本發(fā)明涉及一種與小麥株高主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物。據(jù)中國糧油信息網(wǎng)報道，2013年-2014年全國小麥供給約2208億斤，需求約2328億斤，年度缺口約120億斤，國內(nèi)小麥供需仍處于緊平衡并略有缺口狀態(tài)。我國新的糧食安全戰(zhàn)略目標(biāo)是確保水稻、小麥、玉米三大主糧自給率保持在95％以上，其中水稻、小麥兩大口糧保持100％自給。隨著人口不斷增加和耕地面積的減少，進(jìn)一步提高我國小麥單產(chǎn)對于對保障國家糧食安全具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)現(xiàn)和利用產(chǎn)量相關(guān)的關(guān)鍵基因，對挖掘小麥產(chǎn)量遺傳潛力，提高小麥單產(chǎn)起著重要作用。例如，“綠色革命”中半矮稈品種的培育使小麥等作物產(chǎn)量得到了大幅度提高。小麥矮稈基因Rht1的克隆及功能研究說明，一個或少數(shù)基因就有可能導(dǎo)致一次產(chǎn)量育種的重大突破。最新研究表明，Rht1基因在降低株高的同時，也導(dǎo)致粒重顯著降低。因此，要打破現(xiàn)有高產(chǎn)品種的單產(chǎn)水平，需要利用新的矮稈基因，相關(guān)基因的定位和克隆也是小麥株高性狀改良的重要基礎(chǔ)。

國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)利用不同的遺傳背景及不同環(huán)境條件對株高QTL進(jìn)行了定位分析研究。Ellis等(2005)定位了許多能降低株高但不影響早期生長的基因。Keller等(1999)利用普通小麥Forno和斯卑爾脫小麥Oberkulmer的重組自交系群體，在三個環(huán)境中檢測到分布于9條染色體上的11個QTLs，單個QTL可解釋表型變異的7.9％-31.4％，全部QTLs可解釋72.6％的表型變異。劉冬成等(2003)利用ND3338×F390的F_2:3家系在4個環(huán)境條件下定位了7個與小麥株高相關(guān)的QTL，單個QTL可解釋表型變異的5.2％-37.2％，所有的QTL可解釋表型變異的64.8％-75.0％。Wang等(2009)利用Heshangmai×Yu8679的RIL群體檢測到6個株高QTL，分別位于1D、2D、3D和4D染色體上，單個QTL可解釋表型變異的5.83％-25.24％。

分子標(biāo)記的開發(fā)利用及分子標(biāo)記技術(shù)的日趨成熟和完善，進(jìn)一步為小麥數(shù)量性狀基因的定位研究提供了有利工具。Cadalen等(1998)利用Courtot與中國春雜交產(chǎn)生的DH群體定位了9個與小麥株高相關(guān)的QTL，其中有2個RFLP標(biāo)記Xfba1-4B、Xfba211-4D分別與矮稈基因Rht1、Rht2連鎖。石濤等(2008)通過BSA法，利用F₂分離群體篩選到2A染色體上的2個SSR標(biāo)記wmc522和wmc198與矮稈基因連鎖。

20世紀(jì)60年代以來，小麥矮稈基因研究取得較大進(jìn)展，矮稈和半矮稈小麥品種的 育成和推廣對全世界小麥產(chǎn)量的提高起了關(guān)鍵作用。截至目前，已命名了25個與株高相關(guān)的Rht(reduced height)基因，其中11個來自于自然突變，另外的14個來自于物理化學(xué)誘變(李杏普等，2010)(如表1所示)。近年來，隨著小麥基因組數(shù)據(jù)平臺和高通量測序技術(shù)的日益成熟和完善，關(guān)于矮桿基因的定位和克隆的研究也比較多。例如，Pearce等(2011)通過對Rht1基因的不同拷貝進(jìn)行分析，闡明了相同基因的不同拷貝間因序列差異而產(chǎn)生不同表型的分子基礎(chǔ)。Gasperini等(2012)利用Cappelle-Desprez和Cappelle-Desprez的2D染色體片段代換系，對Rht8基因進(jìn)行了精細(xì)定位，將Rht8定位在1.29cM的區(qū)間內(nèi)并認(rèn)為該基因降低株高可能與油菜素內(nèi)酯有關(guān)。

表1 部分小麥矮桿基因的名稱、染色體位置和來源

矮桿基因的發(fā)現(xiàn)和利用最早始于19世紀(jì)日本的地方品種赤小麥(Akagomugi)和達(dá)摩(Daruma)。1916年，育種家Strampelli利用赤小麥參加雜交在意大利育成矮桿小麥品種矮粒多(趙洪璋等，1991)。1935年，日本從達(dá)摩矮源的雜交后代中育成了著名的農(nóng)林10號。之后，美國于20世紀(jì)40年代引進(jìn)農(nóng)林10號育成了高產(chǎn)品種Gaines和Nugains；20世紀(jì)70年代，英國J.A.Report利用農(nóng)林10號的衍生系育成了最早的高產(chǎn)品種Maris Fundin和Hobbit。1962年，世界玉米小麥改良中心利用農(nóng)林10號育成了豐產(chǎn)性強、適應(yīng)性廣、株高65cm-85cm、葉片直立的墨西哥小麥Pitic62、Penjamo62等第一批矮桿春小麥，在中美、中東、南亞、南美、北非等地廣為種植。1964年利用智利小麥沃格爾系的衍生后代，1974年育成了半矮稈冬小麥品種Fundin，隨后又育成Hobbit、Norman、Avelon等半矮稈高產(chǎn)品種，推廣面積達(dá)4000萬hm²以上。

我國在小麥的育種中也利用了小麥的矮桿基因，但是矮桿基因來源比較單一。楊松杰等(2006)對中國主要麥區(qū)的239份品種的矮桿基因頻率分析結(jié)果表明，中國小麥品種或品系攜帶的Rht-B1b矮稈基因來自St2422/464和農(nóng)林10號，Rht-D1b矮稈基因來自農(nóng)林10號、水源86、輝縣紅和蚰包麥。我國生產(chǎn)上利用的矮源研究較多的是Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8，不同麥區(qū)3個矮稈基因的分布頻率大小不同(張曉科等，2007)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種成套DNA分子，由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子組成；

所述SEQ ID No.1所示的DNA分子和所述SEQ ID No.2所示的DNA分子可以獨立包裝，也可以混合包裝；

所述成套DNA分子用于鑒定或輔助鑒定小麥株高性狀。

鑒定或輔助鑒定小麥株高性狀的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟：以京冬6號小麥的基因組DNA為模板，以所述的成套DNA分子為引物進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將其記作PCR擴增產(chǎn)物A；以待測小麥的基因組DNA為模板，以所述的成套DNA分子為引物進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將其記作PCR擴增產(chǎn)物K；所述PCR擴增產(chǎn)物A由大小為Nbp的DNA分子和378bp的DNA分子組成，如果所述PCR擴增產(chǎn)物K也由所述大小為Nbp的DNA分子和所述378bp的DNA分子組成，則所述待測小麥為基因型為A的待測小麥，如果所述PCR擴增產(chǎn)物K不由所述大小為Nbp的DNA分子和所述378bp的DNA分子組成，則所述待測小麥為基因型為非A的待測小麥，所述基因型為A的待測小麥的株高低于或候選低于基因型為非A的待測小麥；

所述N大于378；

所述基因型為非A的待測小麥可以為如下待測小麥：以農(nóng)大3338的基因組DNA為模板，以所述的成套DNA分子為引物進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將其記作PCR擴增產(chǎn)物B；所述PCR擴增產(chǎn)物B由所述大小為Nbp的DNA分子和360bp的DNA分子組成，如果所述PCR擴增產(chǎn)物K也由所述大小為Nbp的DNA分子和所述360bp的DNA分子組成，則所述待測小麥為基因型為非A的待測小麥。

鑒定或輔助鑒定小麥株高的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含所述的成套DNA分子；

該試劑盒還包含記載在可讀載體上的使用說明，說明中記載上述方法。

上述成套DNA分子或上述試劑盒在制備與小麥株高性狀相關(guān)的SSR分子標(biāo)記中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述成套DNA分子、上述方法和/或上述試劑盒在小麥選育中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍；

所述小麥選育是根據(jù)上述方法選擇基因型為A的小麥進(jìn)行育種。

上述方法中所述待測小麥為周8425B、鄭育麥9987、核生2號、矮抗58、鄭麥7698、魯麥22、平原50、SNO55849、泰農(nóng)2987、泰山24、泰山4606、煙農(nóng)24、存麥8號、德宏福麥6號、德宏福麥7號、泛麥8號、華培8號、華育116、冀麥325、浚2016、蘭考198、平安8號、平安9號、濮麥9號、齊麥2號、神麥1號、天民198、天民298、溫9519、溫9629、西農(nóng)979、新麥9號、徐麥0054、徐科316、預(yù)麥49-198、預(yù)展4號、中鑒49、中育113、周麥17、蘭考926、洛旱7號、長4738、晉47、遠(yuǎn)旱805、邯7086、衡4332、衡觀35、衡觀216、中麥629、DI4、鄂麥14、Hubel、金豐7183、濟麥22、開麥21、科遺5214、良星99、農(nóng)大212、農(nóng)大3634、泉麥890、許科718、新麥20、許農(nóng)5號、西農(nóng)94、育德1號、宜麥8號、藏1817、藏1863、豫麥57、法國1、法國2和法國3中的至少一種。

本發(fā)明在小麥株高性狀的分子標(biāo)記輔助育種中具有重要應(yīng)用。

附圖說明

圖1為小麥株高主效QTL QPh-5A.1區(qū)間與水稻、短柄草的同源性關(guān)系比對結(jié)果。

圖2為AL-14、AL-24、AL-31和AL-193共4個SSR分子標(biāo)記在親本農(nóng)大3338和京冬6號中的擴增帶型。

圖3為小麥株高主效QTL QPh-5A.1區(qū)間的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。

圖4為新開發(fā)的SSR標(biāo)記AL-14在部分小麥不同材料中的擴增帶型。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

小麥農(nóng)大3338和小麥京冬6號均在文獻(xiàn)“逯臘虎,魏強,王飛等.普通小麥農(nóng)大3338×京冬6號DH系群體株高及節(jié)間長度的QTL分析.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,19(1):1-8.”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

周8425B、鄭育麥9987、核生2號、矮抗58、鄭麥7698、魯麥22、平原50、SNO55849、泰農(nóng)2987、泰山24、泰山4606、煙農(nóng)24、存麥8號、德宏福麥6號、德宏福麥7號、泛麥8號、華培8號、華育116、冀麥325、浚2016、蘭考198、平安8號、平安9號、濮麥9號、齊麥2號、神麥1號、天民198、天民298、溫9519、溫9629、西農(nóng)979、新麥9號、徐麥0054、徐科316、預(yù)麥49-198、預(yù)展4號、中鑒49、中育113、周麥17、蘭考926、洛旱7號、長4738、晉47、遠(yuǎn)旱805、邯7086、衡4332、衡觀35、衡觀216、中麥629、DI4、鄂麥14、Hubel、金豐7183、濟麥22、開麥21、科遺5214、良星99、農(nóng)大212、農(nóng)大3634、泉麥890、許科718、新麥20、許農(nóng)5號、西 農(nóng)94、育德1號、宜麥8號、藏1817、藏1863、豫麥57及3份法國小麥材料法國1、法國2和法國3為目前國內(nèi)廣泛推廣的小麥品種，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

下述實施例中的株高QTL QPh-5A.1為降低株高的主效QTL。

實施例1、SSR分子標(biāo)記AL-14的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用

一、QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)SSR分子標(biāo)記的篩選

前期初定位結(jié)果中，小麥5A染色體上的株高QTL QPh-5A.1的加性效應(yīng)為2.46cm-4.73cm，可解釋株高變異的2.75％-11.87％，該QTL位于兩個SNP標(biāo)記BS00021805_51和BS00010698_51之間且該區(qū)間內(nèi)暫無其他標(biāo)記的報道。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明針對目標(biāo)區(qū)間BS00021805_51-BS00010698_51，繼續(xù)開發(fā)新的分子標(biāo)記，以期為該株高QTL QPh-5A.1的精細(xì)定位及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

根據(jù)國際小麥基因組測序協(xié)會(http://www.wheatgenome.org/)發(fā)布的genome zipper，進(jìn)行株高主效QTL QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)小麥與水稻、短柄草的染色體共線性關(guān)系比對(如圖1所示)。根據(jù)同源性關(guān)系比對結(jié)果，利用該區(qū)間內(nèi)所包含的水稻基因序列，從小麥基因組測序協(xié)會數(shù)據(jù)庫中提取獲得小麥株高主效QTL QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)的基因組序列。在此基礎(chǔ)上，借助primer3.0進(jìn)行目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的引物設(shè)計。分別提取兩個親本農(nóng)大3338和京冬6號的幼嫩葉片的基因組DNA并以此為模板，利用設(shè)計的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，并將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測及小群體驗證，最終獲得QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)多態(tài)性明顯且?guī)颓逦?個SSR分子標(biāo)記AL-14、AL-24、AL-31和AL-193。

AL-14、AL-24、AL-31和AL-193共4個SSR分子標(biāo)記在親本農(nóng)大3338和京冬6號中的擴增帶型如圖2所示。

二、QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)的連鎖圖譜構(gòu)建

以農(nóng)大3338為母本，以京冬6號為父本雜交得到F₁并對F₁代植株進(jìn)行花藥培養(yǎng)再加倍后，自交多代，獲得由203個植株組成的DH群體。提取DH群體、京冬6號及農(nóng)大3338的基因組DNA,分別以其為模板,利用QPh-5A.1區(qū)間兩端的SNP標(biāo)記BS00021805_51和BS00010698_51及步驟一獲得的4個多態(tài)性SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，并將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測各分子標(biāo)記的擴增帶型，將DH群體單株的擴增帶型與京冬6號、農(nóng)大3338的擴增帶型進(jìn)行比較。其中帶型與親本京冬6號相同的記為A，與親本農(nóng)大3338相同的記為B，缺失記為“-”。在此基礎(chǔ)上，借助JoinMap4.0進(jìn)行QPh-5A.1區(qū)間內(nèi)的遺傳圖譜構(gòu)建，其中“A” 記為2，“B”記為0，“-”記為-1。利用Kosambi函數(shù)，獲得6個分子標(biāo)記在目標(biāo)區(qū)段上的最優(yōu)順序及標(biāo)記間新的遺傳距離即目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的遺傳連鎖圖譜，如圖3所示，圖3中，左側(cè)數(shù)字表示各分子標(biāo)記間的相對遺傳距離，單位為cM。

圖3表明，AL-14、AL-31和AL-193共3個SSR分子標(biāo)記被加密到目標(biāo)區(qū)間BS00021805_51-BS00010698_51內(nèi)且AL-14與頂端標(biāo)記BS00021805_51連鎖最緊密，其間的遺傳距離僅為0.63cM，而AL-24位于區(qū)間頂端SNP分子標(biāo)記BS00021805_51上僅0.66cM處，可視為與目標(biāo)QTL連鎖的分子標(biāo)記。

SSR分子標(biāo)記AL-14的引物、退火溫度如表2所示。

表2 SSR分子標(biāo)記AL-14的引物、退火溫度(Tm)

三、不同小麥材料中株高主效QTL QPh-5A.1的檢測

提取農(nóng)大3338、京冬6號、國內(nèi)目前廣泛推廣的小麥品種中的69份小麥材料：周8425B、鄭育麥9987、核生2號、矮抗58、鄭麥7698、魯麥22、平原50、SNO55849、泰農(nóng)2987、泰山24、泰山4606、煙農(nóng)24、存麥8號、德宏福麥6號、德宏福麥7號、泛麥8號、華培8號、華育116、冀麥325、浚2016、蘭考198、平安8號、平安9號、濮麥9號、齊麥2號、神麥1號、天民198、天民298、溫9519、溫9629、西農(nóng)979、新麥9號、徐麥0054、徐科316、預(yù)麥49-198、預(yù)展4號、中鑒49、中育113、周麥17、蘭考926、洛旱7號、長4738、晉47、遠(yuǎn)旱805、邯7086、衡4332、衡觀35、衡觀216、中麥629、DI4、鄂麥14、Hubel、金豐7183、濟麥22、開麥21、科遺5214、良星99、農(nóng)大212、農(nóng)大3634、泉麥890、許科718、新麥20、許農(nóng)5號、西農(nóng)94、育德1號、宜麥8號、藏1817、藏1863、豫麥57及3份法國小麥材料法國1、法國2和法國3的基因組DNA，并分別以各小麥的基因組DNA為模板，利用新開發(fā)的與目標(biāo)QTL QPh-5A.1連鎖最緊密的SSR分子標(biāo)記AL-14的引物對(即表2所示的AL-14的正向引物和反向引物)進(jìn)行PCR擴增，得到各PCR擴增產(chǎn)物，并將各PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測SSR分子標(biāo)記AL-14在不同小麥材料中的擴增帶型。SSR分子標(biāo)記AL-14在部分小麥材料中的擴增結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行待測小麥基因型的判斷：將以農(nóng)大3338的基因組DNA為模板，以表2所示的AL-14的正向引物(SEQ ID No.1)和反向引物(SEQ ID No.2)為引物進(jìn)行PCR擴增得到的PCR擴增產(chǎn)物記作PCR擴增產(chǎn)物B；將以京冬6號的基因組DNA 為模板，以表2所示的AL-14的正向引物(SEQ ID No.1)和反向引物(SEQ ID No.2)為引物進(jìn)行PCR擴增得到的PCR擴增產(chǎn)物記作PCR擴增產(chǎn)物A；將PCR擴增產(chǎn)物A和PCR擴增產(chǎn)物B進(jìn)行8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，PCR擴增產(chǎn)物A和PCR擴增產(chǎn)物B均由兩條電泳條帶組成，如圖4所示。進(jìn)一步的測序結(jié)果證明，PCR擴增產(chǎn)物A和PCR擴增產(chǎn)物B均由兩條大小不同的DNA分子組成，PCR擴增產(chǎn)物B由大小為Nbp的DNA分子和大小為360bp的DNA分組成，PCR擴增產(chǎn)物A由大小為Nbp的DNA分子和大小為378bp的DNA分子組成，其中N>378,；以待測小麥的基因組DNA為模板，以表2所示的AL-14的正向引物(SEQ ID No.1)和反向引物(SEQ ID No.2)為引物進(jìn)行PCR擴增得到PCR擴增產(chǎn)物，將該PCR擴增產(chǎn)物記作PCR擴增產(chǎn)物K，將PCR擴增產(chǎn)物K的聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型與PCR擴增產(chǎn)物A的同一濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型相同的待測小麥，即PCR擴增產(chǎn)物K由大小為Nbp的DNA分子和大小為378bp的DNA分子組成的待測小麥，記作基因型為A的小麥，將PCR擴增產(chǎn)物K不由大小為Nbp的DNA分子和大小為378bp的DNA分子組成的待測小麥，記作基因型為非A的小麥，其中基因型為非A的小麥可以為聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型與PCR擴增產(chǎn)物B的同一濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳的帶型相同的待測小麥，即PCR擴增產(chǎn)物K由大小為Nbp的DNA分子和大小為360bp的DNA分子組成的待測小麥。以上N均相同。

統(tǒng)計以上除農(nóng)大3338、京冬6號以外的72份不同小麥材料的檢測結(jié)果，如表3所示。

表3表明，對于SSR分子標(biāo)記AL-14，31份小麥材料的PCR擴增產(chǎn)物的電泳帶型與京冬6號相同，基因型均為A，計算其基因型變異頻率為43.06％。由此推測，以上基因型檢測結(jié)果中與京冬6號相同的31份材料中可能含有該株高主效QTL QPh-5A.1，其株高低于或候選低于不含有該株高主效QTL QPh-5A.1的小麥材料。

表3 AL-14在72份不同小麥材料中的基因型變異頻率

本發(fā)明通過同源比對，開發(fā)了與小麥株高主效QTL QPh-5A.1連鎖的4對SSR標(biāo)記AL-14、AL-24、AL-31和AL-19且AL-14與目標(biāo)QTL連鎖最緊密，對目標(biāo)區(qū)間進(jìn)行了加密，為目標(biāo)QTL的精細(xì)定位和克隆提供新的遺傳標(biāo)記。同時，利用AL-14對不同小麥品種中是否含有降低株高的主效QTL QPh-5A.1進(jìn)行檢測，從而快速篩選出具有該株高主效QTL的小麥品種。由此可見，本發(fā)明所提供的SSR標(biāo)記AL-14可用于小麥株高性狀的分子標(biāo)記輔助育種及圖位克隆，大大加快小麥矮桿高產(chǎn)品種的選育進(jìn)程。