本發(fā)明屬于天然核糖核苷酸的用途，涉及環(huán)狀核糖核苷酸MED13L-circRNA的用途，尤其涉及MED13L-circRNA結(jié)直腸癌患者的新的生物標(biāo)記中的用途，用于鑒別結(jié)直腸癌及更不良預(yù)后的對(duì)象。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌又稱大腸癌，是一種常見的惡性腫瘤。結(jié)腸癌在早期并無明顯癥狀，直到發(fā)病中晚期發(fā)現(xiàn)。提高結(jié)直腸癌的早期診斷率對(duì)于及時(shí)治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。如通過在結(jié)直腸癌中出現(xiàn)的MED13L-circRNA所證明的，已知在結(jié)直腸癌組織中有異常的MED13L-circRNA表達(dá)?？紤]到MED13L-circRNA表達(dá)量在結(jié)直腸癌中可升高或降低，因此提供了疾病進(jìn)展的病理學(xué)指征。

circRNA廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和組織特異性表達(dá)等特征。是基因組DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程中，環(huán)化成環(huán)形RNA，的一類非編碼RNA。研究表明，一些circRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)來發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的作用。circRNA利用其microRNA(miRNA)應(yīng)答元件結(jié)合miRNA，以阻斷miRNA對(duì)其靶標(biāo)基因表達(dá)的抑制作用，從而調(diào)控其他相關(guān)mRNA的表達(dá)水平。circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中重要作用的發(fā)現(xiàn)提示circRNA在藥物開發(fā)和疾病診治中具有良好的應(yīng)用前景。

circRNA作為一種調(diào)控性RNA(Regulatory RNA)近幾年成為腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。circRNAs其表達(dá)具備組織特異性。circRNA中既有一部分作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)來發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的作用。Thomas B.Hansen等人通過對(duì)人AGO蛋白和miR-7的分析研究，證明了circRNA作為高效的microRNA海綿的作用。circRNAs在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平差別十分顯著，甚至能達(dá)到數(shù)百甚至數(shù)千倍，這種顯著的差異使得其在成為候選標(biāo)志物上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供環(huán)狀RNA(Circular RNA\circRNA)MED 13L-circRNA在結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物中的應(yīng)用，英文名MED 13L-circRNA，MED 13L-circRNA長11434bp，位于人類的第12條染色體上116668337到116675510，MED13L-circRNA的堿基序列結(jié)構(gòu)，MED13L是該circRNA的覆蓋基因。

本發(fā)明提供了鑒別可能患有結(jié)直腸癌的對(duì)象或結(jié)直腸癌的分期，再或者對(duì)先前經(jīng)鑒別患有結(jié)直腸癌的對(duì)象的預(yù)后進(jìn)行確定的方法及其引物序列結(jié)構(gòu)、PCR產(chǎn)物識(shí)別序列。

所述方法包括檢測(cè)來自所述對(duì)象的樣品中的MED13L-circRNA量，其中較高量的MED13L-circRNA與所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌的可能性增加或者結(jié)直腸癌預(yù)后不佳的可能性增加相關(guān)。

本發(fā)明的有益效果有：1)提出了MED13L-circRNA的用途；2)本發(fā)明的研究表明異常的量的MED13L-circRNA與所述對(duì)象患結(jié)直腸癌的可能性增加或者可能提示結(jié)直腸癌預(yù)后不佳。3)circRNA具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和組織特異性表達(dá)等特征。且circRNA在結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織中表達(dá)量存在差異，因此MED13L-circRNA具有成為結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為MED13L-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的對(duì)比圖。

圖2為使用MED13L-circRNA篩查引物對(duì)病人組織樣品表達(dá)量篩查的結(jié)果圖。

圖3為MED13L-circRNA的簡易結(jié)構(gòu)及引物位置圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。

1)實(shí)驗(yàn)材料：

臨床樣品：16例結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織樣品由301醫(yī)院所提供。

試劑：MED13L-circRNA篩查引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京引物合成部合成；Trizol(貨號(hào)15596-018)購自Invitrogen；氯仿(貨號(hào)20100927)購自北京化工，異丙醇(貨號(hào)1205031)購自西隴化工，乙醇(貨號(hào)101860)購自北化經(jīng)銷；Random primers(貨號(hào)C1181)，M-MLV(貨號(hào)M1705)，Ribonuclease Inhibitor(貨號(hào)2511)，Nuclease-Free Water(貨號(hào)2511)，dNTP mix(貨號(hào)P1195)均購自Promega；Premix Ex TaqTM II(貨號(hào)DRR081A)購自Takara；Mineral oil(貨號(hào)D7295)購自Sigma。

2)實(shí)驗(yàn)方法：

A、結(jié)直腸癌癌變組織/癌旁組織RNA提取

稱取1克組織材料，液氮研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5毫升RNase-free的離心管中，混勻后室溫靜置5分鐘左右。加入200微升的氯仿，混勻。11000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。取上清加入200ul的氯仿抽提，11000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。取上清加入500微升的異丙醇，-20℃沉淀10分鐘。11000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，將沉淀轉(zhuǎn)移至1.5毫升RNase-free離心管中，預(yù)冷的75％乙醇洗滌2遍，晾干，RNase-free水溶解(根據(jù)情況適當(dāng)溶解，一般是20-35微升)。Nanodrop測(cè)算所得粗提液的OD值以及濃度。

B、表達(dá)量篩查

1.cDNA合成

1-2微克RNA到14微升RNase-free水中，再加1微升random primer輕柔混勻后加入0.2mlPCR管中。PCR儀70℃孵育5分鐘。快速放在冰上2分鐘。

配置反應(yīng)混合物：

42℃孵育1小時(shí)，70℃孵育15分鐘，4℃保溫。

2.Real-time PCR

cDNA中加入50ul的ddH₂O。

在冰上制備QPCR混合物：

每管中加入10微升礦物油。離心機(jī)1000轉(zhuǎn)每分鐘離心1分鐘。將樣品放置入QPCR儀中運(yùn)行，程序如下：

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

參見圖1和圖2，圖1為MED13L-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的對(duì)比圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MED13L-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)成功，MED13L-circRNA在結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織中表達(dá)。圖2為使用MED13L-circRNA篩查引物對(duì)病人組織樣品表達(dá)量篩查的結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MED13L-circRNA在結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異較大，癌組織相對(duì)于癌旁組織下調(diào)存在著從0.1905349倍到0.9904351倍的變化其中6/11的病人下調(diào)倍數(shù)在0.5以下；上調(diào)存在1.599753倍到18.333660倍的表達(dá)量變化，其中4/5的病人上調(diào)倍數(shù)在5倍以內(nèi)，1/5的病人上調(diào)在10倍以上。如此大的表達(dá)差異給了MED13L-circRNA作為結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景。