212.)，其中HLA-A11是A3超家族中分布最廣的，統(tǒng)計(jì) 分析也表明中國乙肝患者中HLA-A11基因頻率較高(梁敏鋒等(2007)中國華南地區(qū)慢性乙型肝炎患者HLA-A等位基因分布的初步調(diào)查及其意義.肝臟12卷4期：240-243)，因此建立該家族相關(guān)的HLA-I轉(zhuǎn)基因動物模型進(jìn)行表位篩選具有重要意義。然而有研究表明，該家族成員偏好結(jié)合C末端為堿性氨基酸的多肽，這一特點(diǎn)正好與小鼠TAP結(jié)合多肽的偏好性不相符(Falk.K.,et al.(1994)Peptide motifs of HLA-A1,-A11,-A31,and-A33molecules.Immunogenetics 40:238-241.)。我們推測，在該類家族HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠中，與之相匹配的多肽被小鼠TAP分子轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)中的效率將大大降低，從而影響表位篩選。

綜合上述內(nèi)容，我們急需構(gòu)建一種優(yōu)化型HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠，使之具有更高的表位篩選效率，以更好地應(yīng)用于重大疾病研究中CTL表位的篩選和疫苗的評價(jià)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法。

本發(fā)明所提供的構(gòu)建抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，具體可包括如下步驟：構(gòu)建hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠，將HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠與所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，所得后代中的雙轉(zhuǎn)基因小鼠即為抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型；

所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠為轉(zhuǎn)入了如下基因的小鼠：人源TAP1基因、人源TAP2基因、人源PSMB8基因和人源PSMB9基因。

在本發(fā)明中，所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠還被轉(zhuǎn)入了兩個(gè)HLA-II類分子HLA-DOB基因和HLA-DMB基因。

其中，所述雙轉(zhuǎn)基因小鼠為既轉(zhuǎn)入了所述HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠中的外源基因，也轉(zhuǎn)入了所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠中的外源基因的小鼠。

具體的，所述人源TAP1基因的核苷酸序列為序列表中的序列1；所述人源TAP2基因的核苷酸序列為序列表中的序列2；所述人源PSMB8基因的核苷酸序列為序列表中的序列3；所述人源PSMB9基因的核苷酸序列為序列表中的序列4。所述HLA-DOB基因的核苷酸序列為序列表中的序列5；所述HLA-DMB基因的核苷酸序列為序列表中的序列6。

其中，序列1由8058個(gè)核苷酸組成；序列2由9328個(gè)核苷酸組成；序列3由3455個(gè)核苷酸組成；序列4由5304個(gè)核苷酸組成；序列5由3728個(gè)核苷酸組成；序列6由6403個(gè)核苷酸組成。

更加具體的，所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠是按照包括如下步驟的方法制備得到的：

(1)將RP11-10A19BAC質(zhì)粒注射到由目的小鼠1的精子和目的小鼠2的卵子 形成的受精卵的原核中，受精卵移植入代孕母鼠中發(fā)育，出生后得到F0代嵌合體小鼠；

所述F0代嵌合體小鼠即為PCR驗(yàn)證鑒定陽性的hTAP首建鼠；

(2)將步驟(1)獲得的所述F0嵌合體代小鼠(陽性首建鼠)與所述目的小鼠2進(jìn)行雜交，通過PCR鑒定和Western blotting分析，從F1代小鼠中獲得轉(zhuǎn)入了所述RP11-10A19BAC質(zhì)粒的雜合體小鼠，該雜合體小鼠即為hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠。

當(dāng)然，所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠也可為將雄性的雜合體小鼠與雌性的雜合體小鼠進(jìn)行一次或多次雜交，從雜交后代中獲得轉(zhuǎn)入了所述RP11-10A19BAC質(zhì)粒的純合體小鼠。

在本發(fā)明中，所述目的小鼠1具體為B6D2F1小鼠，所述目的小鼠2具體為C57BL/6小鼠，所述代孕母鼠具體為ICR小鼠。

在本發(fā)明中，以上所有的所述RP11-10A19BAC質(zhì)粒的GenBank ID為207834。

如上所述的構(gòu)建hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠的方法屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于構(gòu)建抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型的試劑盒。

本發(fā)明所提供的用于構(gòu)建抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型的試劑盒，具體可包括所述HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠、所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠以及可讀性載體；所述可讀性載體中記載有如上所述的構(gòu)建抗原提呈能力增強(qiáng)的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠的試劑盒。

本發(fā)明所提供的用于構(gòu)建hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠的試劑盒，具體可包括RP11-10A19BAC質(zhì)粒以及可讀性載體；所述可讀性載體中記載有如上所述的構(gòu)建hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。

所述hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠在增強(qiáng)HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠的抗原提呈能力中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，所述HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠可為HLA-A2、HLA-A11、HLA-A1、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B27、HLA-B4等目前已有報(bào)道的HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠具體為HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠或HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠。所述HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠為轉(zhuǎn)入HLA-A2基因的C57BL/6J背景小鼠；所述HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠為轉(zhuǎn)入HLA-A11基因的C57BL/6J×BALB/c背景小鼠。

所述抗原提呈為對相應(yīng)轉(zhuǎn)基因小鼠的HLA-I限制性表位多肽的提呈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠具體為HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠；所述HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠相應(yīng)的抗原提呈為對HLA-A11限制性表位多肽的提呈，所述HLA-A11限 制性表位多肽具體為HBc141-151，其氨基酸序列為STLPETTVVRR(序列7)。

在本發(fā)明中，所述增強(qiáng)HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠的抗原提呈能力具體體現(xiàn)為針對所述HLA-I限制性表位多肽的CTL反應(yīng)的增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明構(gòu)建了hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠，將hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠與HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配，繁育出HLA-I/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與HLA-I單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，HLA-I/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠對抗原提呈的能力增強(qiáng)?？梢?，hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠有助于HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-I的抗原提呈并增強(qiáng)CTL反應(yīng)。

附圖說明

圖1為PCR鑒定hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠中人MHC I類抗原提呈途徑相關(guān)分子。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為500bp、400bp、300bp和200bp。

圖2為Western blotting鑒定hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠中人TAP2蛋白的表達(dá)。

圖3為在HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，HLA-A2分子的表達(dá)得到顯著上調(diào)。A：HLA-A2表達(dá)流式圖。A2-hTAP表示HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠；A2表示HLA-A2單轉(zhuǎn)基因小鼠；WT表示野生型C57BL/6J小鼠。B：HLA-A2表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖。

圖4為在HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，HLA-A11分子的表達(dá)得到顯著上調(diào)。A：脾細(xì)胞表面HLA-A11表達(dá)流式圖(左)及其統(tǒng)計(jì)圖(右)，***P<0.001。B：脾細(xì)胞表面H2-K^b表達(dá)量流式圖(左)及其統(tǒng)計(jì)圖(右)。A11-hTAP表示HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠；A11het表示HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠；TAP表示hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠；WT表示野生型C57BL/6J小鼠。

圖5為HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠對HLA-A11限制性表位的CTL反應(yīng)明顯強(qiáng)于HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠。A：Elispot檢測兩種小鼠對HBc141-151的CTL反應(yīng)，A11-hTAP(n＝5)，A11het(n＝5)，多肽濃度1μg/ml；B：Elispot點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，*P<0.05，**P<0.01。

圖6為HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中CTL反應(yīng)顯著增強(qiáng)。A：IFN-γ胞內(nèi)染色散點(diǎn)圖；B：INF-γ⁺CD8⁺細(xì)胞百分比統(tǒng)計(jì)圖，^*P<0.05，^**P<0.01。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

RP11-10A19BAC質(zhì)粒，GenBank ID：207834，該質(zhì)粒為美國CHOIR(Children’s Hospital Oakland Research Institute)產(chǎn)品。RP11-10A19BAC質(zhì)粒包含的人MHC I類抗原提呈途徑相關(guān)分子有TAP1、TAP2、PSMB8和PSMB9，另外還含有兩個(gè)人MHC II類相關(guān)分子HLA-DOB、HLA-DMB。

HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠：由中國科學(xué)院微生物研究所孟頌東課題組惠贈，其遺傳背 景為C57BL/6J小鼠。記載于“任玉林等.(2010)新型HLA-A2限制的B,C型HBV特異性CTL表位的篩選及鑒定.科學(xué)通報(bào)(55)30：2915～2924”一文中，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。

HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠：來自Taconic公司，雄性模型小鼠編號9660-M，雌性模型小鼠編號9660-F。其遺傳背景為C57BL/6J×BALB/c小鼠。

C57BL/6J小鼠：來自北京華阜康生物科技股份有限公司，電話：010-60753558。

ICR小鼠：雌性，來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

B6D2F1小鼠：雄性，來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

pCDNA3.1-HBc(D)質(zhì)粒：由中國科學(xué)院微生物研究所孟頌東課題組惠贈。記載于“Xu Y.,et al(2013)Activation of anti-HBV immune activity by DNA vaccine via electroporation using heat shock proteins as adjuvant.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao29(12):1765-75”一文中，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。該質(zhì)粒攜帶有乙肝病毒核心抗原的基因序列，其中乙肝病毒核心抗原的基因序列為序列表中序列8。

實(shí)施例1、hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

一、F0代嵌合體小鼠的獲得

1、F0代小鼠的獲得

用BAC注射緩沖液(配方為：10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，100mM NaCl，10μM亞精胺，30μM精胺，pH7.2)將RP11-10A19BAC質(zhì)粒配制成濃度為1ng/μl的溶液。將配制好的溶液充滿顯微注射針，將顯微注射針安裝到顯微注射顯微鏡上，在顯微鏡下進(jìn)行顯微操作，即推動注射針透過受精卵(精子來源于B6D2F1小鼠，卵子來源于C57BL/6小鼠)透明質(zhì)帶，利用壓力泵的持續(xù)壓力(約150hPa)向原核注入注射針中的DNA，若原核膨脹則表明注射成功(注入體積極難精確控制，以原核體積發(fā)生明顯膨脹為指導(dǎo)性標(biāo)準(zhǔn))。將受精卵置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)至2-細(xì)胞期后移植到代孕雌鼠(ICR小鼠)中，最終獲得F0代小鼠。

2、F0代小鼠基因組制備

F0代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液(由上海南方模式生物有限公司提供，產(chǎn)品目錄號：NMS014)及40μl蛋白酶K(濃度為10mg/ml)，56℃消化過夜。離心取上清，兩倍體積無水乙醇沉淀，75％乙醇洗滌，稍晾干后溶解于100μl純水中，50℃烘箱助溶1小時(shí)。

3、F0代小鼠基因型鑒定

以步驟2獲得的各F0代小鼠的基因組為模板，分別對人源TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB基因(6個(gè)人源基因的序列依次為序列表中序列1-6 所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對各基因的引物序列如下：

針對人源TAP1基因的引物對為：

TAP1-F：5’-GCCTCTTATCGTGTGCTTCT-3’；

TAP1-R：5’-CCATCTCCACCCAAGGTC-3’。

TAP1-F/TAP1-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為319bp。

針對人源TAP2基因的引物對為：

TAP2-F：5’-CGCCCACAGTGTTAGGT-3’；

TAP2-R：5’-GAAGAGGCGTTTGGAATAG-3’。

TAP2-F/TAP2-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為234bp。

針對人源PSMB8基因的引物對為：

PSMB8-F：5’-AGTACGTCAGGTATTTAGC-3’；

PSMB8-R：5’-GAGGGAGTAGGAGTATATG-3’。

PSMB8-F/PSMB8-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為438bp。

針對人源PSMB9基因的引物對為：

PSMB9-F：5’-CACTTAATGTCTCAGTGGGA-3’；

PSMB9-R：5’-TATTTCTCTTCCTGTTCCTC-3’。

PSMB9-F/PSMB9-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為289bp。

針對人源HLA-DOB基因的引物對為：

HLA-DOB-F：5’-TAAACGTGTCTGGTATGTC-3’；

HLA-DOB-R：5’-AGTTAAAGATGAATCTGACC-3’。

HLA-DOB-F/HLA-DOB-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為347bp。

針對人源HLA-DMB基因的引物對為：

HLA-DMB-F：5’-CAAAGGAACATCCAGATGAAG-3’；

HLA-DMB-R：5’-TCCCCCATACTCCCTGAAG-3’。

HLA-DMB-F/HLA-DMB-R理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小為228bp。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以H₂O作為模板的空白對照，以C57BL/6J小鼠(野生型)基因組作為模板的陰性對照，以及以人基因組作為模板的陽性對照。

結(jié)果顯示，通過受精卵顯微注射和移植，受體小鼠數(shù)為4只，懷孕數(shù)為4只，懷孕率100％；移植卵數(shù)為30枚/只，總共出生小鼠(F0代)數(shù)為24只，出生率20％。陽性2只，陽性率8.3％。6個(gè)人源基因均擴(kuò)增得到相應(yīng)目的條帶的F0代小鼠即為RP11-10A19BAC質(zhì)粒注射和移植成功的F0代嵌合體小鼠。

二、F1代雜合體小鼠的獲得及基因型鑒定

1、F1代小鼠的獲得

根據(jù)步驟一對F0代小鼠的基因型鑒定結(jié)果，選取陽性的F0代嵌合體小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，得到F1代小鼠(野生型和雜合型)。

2、F1代小鼠基因組制備

參照步驟一2進(jìn)行。

3、F1代小鼠基因型鑒定

參照步驟一3進(jìn)行。

六個(gè)人源基因均擴(kuò)增得到相應(yīng)目的條帶的F1代小鼠即為鑒定陽性的轉(zhuǎn)入RP11-10A19BAC質(zhì)粒的F1代雜合小鼠。部分轉(zhuǎn)入RP11-10A19BAC質(zhì)粒的F1代雜合體小鼠(Founder2和Founder14)的PCR鑒定結(jié)果如圖1所示。

4、F1代小鼠表達(dá)鑒定

取F1代小鼠脾臟細(xì)胞作為樣本提取蛋白，針對人源TAP2蛋白進(jìn)行Western blotting檢測。其中，所用一抗為抗人源TAP2蛋白的抗體(鼠源，MBL公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為K0137-3)；二抗為抗小鼠IgG的抗體(山羊源，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為ZDR-5307)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參，一抗為抗β-actin的抗體(鼠源，三箭公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為DKM9001)；二抗為抗小鼠IgG的抗體(山羊源，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為ZDR-5307)。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置C57BL/6J小鼠(野生型)作為對照。

有明顯人源TAP2蛋白檢測信號的F1代小鼠為轉(zhuǎn)入RP11-10A19BAC質(zhì)粒的表達(dá)陽性F1雜合小鼠。部分轉(zhuǎn)入RP11-10A19BAC質(zhì)粒的F1代雜合體小鼠(Founder2和Founder14)的Western blotting鑒定結(jié)果如圖2所示。該小鼠的背景為C57BL/6J×B6D2F1，可繁殖用于試驗(yàn)。

為了進(jìn)一步對F1代雜合體小鼠進(jìn)行確認(rèn)，本發(fā)明的發(fā)明人對其進(jìn)行了基因測序，結(jié)果顯示，F(xiàn)1代雜合體小鼠(Founder2和Founder14)確實(shí)含有序列表中序列1-6所示的6個(gè)人源基因(TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB)。

三、F10代C57BL/6J背景hTAP雜合體小鼠的獲得及基因型鑒定

選取步驟二獲得的F1代雜合體小鼠與野生型C57BL/6J進(jìn)行交配，通過基因型鑒定(步驟一，3)和表達(dá)鑒定(步驟二4)以及序列測定獲得陽性F2代雜合體小鼠。再將陽性F2代雜合體小鼠與野生型C57BL/6J進(jìn)行繁殖，獲得陽性F3代雜合體小鼠，依此類推進(jìn)繁殖，最終獲得F10代C57BL/6J背景的陽性hTAP雜合體小鼠。

四、C57BL/6J背景hTAP純合體小鼠的獲得及基因型鑒定

選取步驟三獲得的雄性F10代雜合體小鼠與雌性F10代雜合體小鼠進(jìn)行一次或多次交配，獲得小鼠(野生型、雜合體、純合體)通過基因型鑒定(步驟二3)和表達(dá) 鑒定(步驟二4)獲得陽性純合體小鼠，可用于保種實(shí)驗(yàn)。

純合小鼠的判定：

同時(shí)滿足如下I)和II)兩個(gè)條件的小鼠判定為轉(zhuǎn)入RP11-10A19BAC質(zhì)粒且可表達(dá)轉(zhuǎn)入人源蛋白的hTAP純合小鼠：

I)經(jīng)過以上步驟二3和步驟二4均鑒定得到陽性結(jié)果；

II)與C57BL/6J野生型小鼠雜交的所有后代經(jīng)過以上步驟二3和步驟二4的鑒定，同樣均可得到陽性結(jié)果。

實(shí)施例2、hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠對HLA-I轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)化作用研究

一、HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A2在細(xì)胞表面的表達(dá)量得到提升

1、HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得

將實(shí)施例1構(gòu)建的F10代hTAP轉(zhuǎn)基因雜合體小鼠與HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6背景雜合體)進(jìn)行交配，對雜交后代進(jìn)行如下鑒定：

(1)基因型鑒定

對人源TAP1、TAP2、PSMB8、PSMB9、HLA-DOB和HLA-DMB基因的分子鑒定，參照實(shí)施例1步驟一3進(jìn)行。6個(gè)基因PCR結(jié)果陽性的小鼠為hTAP陽性小鼠，反之為hTAP陰性小鼠。

對HLA-A2基因的分子鑒定的引物對為：

HLA-A2F：5’-GCCCCGAACCCTCGTC-3’；

HLA-A2R：5’-TGAGTGGGCCTTCACTTTC-3’；

理論擴(kuò)增片段大小為270bp。PCR擴(kuò)增陽性的小鼠為HLA-A2陽性小鼠，反之為HLA-A2陰性小鼠。

(2)蛋白表達(dá)鑒定

對人源TAP2蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，參照實(shí)施例1步驟二4進(jìn)行。人源TAP2蛋白表達(dá)的為hTAP陽性小鼠，不表達(dá)為hTAP陰性小鼠。

對HLA-A2的表達(dá)的檢測，采用檢測小鼠外周血單核細(xì)胞表面HLA-A2表達(dá)的方法，染色方法見下文之步驟2。

根據(jù)各雜交后代的(1)和(2)的鑒定結(jié)果，確定雜交后代中的HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠、HLA-A2單轉(zhuǎn)基因小鼠、hTAP單轉(zhuǎn)基因小鼠以及野生型WT小鼠。

2、HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A2在細(xì)胞表面的表達(dá)量檢測

分別取HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A2單轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞表面染色，具體操作如下：

(1)處死小鼠，切開小鼠左側(cè)腹部取出脾臟，置于鐵篩網(wǎng)中，在預(yù)先盛好約10ml 2％FBS DMEM培養(yǎng)基的6cm平皿上研磨，將所得細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中；

(2)離心：4℃1500轉(zhuǎn)/min水平離心5min，棄上清，輕輕震蕩使底部細(xì)胞彈起；

(3)裂解紅細(xì)胞：用200μl移液器吸取100μl的10×PBS放在一旁待用，用1ml移液器吸取900μl滅菌ddH₂O加入上步15ml離心管中，迅速用漩渦震蕩儀震蕩，約5s后迅速加入旁邊準(zhǔn)備好的100μl 10×PBS，繼續(xù)震蕩混勻5s，加入2％DMEM至10ml；

(4)離心：4℃1500轉(zhuǎn)/min水平離心5min，棄上清，輕輕震蕩使底部細(xì)胞彈起；

(5)清洗：加入2％FBS DMEM至10ml，4℃1500轉(zhuǎn)/min水平離心5min，棄上清，輕輕震蕩使底部細(xì)胞彈起；

(6)重懸與過濾：加入5ml 10％FBS 1640培養(yǎng)基重懸，通過200目尼龍膜轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，混勻，吸出10μl到1.5ml EP管中用于計(jì)數(shù)(細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下計(jì)數(shù))；

(7)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果吸取1×10⁶個(gè)脾細(xì)胞/只，進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，染色的分子為CD4、CD8、B220以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物HLA分子，相對應(yīng)的抗體分別為anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-HLA-A2(Biolegend，Catalog：343304)。

(8)流式細(xì)胞儀(Facs Calibur)檢測CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞以及B細(xì)胞(B220⁺)表面HLA-A2分子的表達(dá)水平。

每種小鼠隨機(jī)選取6-8周齡5只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置同窩hTAP小鼠和野生型WT小鼠作為對照。

結(jié)果顯示，HLA-A2/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞表面的HLA-A2的表達(dá)量高于單獨(dú)HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的HLA-A2表達(dá)量，并且差異顯著(圖3)。

二、HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11的表達(dá)量得到顯著提升

1、HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得

將實(shí)施例1構(gòu)建的F10代hTAP轉(zhuǎn)基因雜合體小鼠與HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠(雜合子)進(jìn)行交配，通過實(shí)施例1中步驟二3和步驟二4的鑒定，分別得到HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠、HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠、hTAP小鼠以及野生型WT小鼠。

2、HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11在細(xì)胞表面的表達(dá)量檢測

A.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞表面HLA-A11分子的表達(dá)水平，具體操作如下：

(1)脾細(xì)胞獲取方法同前述步驟一2中(1)-(6)。

(2)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果吸取1×10⁶個(gè)脾細(xì)胞/只，進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，染色的分 子為CD4、CD8、B220以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物HLA分子，相對應(yīng)的抗體分別為anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-HLA ABC FITC(Beckman，Catalog：PN IM1838U)。

(3)流式細(xì)胞儀(Facs Calibur)檢測CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞以及B細(xì)胞(B220⁺)表面HLA-A11分子的表達(dá)水平。

每種小鼠隨機(jī)選取6-8周齡4-6只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置同窩hTAP小鼠和野生型WT小鼠作為對照。

結(jié)果顯示，與單獨(dú)HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠相比，HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠的HLA-A11表達(dá)水平得到了顯著的上調(diào)(圖4中A)。這種上調(diào)預(yù)示著在雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，由于得到人源TAP分子等的輔助，HLA-A11結(jié)合到合適表位的概率大大增加，因而將抗原穩(wěn)定遞呈至細(xì)胞表面的能力也會得到顯著增強(qiáng)。

B.本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步檢測了該上調(diào)作用針對的是HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11分子還是小鼠自身MHC I類分子H2-K^b。具體操作如下：

(1)脾細(xì)胞獲取方法同前述步驟一2中(1)-(6)。

(2)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果吸取1×10⁶個(gè)脾細(xì)胞/只，進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，染色的分子為CD4、CD8、B220以及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物HLA分子，相對應(yīng)的抗體分別為anti-mouse CD4APC(Biolegend公司，Catalog：100412)，anti-mouse CD8αFITC(Biolegend公司，Catalog：100705)，anti-mouse B220PerCP-Cy5.5(eBioscience，Catalog：45-0452-80)，以及anti-mouse H2-K^b(Biolegend，Catalog：116507)。

(3)流式細(xì)胞儀(Facs Calibur)檢測CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞以及B細(xì)胞(B220⁺)表面H2-K^b分子的表達(dá)水平。

每種小鼠隨機(jī)選取4-6只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置同窩hTAP小鼠和野生型WT小鼠作為對照。

結(jié)果顯示，該上調(diào)作用主要針對HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11分子，小鼠自身MHC I類分子H2-K^b并沒有發(fā)生顯著的表達(dá)上調(diào)(圖4中B)。

三、同HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11限制性表位的CTL活性顯著增強(qiáng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠對HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)化作用，本發(fā)明的發(fā)明人通過DNA免疫的方法，比較HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠與HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠對同一抗原表位的CTL反應(yīng)。

HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠和HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠各隨機(jī)選取6-8周齡5-7只，對小鼠進(jìn)行兩次肌肉注射乙肝病毒核心抗原真核表達(dá)載體pCDNA3.1-HBc(D)質(zhì)粒(每 次注射量均為100μg/只，兩次注射之間隔14天)，末次注射后第11天檢測兩種小鼠針對HBc核心抗原中HLA-A11限制性表位HBc141-151(STLPETTVVRR，序列7)的CTL反應(yīng)。具體操作如下：

(1)脾細(xì)胞獲取方法同前述步驟一2中(1)-(6)，之后進(jìn)行以下IFN-γElispot檢測和胞內(nèi)IFN-γ染色，檢測CTL反應(yīng)。

(2)IFN-γElispot檢測：小鼠IFN-γElispot檢測試劑盒來自BD公司，貨號(551083)，具體操作步驟按試劑盒說明書操作。過程如下：第一步，用抗小鼠IFN-γ抗體(試劑盒包含)包被Elispot 96孔板8～16個(gè)小時(shí)；第二步，獲取脾細(xì)胞當(dāng)天，相應(yīng)的待測孔中加入含特定的刺激物(多肽)的10％FBS 1640培養(yǎng)基100μl，加入含1×10⁶個(gè)待測樣本細(xì)胞的10％FBS 1640培養(yǎng)基100μl，形成200μl的培養(yǎng)體系，細(xì)胞均勻地鋪在平板底部；第三步，將添加有刺激物的細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20個(gè)小時(shí)，刺激過程中，多肽特異性的CTL細(xì)胞將會被相應(yīng)多肽刺激持續(xù)分泌IFN-γ，分泌的IFN-γ將在細(xì)胞所在位置被Elispot板上預(yù)先包被的IFN-γ抗體捕獲；第四步，棄去細(xì)胞液體，洗板，加入Biotin標(biāo)記的抗IFN-γ抗體，分泌IFN-γ的細(xì)胞位置將被Biotin標(biāo)記的抗IFN-γ抗體標(biāo)記；第五步，顯色反應(yīng)，試劑盒AEC Substrate Set(BD公司，貨號551951)，分泌IFN-γ的位置將形成一定大小的紅色斑點(diǎn)，1個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異性的抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞，斑點(diǎn)的多少體現(xiàn)了CTL免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。

(3)多肽刺激與胞內(nèi)IFN-γ染色：第一步，96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，貨號：Costar-3799)相應(yīng)的待測孔中加入含特定刺激物(多肽)的10％FBS 1640培養(yǎng)基100μl，加入含1×10⁶個(gè)待測樣本細(xì)胞的10％FBS 1640培養(yǎng)基100μl，形成200μl的培養(yǎng)體系，刺激物配制時(shí)同時(shí)加入Monensin(Biolegend，貨號：420701)，使最終培養(yǎng)體系Monensin濃度變成1×(原液為1000×)；第二步，37℃CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6小時(shí)；第三步，細(xì)胞表面染色，使用抗體為anti-mouse CD4PerCP(三箭公司，Catalog：M10043-32C)，anti-mouse CD8αPE(Biolegend公司，Catalog：100708)；第四步，胞內(nèi)IFN-γ染色，使用的抗體為anti-mouse IFN-γAPC(eBioscience，Catalog：17-7311-82)；第五步，流式細(xì)胞儀(Facs Calibur)檢測CD8⁺T細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)水平，與陰性對照(不加多肽刺激)相比，CD8⁺IFN-γ⁺的細(xì)胞即為抗原特異性的CTL細(xì)胞，CD8⁺IFN-γ⁺的細(xì)胞的百分比越高，說明相應(yīng)的CTL反應(yīng)越強(qiáng)。

Elispot檢測結(jié)果如圖5所示，HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的CTL反應(yīng)強(qiáng)度明顯大于HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠，并且差異顯著。這表明hTAP轉(zhuǎn)基因小鼠不僅提高了HLA-A11轉(zhuǎn)基因小鼠中HLA-A11的表達(dá)，同時(shí)也增強(qiáng)了HLA-A11對限制性表位的提呈，促進(jìn)了體內(nèi)的CTL反應(yīng)。

多肽刺激與胞內(nèi)IFN-γ染色結(jié)果如圖6所示，與HLA-A11單轉(zhuǎn)基因小鼠相比， HBc141-151多肽刺激后胞內(nèi)IFN-γ染色表明HLA-A11/hTAP雙轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)更多的IFN-γ，激活出更強(qiáng)的CTL反應(yīng)，并且差異顯著。