本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及Vero細(xì)胞DNA的檢測引物及方法。
背景技術(shù)：
：Vero細(xì)胞是從非洲綠猴(CercopithecusAethiops)的腎臟上皮細(xì)胞中分離培養(yǎng)出來的非洲綠猴腎細(xì)胞，其是一種異倍體細(xì)胞，經(jīng)獼猴腎細(xì)胞培養(yǎng)衍化后產(chǎn)生的，和著名的Hela細(xì)胞系、犬腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)一樣是常用的細(xì)胞系。Vero細(xì)胞用途十分廣泛，可以：1.用于檢查大腸桿菌毒素；2.作為培養(yǎng)病毒的細(xì)胞宿主；3.作為真核寄生蟲的宿主細(xì)胞，尤其是錐體蟲屬。Vero細(xì)胞屬于傳代細(xì)胞系，易于培養(yǎng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)，為WHO推薦的人用疫苗細(xì)胞基質(zhì)之一。作為傳代細(xì)胞系，以Vero細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)疫苗的風(fēng)險在于細(xì)胞殘余DNA具有潛在的致瘤性。因此，建立準(zhǔn)確定量制品中Vero細(xì)胞殘留量的方法對于疫苗的安全性和質(zhì)量控制至關(guān)重要。目前，WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)是每劑量制品中的終DNA含量必須小于10ng；美國FDA建議使用檢測靈敏度達(dá)到10pg的檢測方法檢測制品中的DNA水平；而中國藥典規(guī)定每劑量疫苗中的Vero細(xì)胞殘留量必須小于100pg。這就要求具備高靈敏度的引物對以及檢測試劑來檢測Vero細(xì)胞DNA。在現(xiàn)有技術(shù)一般針對Vero細(xì)胞基因組中的一類長的串聯(lián)重復(fù)序列設(shè)計引物和探針，所設(shè)計的引物對能夠具備一定的檢測靈敏度，但僅能達(dá)到1fg/μ，例如，胡廣宏等設(shè)計的引物對靈敏度達(dá)到30fg/μl(SYBR-Green實時定量PCR用于Vero宿主細(xì)胞DNA殘留量的檢測，中國新藥雜志，2012年，第21卷，第10期)和曹守春等(Vero細(xì)胞LTR基因的克隆及其DNA定量PCR檢測方法的建立，中國生物制品學(xué)雜志，2011年，第24卷，第5期)設(shè)計的引物對靈敏度達(dá)到1fg/μl。然而，由于非洲綠猴與人基因組的同源性較高，現(xiàn)有技術(shù)中的引物對對于人來源基因的抗干擾性不強(qiáng)，并且現(xiàn)有技術(shù)中引物對的靈敏度也并不能令人滿意。綜上所述，本領(lǐng)域急需能夠檢測生物制品中Vero細(xì)胞DNA的新引物對和檢 測方法，所述引物對和檢測方法應(yīng)具備高特異性、高靈敏度，并且應(yīng)具備操作簡便、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點(diǎn)，從而能用于生物制品，特別是疫苗的質(zhì)量控制。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測生物制品中Vero細(xì)胞DNA的引物對以及包含所述引物對的檢測體系和檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用本發(fā)明的引物對檢測生物制品中Vero細(xì)胞DNA的方法。在第一方面，本發(fā)明提供一種檢測Vero細(xì)胞基因組DNA的引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物結(jié)合于Vero細(xì)胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示序列的第15-41位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第92-113位，并且所述引物對所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為95-105bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為22-27bp；優(yōu)選27和22bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58-60℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在具體的實施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在第二方面，本發(fā)明提供一種檢測試劑，所述檢測試劑包含本發(fā)明第一方面所述的引物對。在具體的實施方式中，所述引物對中的正向引物如SEQIDNO:2所示，所述引物對中的反向引物如SEQIDNO:3所示。在具體的實施方式中，所述檢測試劑還包含探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針如SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述檢測試劑的檢測靈敏度為0.1fg/μl。在具體的實施方式中，所述檢測試劑包含SEQIDNO:2所示正向引物、SEQIDNO:3所示反向引物、和SEQIDNO:4所示探針。在第三方面，本發(fā)明提供一種檢測Vero細(xì)胞基因組DNA的方法，所述方法 包括：利用本發(fā)明第一方面所述的引物對或第二方面所述的檢測試劑，對待測樣品進(jìn)行PCR，并檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在第四方面，本發(fā)明提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的本發(fā)明第一方面所述的引物對。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為22-27bp；優(yōu)選27和22bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58-60℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有探針。在優(yōu)選的實施方式中，所述探針如SEQIDNO:4所示。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有標(biāo)準(zhǔn)品對照。在第五方面，本發(fā)明提供一種PCR方法，包括步驟：在一PCR檢測體系中，利用本發(fā)明第一方面所述的引物對擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為22-27bp；優(yōu)選27和22bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58-60℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的引物對或本發(fā)明第二方面所述的檢測試劑的用途，用于檢測待測對象中是否存在Vero細(xì)胞DNA。在優(yōu)選的實施方式中，所述待測對象是疫苗制品。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了Vero細(xì)胞基因組序列的Blast分析。圖2顯示了參考品的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖3顯示了參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖4顯示了以水作為對照的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖5顯示了以水作為對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖6顯示了大腸桿菌DNA干擾實驗的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖7顯示了大腸桿菌DNA干擾實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖8顯示了CHODNA干擾實驗的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖9顯示了CHODNA干擾實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖10顯示了人DNA干擾實驗的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖11顯示了人DNA干擾實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:2和3所示。圖12顯示了人基因干擾實驗的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:6和7所示。圖13顯示了人基因干擾實驗的解離曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:6和7所示。圖14顯示了人基因干擾實驗的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:9和10所示。圖15顯示了人基因干擾實驗的解離曲線，其中利用的引物對如SEQIDNO:9和10所示。具體實施方式經(jīng)過深入而廣泛的研究，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)針對Vero細(xì)胞基因組DNA的SEQIDNO:1所示序列設(shè)計的引物，不僅能夠高度靈敏地檢測Vero細(xì)胞基因組DNA，還能區(qū)分CHO細(xì)胞、大腸桿菌細(xì)胞，特別是人的干擾性DNA；從而獲得兼具靈敏度和特異性的檢測Vero細(xì)胞基因組DNA的引物對以及檢測方法。本發(fā)明方法操作簡便快捷、特異性和靈敏性高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的引物對本文所用的術(shù)語“引物”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義。本發(fā)明的Vero細(xì)胞基因組DNA特異性引物不是針對外源基因本身或病毒載體本身設(shè)計，而是針對Vero細(xì)胞基因組DNA的SEQIDNO:1所示序列設(shè)計的。換言之，本發(fā)明的引物可以特異性結(jié)合于Vero細(xì)胞基因組DNA上的SEQIDNO:1所示序列。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，針對SEQIDNO:1所示序列可以設(shè)計多種引物對。因此，本發(fā)明的引物對不限于實施例中具體得到的引物對。在具體的實施方式中，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第15-41位；反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第92-113位，并且所述引物對所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為95-105bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為22-27bp；優(yōu)選27和22bp。在優(yōu)選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58-60℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值≤2℃。在最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示。探針本文所用的術(shù)語“引物”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義，即，一小段單鏈DNA或者RNA片段，用于檢測與其互補(bǔ)的核酸序列。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在知曉引物對的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)正向引物和反向引物結(jié)合位點(diǎn)之間的模板序列自主設(shè)計探針，并檢測該探針與引物對的技術(shù)效果。在具體的實施方式中， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要具體設(shè)計探針，所述探針可以處于液相中，也可以固定于固相上；可以在擴(kuò)增前結(jié)合，也可以在擴(kuò)增后結(jié)合。因此，本發(fā)明的探針并不限于實施例中具體公開的探針。本發(fā)明的引物對也不限于與實施例中具體公開的探針配對使用。在具體的實施方式中，本發(fā)明的探針如SEQIDNO:4所示。本發(fā)明的檢測試劑本發(fā)明還提供一種檢測Vero細(xì)胞基因組DNA的檢測試劑，所述檢測試劑包含本發(fā)明的引物對以及探針等實施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。在具體的實施方式中，本發(fā)明的檢測試劑包含SEQIDNO:2所示正向引物、SEQIDNO:3所示反向引物、SEQIDNO:4所示探針。在具體的實施方式中，本發(fā)明檢測試劑的檢測靈敏度達(dá)到0.1fg/μL。在本發(fā)明的引物對或檢測試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測Vero細(xì)胞基因組DNA的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明的引物對或檢測試劑，對待測樣品進(jìn)行PCR，并檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本發(fā)明引物對。在具體的實施方式中，本發(fā)明的PCR試劑盒還裝有用于實施PCR的其它所需成分以及使用該試劑盒作PCR檢測的使用說明書。在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒中還裝有標(biāo)準(zhǔn)品對照。在本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的引物對擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物的PCR方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括:1.本發(fā)明的引物對或檢測試劑能夠高度靈敏地檢測Vero細(xì)胞基因組DNA；2.本發(fā)明的引物對或檢測試劑能夠區(qū)分CHO細(xì)胞、大腸桿菌，特別是人類干擾性DNA；3.本發(fā)明的檢測方法操作簡便快捷、特異性和靈敏性高。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料與方法1.DNA檢測體系：2xTaqmanmix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本發(fā)明引物及探針等成分。摻加標(biāo)準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控，DNA稀釋液2.檢測儀器：ABI7500。3.檢測過程準(zhǔn)備工作：將購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院的VERO細(xì)胞用takara基因提取試劑盒提取DNA，制成VERO基因組DNA(10ng/μL)做為參考品。用DNA稀釋液將VERO基因組DNA參考品梯度稀釋成以下7個濃度梯度，分別為100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL，0.1fg/μL。NTC為無樣本陰性質(zhì)控(超純水)。檢測體系：20μLTaqmanmix+10μL樣品＝30μL檢測程序：實時熒光定量PCR反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性10min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。實施例1.本發(fā)明引物對的設(shè)計及其靈敏度檢驗發(fā)明人根據(jù)SEQIDNO:1所示序列，設(shè)計了以下引物對和探針：正向引物：CTGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTC(SEQIDNO:2)；反向引物：AAATATCCCTTTGCCAATTCCA(SEQIDNO:3)；探針：CCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAG(SEQIDNO:4)；擴(kuò)增產(chǎn)物：CTGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAGTTACATCTTTCCCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGTGGAATTGGCAAAGGGATATTT(SEQIDNO:5)。發(fā)明人通過QPCR實驗檢驗了上述引物對的性能，其中，QPCR體系為：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探針+10μLDNA；QPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為：VeroDNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL。實驗結(jié)果如圖2和圖3所示。其中圖2是參考品擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長期。圖3是參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可知，當(dāng)參考品濃度為100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL時，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.24，相關(guān)系數(shù)(R2)＝0.999，擴(kuò)增效率為103.4％。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢測靈敏度可達(dá)到0.1fg/μl。實施例2.本發(fā)明引物對的特異性檢驗抗干擾實驗：步驟：用DNA稀釋液將VeroDNA梯度稀釋成濃度為200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL六個濃度梯度。將大腸桿菌/CHO/人三種 干擾DNA稀釋成濃度為2ng/μL；其中，大腸桿菌DNA來源于中國食品藥品檢定研究院；CHODNA來源于中國食品藥品檢定研究院；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，用takara基因提取試劑盒提取。QPCR體系：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探針+5μLVeroDNA+5μLH2O/大腸桿菌/CHO/人DNA實驗結(jié)果如下表所示：DNAR2SlopeEVero+H2O0.999-3.55491％Vero+大腸桿菌0.999-3.58790％Vero+CHO0.999-3.57290％Vero+人0.999-3.56291％實驗結(jié)果如圖4-圖11所示。從產(chǎn)生的曲線可以看出，大腸桿菌/CHO/人DNA污染對本發(fā)明的SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示引物對的檢測結(jié)果明顯沒有造成影響。該引物對具備優(yōu)異的特異性。對比例1.根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，胡廣宏等(SYBR-Green實時定量PCR用于Vero宿主細(xì)胞DNA殘留量的檢測，中國新藥雜志，2012年，第21卷，第10期)所述制備以下引物對和探針：正向引物：TGTCACAGAGTTACATCTTTCCC(SEQIDNO:6)反向引物：TTTCACCATAGCCATCTAAGAGG(SEQIDNO:7)擴(kuò)增片段：TCTCACAGAGTTACATCTTTCCCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGTGGAATTGGCAAAGGGATATTTGGAAGCCCATAGAGGGCTATGGTGAAA(SEQIDNO:8)利用以上引物對和4種人細(xì)胞來源的人基因組：HCC827、A549、T24、Hela為模板，進(jìn)行抗干擾實驗驗證；其中，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827、人肺癌細(xì)胞A549、人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞T24、人宮頸癌細(xì)胞Hela均來源中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，用takara基因提取試劑盒提取。檢驗結(jié)果如圖12-13所示，人的基因?qū)υ撘飳Ξa(chǎn)生了明顯的干擾。此外，根據(jù)該文獻(xiàn)本身所述，使用Vero細(xì)胞基因組DNA作為檢測標(biāo)準(zhǔn)品，其檢測靈敏度和0.03pg/L(即，30fg/μl)。因此，該現(xiàn)有技術(shù)的引物對的靈敏度和特異性均無法令人滿意。對比例2.根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，曹守春等(Vero細(xì)胞LTR基因的克隆及其DNA定量PCR檢測方法的建立，中國生物制品學(xué)雜志，2011年，第24卷，第5期)所述制備以下引物對和探針：正向引物：TGCTCTGTGTTCTGTTAATTCA(SEQIDNO:9)反向引物：TCCCTTTGCCAATTCCACAAGAA(SEQIDNO:10)探針：CAAGAAGCCTTTCGCTAAG(SEQIDNO:11)擴(kuò)增片段：TGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAGTTACATCTTTCCCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGTGGAATTGGCAAAGGGA(SEQIDNO:12)利用以上引物對和4種人細(xì)胞來源的人基因組：HCC827、A549、T24、Hela為模板，進(jìn)行抗干擾實驗驗證；其中，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827、人肺癌細(xì)胞A549、人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞T24、人宮頸癌細(xì)胞Hela均來源中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，用takara基因提取試劑盒提取。檢驗結(jié)果如圖14-15所示，人的基因?qū)ΜF(xiàn)有技術(shù)的引物對產(chǎn)生了明顯的干擾。本對比例的結(jié)果，從而證實了文獻(xiàn)(曹守春等，Vero細(xì)胞LTR基因的克隆及其DNA定量PCR檢測方法的建立，中國生物制品學(xué)雜志，2011年，第24卷，第5期)的結(jié)論，即，其引物對經(jīng)特異性驗證結(jié)果顯示，僅人二倍體細(xì)胞(MRC-5) DNA有明顯擴(kuò)增曲線，分析其原因主要是人二倍體細(xì)胞來源于人類，而人類亦有相似的LTR，因此出現(xiàn)交叉現(xiàn)象。綜上所述，對比例的結(jié)果證明現(xiàn)有技術(shù)中根據(jù)該LTR設(shè)計的引物對往往無法具備優(yōu)異的特異性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3