本發(fā)明屬于水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠nNOS基因在抗干旱和抗鹽轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一氧化氮是一種重要的氣體分子，在植物生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)的各個階段都發(fā)揮了重要作用。很多研究利用NO的外源釋放劑提高植物的NO含量或者利用NO的清除劑降低植物體內(nèi)的NO含量，證明了NO在植物的生長發(fā)育如根的發(fā)育，開花，衰老以及逆境脅迫如生物脅迫，非生物脅迫如干旱、鹽、冷以及重金屬脅迫過程中起到了非常重要的調(diào)控作用。NO在環(huán)境脅迫和生長中的廣泛作用暗示其在基因工程的遺傳育種培養(yǎng)高抗高產(chǎn)的作物品種可能具有重要的應(yīng)用價值。目前，高等植物中的NO合成酶尚未發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將哺乳動物中小鼠的神經(jīng)元NO合成酶基因nNOS轉(zhuǎn)化到植物中將可以獲得內(nèi)源NOS活性提高、NO含量提高的轉(zhuǎn)基因植株，對于NO的功能研究以及遺傳育種都具有重要意義。

干旱和鹽脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的兩個重要環(huán)境因素，全世界每年因為干旱和鹽脅迫導(dǎo)致的糧食減產(chǎn)產(chǎn)生的經(jīng)濟損失達到幾百億美元，水稻是亞洲尤其是中國最重要的糧食作物，因此培育優(yōu)良的具有抗干旱和鹽脅迫的水稻品種具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠nNOS基因在抗干旱和抗鹽轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明為NO在水稻中的研究提供新的材料，為實施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種培育耐干旱和鹽脅迫的植物的方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建小鼠nNOS蛋白的植物轉(zhuǎn)化過表達載體；(2)將所述載體導(dǎo)入到所需培育的植物中。

所述的小鼠nNOS蛋白優(yōu)選為如下(1)或(2)：

(1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列所組成的蛋白；

(2)將SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸的取代或添加或缺失且與植物耐干旱和鹽脅迫相關(guān)的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白質(zhì)。

所述的小鼠nNOS蛋白編碼的基因優(yōu)選為如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼耐受干旱和鹽脅迫相關(guān)蛋白的 DNA分子；

(3)與(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼耐受干旱和鹽脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。

所述的植物優(yōu)選為水稻。

一種小鼠nNOS蛋白或其編碼基因在培育耐干旱和鹽脅迫的水稻中的應(yīng)用。

一種NO合成酶或其編碼基因在培育耐干旱和鹽脅迫的水稻中的應(yīng)用。

一種NO合成酶或其編碼基因在培育耐干旱和鹽脅迫的植物中的應(yīng)用。

一種NO合成酶或其編碼基因在植物育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過將小鼠中的神經(jīng)元一氧化氮合成酶基因nNOS導(dǎo)入到水稻中，獲得新的抗旱、抗鹽能力明顯提高的轉(zhuǎn)基因水稻。本發(fā)明利用該基因轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對多種非生物脅迫(干旱和高鹽)具有抗性，從而實現(xiàn)一個基因提高多種抗性。本發(fā)明為植物抗逆基因工程提供了重要的基因資源，以為實施綠色農(nóng)業(yè)提供新的遺傳資源。

附圖說明

圖1是nNOS基因轉(zhuǎn)化水稻再生植株的PCR鑒定示意圖。圖中所用Marker為天根DNA MarkerⅢ，對應(yīng)最亮條帶為1.2kb；1-31為陽性株系擴增片段大小約為750bp；WT為野生型中花11。

圖2是T3代3個陽性轉(zhuǎn)基因植株中nNOS基因半定量PCR結(jié)果圖。

圖3是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻與野生型(WT)植株NOS酶活測定結(jié)果圖。

圖4是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻與野生型植株葉片中NO DAF-FM DA染色圖。

圖5是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻與野生型植株葉片中NO DAF-FM DA染色統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖6是自由基測定的nNOS轉(zhuǎn)基因水稻與野生型NO含量的結(jié)果圖。

圖7是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇以及正常(對照)的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的狀況圖。

圖8是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻和野生型幼苗在含有200mM NaCl以及正常的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的狀況圖。

圖9是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇或200mM NaCl以及正常的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的相對鮮重的統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖10是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻和野生型幼苗在含有200mM甘露醇或200mM NaCl以及正常的1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的相對株高的統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖11是水稻轉(zhuǎn)基因植株和野生型控水(干旱處理)14天、復(fù)水7天后的表型圖。

圖12是水稻轉(zhuǎn)基因植株和野生型控水14天、復(fù)水7天后存活率的統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖13是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻T3代三個株系和野生型離體葉片失水率的統(tǒng)計結(jié)果圖。

圖14是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻T3代三個株系和野生型在干旱和高鹽處理后2天前后相對電導(dǎo)率的檢測結(jié)果，處理前為對照。

圖15是nNOS轉(zhuǎn)基因水稻T3代三個株系和野生型在干旱和高鹽處理2天前后MDA含量統(tǒng)計結(jié)果圖，處理前為對照。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施對本發(fā)明做出詳細(xì)的描述。下述實施例中的具體實施方式中沒有特別說明的實驗方法，均為常規(guī)實驗方法。下述實施例中的實驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑公司購得。以下實施例中的定量實驗，均為三次重復(fù)實驗平均結(jié)果。

實施例1nNOS基因分離克隆

構(gòu)建有nNOS基因CDS序列全長的nNOSPCW質(zhì)粒(Roman,L.J.,Sheta,E.A.,Martasek,P.,Gross,S.S.,Liu,Q.and Masters,B.S.S.(1995)High-level expression of functional rat neuronal nitric oxide synthase in Escherichia coli.Proc.Natl Acad.Sci.USA92:8428–8432.)，通過NdeI、XbaI雙酶切將nNOS基因CDS全長剪切下來。nNOS基因CDS全長的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，nNOS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，雙酶切體系100μL：PCW質(zhì)粒85μL，10×buffer 10μL，NdeI、XbaI限制性內(nèi)切酶各2.5μL。37℃水浴鍋酶切30min后瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(購自O(shè)mega公司，美國)回收特異帶約4.4kb的nNOS DNA片段(提取步驟參照使用說明)。

實施例2植物轉(zhuǎn)化超表達載體構(gòu)建

將實施例1回收純化的nNOS DNA片段用DNA Polymerase I(Klenow NEB)補平，然后連入SmaI酶切去磷酸化處理的PUbiO載體。連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定得到正向陽性克隆，測序驗證為正確的nNOS基因序列，沒有移碼，即Pubio-nNOS重組載體構(gòu)建成功。將重組載體Pubio-nNOS轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105中并保存菌株。

PUbiO載體的構(gòu)建：利用HindIII和EcoRI，將pAHC17載體上的玉米泛素啟動子的區(qū)間酶切下來，連接到同樣用HindIII和EcoRI雙酶切的載體pCAMBIA1301上，形成了可轉(zhuǎn)化水稻的過表達載體PUbiO。

實施例3nNOS轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

1、農(nóng)桿菌菌液的制備

將轉(zhuǎn)有重組載體Pubio-nNOS的農(nóng)桿菌在含有卡那霉素+慶大霉素的固體LB培養(yǎng)基上劃 線，28℃暗培養(yǎng)兩天。挑取單菌落接種在新的加有卡那霉素的LB平板上，28℃暗培養(yǎng)2-3天；用分光光度計測量菌液的OD₆₀₀值，用MS液體培養(yǎng)基調(diào)整OD₆₀₀值到0.4-0.55進行侵染。

2、農(nóng)桿菌感染愈傷與共培養(yǎng)

將水稻品種中花11的成熟胚愈傷組織與步驟(1)得到的重懸的農(nóng)桿菌懸液共培養(yǎng)20min，倒去菌液，將愈傷倒在滅過菌的濾紙上，超凈工作臺上放置2h直至吹干菌液，轉(zhuǎn)移感染后的愈傷到新的1/2共培養(yǎng)基上，在20℃下暗培養(yǎng)三天。

3、抗性愈傷組織的篩選

將水洗瀝干后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含潮霉素的抗性篩選培養(yǎng)基中，置于暗室中28℃培養(yǎng)大約2-3周，當(dāng)愈傷組織生長了3周后篩選培養(yǎng)基中的潮霉素抗性會逐漸失效，此時須將愈傷轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基中進行二次篩選，一段時間后會發(fā)現(xiàn)愈傷組織由嫩黃色變?yōu)楹诤稚?，然后死亡，但是帶有抗性的陽性愈傷會重新生長出嫩黃色的愈傷組織，此時新長出來帶抗性的愈傷組織就可以轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中進行分化。

4、水稻愈傷組織的分化

將篩選培養(yǎng)基上重新生長出的帶抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，不同的克隆做好標(biāo)記，將分化培養(yǎng)基放置到光照培養(yǎng)室內(nèi)28℃進行生長，直至愈傷組織分化出小苗，此過程大約需要3周左右。

5、分化小苗的生根

當(dāng)分化出來的小苗生長到5cm高時，用無菌的鑷子將再生的小苗從分化培養(yǎng)基中移出，并用無菌的剪刀將再生小苗的根部清除干凈，然后將其插入到含有生根培養(yǎng)基的生根管中，用封口膜封口后將生根管放置到光照培養(yǎng)室內(nèi)28℃進行生長，直至再生小苗長出新的根系，此過程大約需要3周左右。

6、煉苗與移栽

當(dāng)再生小苗生長到一定階段時，產(chǎn)生完整根系和葉片，可以進行煉苗處理。將生根管的封口膜打開，加入20mL的自來水，繼續(xù)放置在光照培養(yǎng)室內(nèi)28℃生長3天左右。將根系發(fā)達的幼苗移入溫室土壤中，緩苗一周后，移至戶外正常培養(yǎng)，即為T0代植株。

上述步驟用的的培養(yǎng)基的配方(1L)如下：

1/2共培養(yǎng)基：1/2N6+2,4-D(2.0mg/L)+Vitamin(B₁1mg，B₆0.5mg)+Fe²⁺-EDTA+CH(0.6g)+0.8％Agarose+2％Sucrose+1％Glucose+200mΜAS，pH調(diào)至5.6。

抗性篩選培養(yǎng)基：N6+2,4-D(2.0mg/L)+Vitamin(B₁1mg，B₆0.5mg)+Fe²⁺-EDTA+Pro0.3g+0.3％Phytagel+3％Sucrose+400mg/L Cef+50mg/L Hyg，pH調(diào)至6.0。

分化培養(yǎng)基：MS+Vitamin(B₁1mg，B₆0.5mg)+Fe²⁺-EDTA+2％Sucrose+CH(0.6g)+BA(3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+0.3％Phytagel，pH調(diào)至6.0。

生根培養(yǎng)基：1/2MS+Vitamin(B₁1mg，B₆0.5mg)+Fe²⁺-EDTA+2％Sucrose+CH(0.6g)+0.3％Phytagel，pH調(diào)至5.8。

CH水解酪蛋白，AS乙酰丁香酮，Hyg潮霉素，Cef頭孢霉素，Pro脯氨酸，NAA萘乙酸，F(xiàn)e²⁺-EDTA：FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA 37.3mg。

7、nNOS轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

(1)用CTAB法(Murray&Thompson，1980Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321–4325)提取野生型中花11(WT)和T0代抗性植株各單株的基因組DNA，采用pUbiO載體引物NOS(NOS終止子引物)和nNOS基因特異性引物nNOSF(nNOS正向引物)進行PCR擴增。引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下。

引物序列：

nNOSF：5’-CAGAGGAGGACGCTGGTGTA-3’，

NOS：5’-TCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAA-3’。

反應(yīng)體系(20μL)：模板1μL，10×PCR緩沖液2μL，dNTP Mix(2.0mmol/L)2μL，MgCl₂(25mmol/L)1.2μL，引物NOS(10μmol/L)0.3μL，引物nNOSF(10μmol/L)0.3μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，無核酶水13μL。

反應(yīng)程序：94℃3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，28個循環(huán)；循環(huán)完成后72℃延伸5分鐘。

采用pUbiO載體引物和nNOS基因特異性引物對轉(zhuǎn)基因水稻抗性植株進行PCR鑒定，對T0代的31個轉(zhuǎn)基因株系的鑒定結(jié)果顯示一共有31個陽性株系(圖1)。對T0代轉(zhuǎn)基因水稻進行繁殖，收到的T1代種子進行潮霉素抗性篩選，分離比為3:1的抗性株系為單拷貝nNOS過表達植株。單拷貝植株自交收種子抗性篩選，均為抗性苗即得到純和的T3代nNOS轉(zhuǎn)基因水稻。

(2)半定量RT-PCR檢測nNOS基因的超表達

采用半定量RT-PCR分析T3代轉(zhuǎn)基因水稻植株中外源基因nNOS的表達量，以ACTIN1基因做為內(nèi)參。轉(zhuǎn)基因株系葉片RNA提取使用Trizol試劑盒(Invitrogen)。使用DNAase消化RNA后，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA。

半定量所用引物為：

ACTIN1F：5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’，

ACTIN1R：5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’；

nNOSF：5’-CAGAGGAGGACGCTGGTGTA-3’，

nNOSR：5’-CCGCTCGAGATCCAGTTAGGAGCTGAAAAC-3’。

反應(yīng)程序：94℃時3分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，30個循環(huán)；循環(huán)完成后72℃延伸1分鐘。

用水稻的ACTIN1基因做為內(nèi)參基因，對水稻T3代3個轉(zhuǎn)基因獨立株系(分別命名為OE-2、OE08、OE-20，OE為過表達(overexpression)的簡寫)表達水平進行分析，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中，外源nNOS基因表達水平明顯增強(圖2)，選取這三個T3代獨立株系用于之后抗性以及生理指標(biāo)的測定實驗。

(3)nNOS轉(zhuǎn)基因水稻中NOS酶活和NO的含量

對OE-2、OE0、OE-20這3個獨立株系的NOS酶活進行了測定，NOS酶活的測定采用碧云天生物公司生產(chǎn)的一氧化氮合成酶檢測試劑盒(Nitric Oxide Synthase Assay Kit)，此試劑盒采用最新一代熒光探針，靈敏度高，特異性好。它用了可以穿透細(xì)胞膜的NO熒光檢測探針DAF-FM DA，在提供充足的反應(yīng)底物的條件下，檢測細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合成酶可以催化產(chǎn)生的一氧化氮量，從而檢測出一氧化氮合成酶的活性。植株經(jīng)過處理后，液氮研磨后重懸與2mL Buffer(50mM Tris–HCl pH 7.4，1mM EDTA，1mM dithiothreitol，1mM leupeptin，1mM pepstatin，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)12000g離心取上清。上清液用作NOS酶活粗提液，放入反應(yīng)液(含有NOS檢測緩沖液，L-Arginine溶液，0.1mM NADH和10μM DAF-FM AD)中反應(yīng)1h，用酶標(biāo)儀進行熒光定量檢測單位時間內(nèi)生成的NO含量，進而得到相對的NOS酶活性。

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因3個株系具有較高的NOS酶活(圖3)。同時DAF-FM DA染色結(jié)果也顯示這三個株系NO水平較高(圖4、5)。這三個轉(zhuǎn)基因獨立株系NO含量通過自由基的檢測方法進一步鑒定，與前述結(jié)果一致(圖6)。

自由基的檢測方法為：將大約0.5g水稻葉片用液氮碾磨成粉末，用2mL Buffer(0.1mM CaCl₂，10mM KCl，10mM MES-Tris pH 5.6)重懸，12000g離心取上清，上清液用自由基ISO-NO Mark II NO meter(World Precision Instruments)來測定NO的含量(按照說明書操作)。每次測定之前都需要制作NO的電極測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，NO的產(chǎn)生利用KNO₂和H₂SO₄反應(yīng)生成。NO的濃度利用Duo 18data acquisition system(World Precision Instruments)進行定量。這三個轉(zhuǎn)基因株系被選擇用來進行之后的實驗。

實施例4nNOS轉(zhuǎn)基因水稻的干旱和鹽脅迫抗逆性鑒定

(1)nNOS轉(zhuǎn)基因水稻植株對干旱和鹽脅迫耐受性

將正常1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)三天的野生型WT和轉(zhuǎn)基因株系幼苗轉(zhuǎn)移到含200mM甘露醇或200mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，生長10天后統(tǒng)計株高和鮮重。結(jié)果顯示(圖7、8、9、10)，轉(zhuǎn)基因株系的株高和鮮重都要明顯高于野生型植株。

同時，在溫室土壤栽培條件下對轉(zhuǎn)基因水稻進行了干旱處理，生長5周的野生型和轉(zhuǎn)基因植株停止?jié)菜?周，然后復(fù)水1周后觀察表型。結(jié)果顯示(圖11、12)，WT植株只有約29％的存活率，而轉(zhuǎn)基因株系存活了約69％-72％。

上述結(jié)果表明，過表達小鼠nNOS可以提高水稻的干旱和鹽脅迫抗性。

(2)脅迫條件下nNOS轉(zhuǎn)基因水稻植株的生理指標(biāo)的變化

干旱和鹽脅迫會導(dǎo)致植物大量的生理和代謝水平的變化。分析這些變化有利于了解nNOS轉(zhuǎn)基因水稻植株抗性提高的生理機制。進一步檢測了WT和轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片的失水率、在正常條件和干旱以及高鹽脅迫條件下的電導(dǎo)率以及MDA的含量。

干旱和高鹽的脅迫處理方法：正常1/2MS培養(yǎng)基上生長10天的野生型和轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)移到水、200mM甘露醇或者200mM NaCl中，淹沒根部，處理兩天后，取葉片進行離子滲出率以及MDA的含量測定。

失水率的測定方法：五周齡的土培生長良好的水稻植株，每株收集十片左右劍葉，將其放在半開的培養(yǎng)皿中置于桌面上，在預(yù)定的時間稱量葉片的鮮重，計算失水率。每個實驗至少重復(fù)三次。

電導(dǎo)率的測定：取12片未處理或脅迫處理過的水稻葉片，放入裝有40mL雙蒸水的100mL燒杯中，以120rpm的轉(zhuǎn)速搖晃3h，用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率(C1)；然后將其在沸水浴中煮30min，再去測定其電導(dǎo)率(C2)。相對電導(dǎo)率根據(jù)公式C1/C2*100％得到。

MDA含量的測定：稱取未處理和脅迫處理過的水稻葉片約0.5g，用研磨棒研磨后加入5mL冰地TBA溶液(0.25％(w/v)thiobarbituric acid in 10％(w/v)trichloroacetic acid)，在沸水浴中提取30min。室溫冷卻后，12000g離心10min，取上清，測定OD₄₅₀、OD₅₃₂和OD₆₀₀，根據(jù)以下公式，得到單位質(zhì)量水稻葉片中MDA的含量：MDA(μmol/g FW)＝[6.45×(OD₅₃₂-OD₆₀₀)-0.559×OD₄₅₀]×Vt/(Vs×FW)，Vt—提取液體積(mL)，Vs—測定用提取液體積(mL)，F(xiàn)W—樣品鮮重(g)。

結(jié)果顯示nNOS轉(zhuǎn)基因水稻植株的失水速率要慢于WT，說明轉(zhuǎn)基因株系具有較強的水分保持能力(圖13)。同時，在脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的電導(dǎo)率和MDA的積累也要顯著低于WT植株(圖14、15)，說明轉(zhuǎn)基因株系受到的氧化損傷要輕于WT。這些生理指標(biāo)的變化 都為轉(zhuǎn)基因植株對干旱和鹽脅迫的高抗表型提供了理論依據(jù)。