本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與腫瘤用藥選擇和診斷相關(guān)的KRAS基因突變的快速檢測。

背景技術(shù)：

世界衛(wèi)生組織在2014年的世界癌癥日到來之際發(fā)表《世界癌癥報(bào)告》稱，癌癥已經(jīng)成為全世界人類最大致死原因，發(fā)病率和死亡率均呈持續(xù)上升趨勢。全球癌癥發(fā)病率四年中升高11％，到2012年約有1410萬病例，因癌癥死亡人數(shù)高達(dá)820萬。2012年的全球癌癥新病例中有一半發(fā)生在亞洲，其中大部份發(fā)生在中國大陸。并預(yù)測未來20年內(nèi)，世界癌癥病例將增長75％，達(dá)到近2500萬。中國腫瘤登記中心2013年初發(fā)布《2012中國腫瘤登記年報(bào)》顯示，中國每年新發(fā)癌癥病例約達(dá)312萬，死亡病例超過200萬，每分鐘有6個(gè)人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每7到8人中就有一人因癌癥而死。肺癌、胃癌、直腸癌、肝癌、食管癌成為中國人患病最多的癌癥，乳腺癌、結(jié)直腸癌等癌癥患者亦呈明顯上升趨勢。隨著環(huán)境惡化，水質(zhì)污染、霧霾以及食品安全方面形勢的逐步嚴(yán)峻，專家預(yù)測，中國每年的癌癥新發(fā)病例總數(shù)到2020年將達(dá)到400萬左右，每年病例總數(shù)將達(dá)到600萬。

結(jié)直腸癌是世界第三大常見惡性腫瘤，每年導(dǎo)致近60萬人死亡。中國近年來結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率均快速上升，結(jié)直腸癌在腫瘤發(fā)病中排位第三，平均每1.5分鐘就有1人被診斷為結(jié)直腸癌，隨著城市化進(jìn)程和人口老齡化，未來中國結(jié)直腸癌發(fā)病率預(yù)計(jì)還將繼續(xù)升高。

KRAS屬于RAS基因家族(KRAS、NRAS和HRAS)，編碼一種鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白，是配體結(jié)合的表皮生長因子受體(EGFR)的重要效應(yīng)分子，參與細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)，在ras基因中，KRAS對人類癌癥影響最大。KRAS可以通過與其催化亞基直接作用而激活PI3K。KRAS突變也發(fā)生于多種腫瘤細(xì)胞，例如結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、膽管癌，其中20％非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、30-40％結(jié)直腸癌患者中存在KRAS基因突變。而85％-90％的突變發(fā)生在12或13位密碼子，其余的發(fā)生在第61位(5％)及146位(5％)密碼子上。這些突變使得GTP酶失活，導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的KRAS蛋白積聚于活化的GTP結(jié)合構(gòu)象中，KRAS的過度表達(dá)與擴(kuò)增導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖，這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵一步。

西妥昔單抗和帕尼單抗是以EGFR為靶點(diǎn)的治療結(jié)直腸癌的靶向藥物，通過與細(xì)胞外表面EGFR區(qū)域結(jié)合阻斷EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，來抑制細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成。在2008年第44屆美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上，與會專家公布了腫瘤靶向治療的一些最新進(jìn)展，其中 一項(xiàng)重要的結(jié)果就是西妥昔單抗對于k-ras基因“野生型”轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者顯示出卓越的療效。并且k-ras表達(dá)狀況的檢測使結(jié)直腸癌個(gè)體化的靶向治療成為可能。

美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟(NCCN)《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》(V3.2011)明確指出：(1)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測KRAS基因狀態(tài)；(2)只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑(如愛必妥和帕尼單抗)治療；(3)如果KRAS無突變，應(yīng)考慮檢測KRAS基因狀態(tài)。我國衛(wèi)生部頒布的《結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010年版)》也明確指出：確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時(shí)，檢測腫瘤組織KRAS基因狀態(tài)，以確定合適的治療方案。

另外，K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因高度保持一致，而且，KRAS基因狀態(tài)不會因治療而發(fā)生變化。檢測KRAS基因突變是深入了解癌基因的情況、了解各種癌癥的發(fā)展預(yù)后、放化療療效的重要指標(biāo)。

目前腫瘤相關(guān)基因突變檢測方法主要有直接測序法(DNA sequencing)、實(shí)時(shí)熒光定量法(qPCR，包括Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR等)、高分辨率熔解曲線(HRM)、PCR與質(zhì)譜(mass spectrometry)及高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)聯(lián)合檢測法等。腫瘤相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測主要依賴于qPCR及基因芯片技術(shù)。直接測序法一直以來被認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，該法費(fèi)用較低，但操作耗時(shí)長，并且它有兩個(gè)明顯的缺點(diǎn)：一是靈敏度低，一般需要突變基因豐度達(dá)到20％以上才能準(zhǔn)確檢測。二是由于后續(xù)需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，容易出現(xiàn)污染導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR，qPCR)作為新一代分子生物學(xué)研究工具，已成為分子診斷、臨床檢驗(yàn)以及基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究的主流技術(shù)平臺，廣泛應(yīng)用于傳染病、腫瘤、遺傳病、心血管等疾病的分子診斷。腫瘤的異質(zhì)性決定了腫瘤標(biāo)本絕大多數(shù)為混合標(biāo)本，通常情況下，微量突變模板與大量野生型模板存在于同一擴(kuò)增體系中時(shí)，此時(shí)大量野生型模板優(yōu)勢擴(kuò)增，導(dǎo)致微量突變模板的擴(kuò)增受到抑制而檢測不到。因此目前的qPCR和HRM技術(shù)最高也只能檢測到1％的突變體。

隨著近年來腫瘤基因組測序方面研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的癌癥患者的腫瘤組織中都存在某些體細(xì)胞的變異，而這些變異在正常人中檢測不到。有些基因突變不僅僅可以作為癌癥早期檢測的分子指標(biāo)，還可以為分子靶向治療提供用藥指導(dǎo)，如EGFR、KRAS、KRAS基因等。

腫瘤細(xì)胞會向血液中釋放基因組DNA，這些變異DNA也隨之釋放到外周血中，被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circμLating tμMor DNAs)。研究發(fā)現(xiàn)，ctDNAs在早期原位癌(primary cancer)患者血液中就已經(jīng)開始出現(xiàn)。由于外周血循環(huán)DNA的半衰期短，因此循環(huán)腫瘤DNA能夠真實(shí)反映患者病變組織基因突變的真實(shí)情況。

但是，由于外周血循環(huán)DNA含量很少，其中腫瘤特異性的突變DNA含量更是少之又少，尤其是早期癌癥患者，在常規(guī)的核酸擴(kuò)增體系中，微量突變模板與大量野生型模板存在于同一擴(kuò)增體系中時(shí)，大量野生型模板優(yōu)勢擴(kuò)增，導(dǎo)致微量突變模板的擴(kuò)增受到抑制而檢測不到。因此在本領(lǐng)域需要一種可以高效快速準(zhǔn)確全面地檢測出KRAS基因突變的產(chǎn)品及方法，以便及時(shí)準(zhǔn)確地獲得KRAS基因突變的信息。

本發(fā)明擬公開一種人KRAS基因突變檢測試劑盒的制備方法及其應(yīng)用。所述的試劑盒采用新型位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物選擇性放大KRAS基因突變DNA，新型封閉探針封阻野生型KRAS基因模板，進(jìn)一步提高突變模板選擇性放大的特異性。該試劑盒檢測特異性高，靈敏度高，檢測低豐度KRAS突變的敏感性可達(dá)0.01％～0.1％。本檢測試劑盒用于輔助臨床醫(yī)生篩選出病患KRAS基因突變情況，為臨床醫(yī)生用藥提供指導(dǎo)和依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確、高靈敏的KRAS基因突變檢測試劑盒。所述的試劑盒采用新型位點(diǎn)特異性擴(kuò)增引物選擇性放大KRAS基因突變DNA，新型封閉探針封阻野生型KRAS基因模板，進(jìn)一步提高突變模板選擇性放大的特異性。其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在將突變檢測敏感度由目前市場上同類試劑盒檢測KRAS基因突變的1％提高到0.01％～0.1％，檢測特異性高，靈敏度高，可應(yīng)用于除組織標(biāo)本外的血清、血漿等標(biāo)本的非創(chuàng)傷性檢測。

本發(fā)明提供了一套用于檢測KRAS基因突變的引物、探針及檢測試劑盒，發(fā)明相關(guān)內(nèi)容表述如下：

KRAS基因突變檢測試劑盒，包括引物探針混合液(引物2.5μM，熒光探針1μM，封阻探針4μM。含用于突變特異性擴(kuò)增KRAS基因靶向序列的上游突變特異性引物8條，可檢測KRAS基因發(fā)生在第12、13和61號密碼子的8種基因突變，包括G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61，涵蓋了KRAS基因97％以上的突變，下游通用引物1條、野生序列封阻探針2條，TaqMan熒光探針2條)，2×PCR反應(yīng)液(含DNA聚合酶，dNTP，dUTP，UNG酶，Mg²⁺等)，陽性參比品、陰性參比品和無RNA酶和DNA酶的無菌水。

所述的引物包含KRAS基因包括與G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61在內(nèi)的8種基因突變特異的上游突變引物8條、下游通用引物2條。

所述的上游突變引物特征是3’末端為突變堿基。引物的Tm值在40℃～57℃，低于PCR反應(yīng)復(fù)性溫度5℃～10℃，以提高突變檢測的特異性。

上游突變特異性引物：

KF1：5’-acttgtggtagttggagcta-3’ Seq ID No.1

KF2：5’-acttgtggtagttggagctt-3’ Seq ID No.2

KF3：5’-acttgtggtagttggagctc-3’ Seq ID No.3

KF4：5’-ttgtggtagttggagctga-3’ Seq ID No.4

KF5：5’-ttgtggtagttggagctgt-3’ Seq ID No.5

KF6：5’-ttgtggtagttggagctgc-3’ Seq ID No.6

KF7：5’-ggtagttggagctggtga-3’ Seq ID No.7

KF8：5’-cattgcactgtactcctcttt-3’ Seq ID No.8

所述的下游通用引物為KRAS基因第12、13密碼子下游50～500堿基對范圍內(nèi)的一段序列，以及KRAS基因第61密碼子下游50～500堿基對范圍內(nèi)的一段序列，該序列對突變沒有選擇性，可擴(kuò)增所有的KRAS基因。

KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’ Seq ID No.9

KR2：5’-acccacctataatggtgaata-3’ Seq ID No.10

其中，KR1與KF1～KF7配對，KR2與KF8配對。

所述的探針包括封阻探針一條，KRAS基因特異性TaqMan熒光探針2條。

所述的封阻探針與KRAS基因第12、13、61密碼子野生型序列互補(bǔ)，其5’端鎖核酸修飾，提高封阻探針的對Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基團(tuán)修飾，阻斷其3’端延伸功能；突變位點(diǎn)至少1-2個(gè)堿基LNA修飾，提高封阻探針的單堿基識別能力，前面有+的堿基為鎖核酸堿基。

KB1：5’-+gagct+g+gtg+gcgtagg-PO4-3’ Seq ID No.10

KB2：5’-+tactcctctt+ga+cctgctgt-PO4-3’ Seq ID No.12

KRAS基因特異性TaqMan熒光探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

Kp1：5’-ccttgacgatacagctaattc-3’ Seq ID No.13

Kp2：5’-aatatccaagagacaggtttc-3’ Seq ID No.14

所述的2×PCR反應(yīng)液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，100～300μM dATP，100～300μM dCTP，100～300μM dGTP，80～300μM dTTP，40～150μM dUTP，0.25～2UUNG酶，1～4mMMgCl₂等。優(yōu)選的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5UUNG酶，2mM MgCl₂。

所述陽性參比品為KRAS突變陽性序列，可以為純化PCR產(chǎn)物或者嵌入KRAS基因的人工質(zhì)粒。

陰性參比品為KRAS野生型序列，可以為純化PCR產(chǎn)物或者嵌入KRAS基因的人工質(zhì)粒。

本發(fā)明提供了一套KRAS基因突變的檢測方法，具體來說包括以下步驟：

[1]根據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)公布的人類KRAS基因?yàn)橐吧突蛐蛄?，針對KRAS的突變熱點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和探針。

[2]提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、血漿等。

[3]配制實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。

[4]根據(jù)熒光PCR擴(kuò)增儀顯示的Ct值判斷檢測KRAS基因突變情況：Ct值為0或大于35判為陰性：Ct值小于等于35判為陽性。當(dāng)陰性參比品Ct值為0或大于40，陽性參比品Ct值大于24小于27時(shí)結(jié)果可信。

本發(fā)明采用了特異性引物選擇性擴(kuò)增KRAS基因突變序列，用高效封阻探針封閉野生型DNA序列對引物對突變型序列進(jìn)行信號放大時(shí)可能造成的干擾，該方法具有以下優(yōu)勢：

[1]靈敏度高，可以檢出低至5-10拷貝的突變；

[2]特異性強(qiáng)，5～20ng的野生型基因組DNA不會產(chǎn)生非特異性信號；

[3]檢測速度快，檢測過程只需要90分鐘即可完成。

[4]穩(wěn)定率高。通常腫瘤標(biāo)本中突變的DNA模板序列的絕對數(shù)并不高，尤其是外周血循環(huán)血DNA，多數(shù)標(biāo)本處于1％～10％之間，突變檢測敏感度在1％左右的方法常常對其臨界含量，也就是突變含量1％～5％的標(biāo)本檢測穩(wěn)定性不佳。我們的方法可以檢測低至0.01％～0.1％的突變，就大大保證了1％～10％之間標(biāo)本的檢測穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為含封阻探針及不含封阻探針檢測結(jié)果比較。

圖2為KRAS基因突變檢測試劑盒檢測KRAS基因人工質(zhì)粒。

A：DNA終濃度為5×10³拷貝

B：DNA終濃度為5×10⁴拷貝

具體實(shí)施方式

下面用具體的實(shí)施例來解釋本發(fā)明的突出的特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，但本發(fā)明決非僅局限于實(shí)施例。

實(shí)施例1：本發(fā)明提供的試劑盒檢測KRAS基因人工質(zhì)粒

1、人工質(zhì)粒DNA純化

用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)試劑盒純化KRAS野生型和突變型人工質(zhì)粒，方法如下：

取1.5mL菌液，8000rpm離心3min收集菌體，加入將含有RNase A酶的P1緩沖液250μL 混勻，再加入相同體積的P2緩沖液，上下混勻至溶液變清(不要將反應(yīng)時(shí)間超過5min)，加入350μL N3緩沖液，立刻混勻，13000rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至QIAprep spin管中，13000rpm離心1min，棄液體；用0.5mL PB清洗一次，再加含無水乙醇的PE緩沖液0.75mL洗滌2次，將QIAprep spin移至新1.5mL離心管中，加50μL無菌水，靜置1min，離心1min，收集濾液。

純化后的質(zhì)粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)試劑盒定量，用TE緩沖液稀釋到DNA終濃度分別為1×10⁴拷貝copies/μL、1×10³拷貝copies/μL，突變質(zhì)粒含量分別是0.01％、0.1％、1％、10％、100％。2、熒光定量PCR體系的配制

將預(yù)先配置好的2×PCR反應(yīng)液、引物探針混合液及DNA模板按一下配方配置，同時(shí)用不含核酸的TE緩沖液作為陰性對照。：

3、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，隨后94℃15s，60℃20s，共15個(gè)循環(huán)；然后94℃15s，58℃20s檢測FAM熒光信號，共35個(gè)循環(huán)。

圖2是用PCR反應(yīng)結(jié)果，DNA總量為5×10³拷貝可以檢測低至0.1％的突變，DNA總量為5×10⁴拷貝可以檢測低至0.01％的突變。

實(shí)施例2：本發(fā)明提供的試劑盒檢測新鮮組織標(biāo)本

1、組織標(biāo)本中基因組DNA純化

用QIAamp DNA Mini(Qiagen)試劑盒純化新鮮組織標(biāo)本中的基因組DNA，方法如下：

取新鮮組織25mg以內(nèi)用剪刀剪切樣本至小碎片，放在1.5mL離心管中，加入180μL ATL，20μL蛋白酶K，混勻，56℃孵育1～3h至樣本溶解，每小時(shí)振蕩2～3次；加入200μL AL，振蕩15秒，70℃孵育10min；然后加入200μL無水乙醇，振蕩15秒，小心將液體(包括沉淀)移至試劑盒提供柱子中，不要污染管口，8000rpm離心1min后，將柱子新的2mL離心管 中，小心加入500μL AW1緩沖液，8000rpm離心1min，棄濾液；小心加入500μL AW2緩沖液，13000rpm離心3min，柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，全速離心1min，再將柱子轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL離心管中，小心加入200μL AE或蒸餾水，室溫靜置1min，8000rpm離心1min，收集濾液。

純化后的基因組DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)試劑盒定量，DNA濃度在20ng/μL～200ng/μL之間。

2、熒光定量PCR體系的配制

將預(yù)先配置好的2×PCR反應(yīng)液、引物探針混合液及DNA模板按一下配方配置，同時(shí)用不含核酸的TE緩沖液作為陰性對照。：

3、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，隨后94℃15s，60℃20s，共15個(gè)循環(huán)；然后94℃15s，58℃20s檢測FAM熒光信號，共35個(gè)循環(huán)。

下表是試劑盒檢測結(jié)果與DNA測序方法的比較，組織標(biāo)本的試劑盒突變檢出率與DNA測序結(jié)果相同。

實(shí)施例3：本發(fā)明提供的試劑盒檢測血漿標(biāo)本

1、血漿標(biāo)本中基因組DNA純化

收集80份結(jié)直腸癌患者和20份健康對照外周血標(biāo)本5mL，2500rpm離心10分鐘，吸取 上清2mL用于循環(huán)游離DNA純化。

用QIAamp DNA Blood Midi(Qiagen)試劑盒純化血漿標(biāo)本中的循環(huán)游離DNA，方法如下：

2mL血清(或全血)加入200μL PK和2mL AL，徹底混勻15秒，56℃孵育10min；加入2mL無水乙醇，徹底混勻15秒，將液體轉(zhuǎn)移到QIAamp Midi Spin Column中，8000rpm離心2min，棄濾液；再離心一次，將柱子轉(zhuǎn)移到另一收集管中，加入5mL AW1緩沖液，8000rpm離心1min，棄濾液，加入5mL AW2緩沖液，13000rpm離心1min，棄濾液，13000rpm離心3min，將柱子轉(zhuǎn)移到一干凈收集管中，加入100μL AE，室溫放置1min，8000rpm離心1min，收集濾液為DNA標(biāo)本。

純化后的基因組DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)試劑盒定量，DNA濃度在6ng/μL～40ng/μL之間。

2、熒光定量PCR體系的配制

將預(yù)先配置好的2×PCR反應(yīng)液、引物探針混合液及DNA模板按一下配方配置，同時(shí)用不含核酸的TE緩沖液作為陰性對照。：

3、PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，隨后94℃15s，60℃20s，共15個(gè)循環(huán)；然后94℃15s，58℃20s檢測FAM熒光信號，共35個(gè)循環(huán)。

下表是試劑盒檢測結(jié)果與DNA測序方法的比較，癌癥患者中，試劑盒突變檢出率高于DNA測序；正常人中沒有檢出突變，試劑盒與DNA測序結(jié)果相同。