本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種亮丙瑞林及亮丙瑞林醋酸鹽的工業(yè)化制備新工藝。

背景技術(shù)：

亮丙瑞林是促黃體生成釋放激素(LH-RH)的高活性衍生物，在給藥后能立即產(chǎn)生垂體-性腺系統(tǒng)興奮作用(急性作用)，然后抑制垂體生成和釋放促性腺激素。它還進(jìn)一步抑制卵巢和睪丸對(duì)促性腺激素的反應(yīng)，從而降低雌二醇和睪丸酮的生成(慢性作用)。所以能有效地抑制垂體-性腺系統(tǒng)的功能。醋酸亮丙瑞林廣泛用于治療早熟、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌等女性患者和前列腺癌等男性患者。

專利CN 102464702 B公開了醋酸亮丙瑞林的Boc合成法，該方法采用多個(gè)無側(cè)鏈保護(hù)基的Boc氨基酸，如Boc-Arg-OH，Boc-Tyr-OH等，容易產(chǎn)生由于側(cè)鏈基團(tuán)的部分親核性而引起的側(cè)鏈反應(yīng)副產(chǎn)物，如Arg側(cè)鏈的胍基酰胺化副產(chǎn)物等。該工藝合成的醋酸亮丙瑞林收率低，并不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

專利CN 1865280 B公開了亮丙瑞林的Fmoc合成法，該方法需要使用大量六氫吡啶、三氟乙酸、乙硫醇和苯酚等毒性非常大的脫保護(hù)試劑，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，另外，氨基酸連接反應(yīng)需要在20至30℃下進(jìn)行，容易產(chǎn)生消旋等副反應(yīng)，且收率較低。

其他發(fā)明專利及文獻(xiàn)中報(bào)道的亮丙瑞林的固液相相結(jié)合法及液相合成法，相較于固相合成法，工藝復(fù)雜，并不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

另外，現(xiàn)有技術(shù)中亮丙瑞林合成常以CTC樹脂、Wang樹脂及Cl-CH₂樹脂為起始固相載體，得到的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差，旋光度多不符合要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備亮丙瑞林的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)醋酸亮丙瑞林的制備方法。

本發(fā)明采用Boc與Fmoc相結(jié)合的方法合成亮丙瑞林。本發(fā)明固相法制備亮丙瑞林的方法包括如下步驟：1)以樹脂為固相載體，采用Boc固相合成法和Fmoc固相合成法相結(jié)合逐一偶聯(lián)的方式連接具有側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護(hù)亮丙瑞林前體肽樹脂；偶聯(lián)過程中使用有機(jī)堿脫去α-氨基的Fmoc；在酸性條件下脫去α-氨基的Boc。2)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)肽樹脂進(jìn)行胺解切割，得到側(cè)鏈全保護(hù)亮丙瑞林粗肽，再用脫保護(hù)試劑除去側(cè)鏈保 護(hù)基團(tuán)，得到亮丙瑞林粗肽；或先用脫保護(hù)試劑除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，再與乙胺反應(yīng)，得到亮丙瑞林粗肽。3)純化所得粗肽，得到所述的亮丙瑞林成品。優(yōu)選先偶聯(lián)的一個(gè)氨基酸(Pro⁹)或多個(gè)氨基酸的固相連接采用Boc法，其余后面偶聯(lián)的氨基酸的固相連接采用Fmoc法。更優(yōu)選先偶聯(lián)的四個(gè)氨基酸(Pro⁹，Arg⁸，Leu⁷，Dleu⁶)的固相連接采用Boc法，后面偶聯(lián)的五個(gè)氨基酸(Tyr⁵，Ser⁴，Trp³，His²，pGlu¹)的固相連接采用Fmoc法。在亮丙瑞林固相合成中，前四個(gè)偶聯(lián)的氨基酸分別是Pro，Arg，Leu，Dleu。這四個(gè)氨基酸由于位阻較大，在常規(guī)的Fmoc法合成中連接比較困難，需要較高溫度和較長時(shí)間，因此本發(fā)明采用了比Fmoc體積更小的Boc作為氨基酸α-氨基的保護(hù)基，分別使用側(cè)鏈保護(hù)的Boc氨基酸，如Boc-L-Pro-OH，Boc-L-Arg(Mtr)-OH，Boc-L-Leu-OH、Boc-D-Leu-OH等。采用Boc法連接這四個(gè)氨基酸在-10至20℃低溫就能有效完成。通過降低反應(yīng)溫度從而減少了消旋的可能性及其他副反應(yīng)，提高了工藝效率。在后五個(gè)氨基酸的固相連接中仍然采用了Fmoc法，分別使用側(cè)鏈保護(hù)的Fmoc氨基酸，如Fmoc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-OH，pGlu-OH等。避免了側(cè)鏈上的副反應(yīng)，并且在-10至20℃低溫就能有效完成連接，減少了消旋的可能性及其他副反應(yīng)。另外，在pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-DLeu-Leu-Arg(Mtr)-L-Pro-PAM Resin胺解過程中，采用EtNH₂/THF(1∶1)反應(yīng)體系，工藝穩(wěn)定性好，效率高。進(jìn)一步地可以將本發(fā)明的亮丙瑞林制成可藥用鹽，優(yōu)選為醋酸亮丙瑞林。結(jié)合上述三個(gè)關(guān)鍵步驟，獲得的醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品質(zhì)量好，純度達(dá)99％以上，總收率達(dá)到36％。

另外，本發(fā)明采用Boc與Fmoc相結(jié)合的固相方法合成亮丙瑞林，過程中減少了六氫吡啶、三氟乙酸的用量，完全避免了苯酚等毒性非常大的脫保護(hù)試劑的使用；相較于Fmoc合成法，避免了液相中的乙胺化反應(yīng)，抑制了液相反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并減小了對(duì)環(huán)境的污染，提高了制備工藝的安全性；相較于Boc合成法，因?yàn)椴捎昧藗?cè)鏈保護(hù)氨基酸，減少了側(cè)鏈上的副反應(yīng)。相較于單一的Fmoc法和單一的Boc法，本發(fā)明采用Fmoc法和Boc法相結(jié)合的方法，能夠在-10至20℃低溫下有效完成連接，減少了消旋的可能性及其他副反應(yīng)，更適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

另外，本發(fā)明以PAM樹脂為起始固相載體替代CTC樹脂、Wang樹脂或Cl-CH₂樹脂，由于PAM樹脂更穩(wěn)定，得到的醋酸亮丙瑞林質(zhì)量好，旋光度穩(wěn)定，符合產(chǎn)品質(zhì)量要求。選用CTC樹脂為起始固相載體時(shí)，生產(chǎn)出的醋酸亮丙瑞林質(zhì)量穩(wěn)定性差，旋光度多不符合要求。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案為：

亮丙瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt的制備方法：在固體支持 物上進(jìn)行的分步固相合成，胺解切割，側(cè)鏈脫保護(hù)，純化；或者在固相合成后先側(cè)鏈脫保護(hù)，再胺解切割，純化。

固相合成：采用Boc固相合成法和Fmoc固相合成法相結(jié)合逐一偶聯(lián)的方式連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護(hù)亮丙瑞林前體肽樹脂；偶聯(lián)過程中使用有機(jī)堿脫去α-氨基的Fmoc，優(yōu)選所述有機(jī)堿選自哌啶或C-烷基取代哌啶，其中，烷基為1到6個(gè)碳的支鏈或直鏈烷基；在酸性條件下脫去α-氨基的Boc，優(yōu)選所述酸性試劑選自三氟乙酸或鹽酸。形成肽鍵的試劑有O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸/N-甲基嗎啡林，1-羥基苯并三唑/N，N’二異丙基碳二亞胺，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/N-甲基嗎啡林，(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽/N-甲基嗎啡林，優(yōu)選1-羥基苯并三唑/N，N’二異丙基碳二亞胺。優(yōu)選的溶劑為二甲基甲酰胺，優(yōu)選的支持物為PAM Resin。

胺解切割：使亮丙瑞林保護(hù)肽從支持物上切割下來的優(yōu)選方法為胺解反應(yīng)。胺解反應(yīng)選用的試劑優(yōu)選為乙胺，相應(yīng)的溶劑有四氫呋喃，甲醇，DMF，DCM等，優(yōu)選為四氫呋喃。優(yōu)選采用EtNH₂/THF(1∶1)反應(yīng)體系。

側(cè)鏈脫保護(hù)：使全保護(hù)亮丙瑞林的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)脫除優(yōu)選的方法為酸處理。酸處理使用的試劑優(yōu)選為TFA，脫保護(hù)輔助試劑優(yōu)選為茴香硫醚，苯甲醚，乙二硫醇。亮丙瑞林的沉淀溶劑有乙醚，異丙醚，甲基叔丁基醚等，優(yōu)選溶劑為乙醚。

純化：使用反相色譜法進(jìn)行純化。

附圖說明

圖1為制備亮丙瑞林及其醋酸鹽的工藝流程圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡述本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例：

實(shí)施例1

樹脂Boc-L-Pro PAM Resin的合成

將PAM Resin(12.5g，取代度0.80mmol/g)置于反應(yīng)器中，用100mL的DCM溶解4.3g Boc-L-Pro-OH，然后加入反應(yīng)器中，持續(xù)攪拌，然后緩慢加入吡啶6.5mL，再緩慢加入2，6-二氯苯甲酰氯5.8mL，攪拌3-6h，抽干濾液，加入2.5倍樹脂體積的DCM，洗滌2次，每次3分鐘，加入2.5倍樹脂體積的DMF，洗滌2次，每次3分鐘，加入2.5倍樹脂 體積的MeOH，洗滌2次，每次3分鐘。抽干，先空氣干燥20-30分鐘，然后真空干燥12h以上，即可用于步驟2。

實(shí)施例2

多肽采用Boc-L-Pro-PAM Resin的合成和純化。

步驟1.將Boc Pro-PAM Resin樹脂(15.4g；取代度0.65mmol/g)置于反應(yīng)器中，用150mL的DCM進(jìn)行溶脹不小于2h，然后用2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2次，每次約2分鐘。抽濾除去溶液。即可用于步驟2。

步驟2.加入2.5倍樹脂體積的50％TFA/DCM溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，取10mg左右的樹脂做茚三酮檢測，結(jié)果呈陽性。

將9.4g Boc-Arg(Mtr)-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟3。

步驟3.加入2.5倍樹脂體積的50％TFA/DCM溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再向以上 樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液.取10mg左右的樹脂做茚三酮檢測，結(jié)果呈陽性。

將4.6g Boc-L-Leu-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟4。

步驟4.加入2.5倍樹脂體積的50％TFA/DCM溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，取10mg左右的樹脂做茚三酮檢測，結(jié)果呈陽性。

將4.6g Boc-D-Leu-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，再加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟5。

步驟5.加入2.5倍樹脂體積的50％TFA/DCM溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的5％TEA/DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂 體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DCM洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，向以上樹脂中再加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，取10mg左右的樹脂做茚三酮檢測，結(jié)果呈陽性。

將9.2g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻至小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟6。

步驟6.加入2.5倍樹脂體積的20％PIP/DMF溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌3次，每次2min，抽去反應(yīng)液。

將7.7g Fmoc-L-Ser(tBu)-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻至小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟7。

步驟7.加入2.5倍樹脂體積的20％PIP/DMF溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌3次，每次2min，抽去反應(yīng)液。

將10.5g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻至小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢 測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟8。

步驟8.加入2.5倍樹脂體積的20％PIP/DMF溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌3次，每次2min，抽去反應(yīng)液。

將12.4g Fmoc-L-His(Trt)-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻至小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液。即可用于步驟9。

步驟9.加入2.5倍樹脂體積的20％PIP/DMF溶液，攪拌30±5min，抽濾除去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌3次，每次2min，抽去反應(yīng)液。

將2.6g pGlu-OH-OH(2倍當(dāng)量)，2.7g HOBt置于活化容器中，加入DMF溶解，在冰浴冷卻至小于10℃，加入DIC 3.1mL，在20℃以下活化20-25min，然后加入到上述洗滌好的樹脂中，進(jìn)行連接，加入適量的DMF使反應(yīng)能攪拌起來，反應(yīng)1.5-3.0h，整個(gè)過程溫度控制在-10至20℃，去除反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束前取出10mg左右的樹脂進(jìn)行茚三酮檢測，結(jié)果呈陰性。

向以上樹脂中加入2.5倍樹脂體積的DMF洗滌3次，每次2min，抽去反應(yīng)液，加入2.5倍樹脂體積的MeOH洗滌3次，每次2min。即可用于步驟10。

步驟10.抽干，先空氣干燥20-30分鐘，然后真空干燥12h以上。

步驟11.配置好200mL 50％四氫呋喃和乙胺溶液，然后將全保護(hù)肽樹脂(以20g計(jì)算)的容器中加入配好的50％四氫呋喃和乙胺溶液，20-25℃下胺解24h±5min，然后去除樹脂，收集濾液，并用甲醇清洗樹脂3次，合并濾液。將濾液在45℃下減壓蒸餾固體。即可用于步驟12。

步驟12.配置90％TFA，5％乙二硫醇，3％茴香硫醚，2％苯甲硫醚(200mL)，然后將全保護(hù)肽(以20g計(jì)算)的容器中加入上述配好的并于冰箱中冷卻的TFA切割液，室溫下切割6-8h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液緩慢加入裝有冰凍乙醚的容器中，將帶有乙醚的亮丙瑞林粗肽濕品進(jìn)行過濾處理，然后用乙醚洗滌粗肽3次。將離心后的粗品空氣干燥約0.5h，放入真空干燥器中抽干12h以上，得到亮丙瑞林粗肽。即可用于步驟13。

步驟13.用反相色譜進(jìn)行純化，使用反相高效液相色譜柱層析進(jìn)行換鹽得到醋酸亮丙瑞林。產(chǎn)品純度為99.5％，收率為36％。

步驟14.采用真空冷凍干燥進(jìn)行凍干，得到醋酸亮丙瑞林成品。

實(shí)施例3

多肽采用Boc-L-Pro-PAM Resin的合成和純化。

步驟1.將Boc-Pro-PAM Resin樹脂(2155.3g，1250mmol)置于反應(yīng)器中，加入20L DCM溶脹2小時(shí)6分鐘。用DCM洗滌2次，每次約2分鐘。抽濾除去溶液，即可用于步驟2

步驟2.加入30L 50％TFA/DCM，反應(yīng)30分鐘，抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DCM，5％TEA/DCM，甲醇，DMF依次反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性。

稱量Boc-Arg(Mtr)-OH 1216.6g，HOBt 337.9g，然后用2.3L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化23min，活化溫度14.8℃，反應(yīng)2小時(shí)40分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇，DCM依次反復(fù)洗滌。

步驟3.向上述步驟中加入50％TFA/DCM 25.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DCM，5％TEA/DCM，甲醇，DMF依次反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性

稱量Boc-Leu-OH.H2O，622.6g，HOBt 337.9g，然后用1.2L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化23min，活化溫度14.8℃，反應(yīng)2小時(shí)40分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇，DCM依次反復(fù)洗滌。

步驟4.向上述步驟中加入50％TFA/DCM 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DCM，5％TEA/DCM，甲醇，DMF依次反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性

稱量Boc-D-Leu-OH.H2O 622.6g，HOBt 337.8g，然后用1.2L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化22min，活化溫度16.8℃，反應(yīng)2小時(shí)45分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇，DCM依次反復(fù)洗滌。

步驟5.向上述步驟中加入50％TFA/DCM 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液， 然后再用DCM，5％TEA/DCM，甲醇，DMF依次反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性

稱量Fmoc-Tyr(tBu)-OH 1148.8g，HOBt 337.8g，然后用2.0L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化22min，活化溫度16.4℃，反應(yīng)2小時(shí)40分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇依次反復(fù)洗滌。

步驟6.向上述步驟中加入20％PIP/DMF 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DMF，甲醇反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性。

稱量Fmoc-Ser(tBu)-OH 957.5g，HOBt 337.8g，然后用1.8L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化23min，活化溫度18.4℃，反應(yīng)2小時(shí)40分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇反復(fù)洗滌。

步驟7.向上述步驟中加入20％PIP/DMF 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DMF，甲醇反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性。

稱量Fmoc-Trp(Boc)-OH 1316.3g，HOBt 337.8g，然后用2.0L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化22min，活化溫度14.8℃，反應(yīng)2小時(shí)35分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇反復(fù)洗滌。

步驟8.向上述步驟中加入20％PIP/DMF 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DMF，甲醇反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性。

稱量Fmoc-His(Trt)-OH 1548.8g，HOBt 337.8g，然后用3.0L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化22min，活化溫度6.8℃，反應(yīng)1小時(shí)35分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇反復(fù)洗滌

步驟9.向上述步驟中加入20％PIP/DMF 30.0L，反應(yīng)30分鐘。抽濾除去反應(yīng)液，然后再用DMF，甲醇反復(fù)洗滌，茚三酮檢測呈陽性。

稱量pGlu-OH 322.5g，HOBt 337.8g，然后用0.6L DMF溶解，用冰浴冷卻小于10℃，加入DIC 392mL進(jìn)行活化，活化21min，活化溫度15.2℃，反應(yīng)1小時(shí)50分鐘，茚三酮檢測呈陰性。抽濾除去反應(yīng)液，然后用DMF，甲醇反復(fù)洗滌。

步驟10.將肽樹脂從反應(yīng)釜中取出，放入一個(gè)干燥盒中，空氣干燥22min，然后真空干燥17小時(shí)15分鐘，得到樹脂4230.6g，合成收率99.4％。

步驟11.在一個(gè)反應(yīng)器中加入4230.6g多肽樹脂，并加入機(jī)械攪拌，然后加入43000mL乙胺/四氫呋喃溶液(1∶1)，在室溫下反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，過濾反應(yīng)液，然后用3000mL甲醇洗滌樹脂3次，并收集合并所有濾液，轉(zhuǎn)移至合適的圓底燒瓶中。

將上述所得的濾液40-45℃下減壓蒸餾至固體，真空干燥12小時(shí)10分鐘，得全保 護(hù)肽重量1855.5g

步驟12.將配好的TFA切割液20000mL加入到上述圓底燒瓶中，低溫反應(yīng)半小時(shí)，再室溫反應(yīng)7.5小時(shí)，將反應(yīng)后的溶液緩慢加到200L的冷乙醚中，邊加邊攪拌，然后選用合適的過濾器進(jìn)行過濾，過濾完濾液后，再用冷乙醚洗滌沉淀3次，每次15L，乙醚量必須覆蓋粗品，過濾后收集沉淀。將粗品放入真空干燥箱中，干燥恒重15小時(shí)6分鐘得到亮丙瑞林粗品1512.4g，粗品純度86.5％，收率100.6％。

實(shí)施例4

多肽采用Boc-L-Pro-PAM Resin的合成和純化。

步驟1.稱取Boc-Pro PAM Resin 1033.6g(671.84mmol)置于多肽反應(yīng)器中

步驟2.向樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾3分鐘，再向樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?0分鐘，抽濾3分鐘，然后加入DCM，95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟3.稱取1260.6g Boc-Arg(Mtr)-OH，HOBt 363.1g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴0℃冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1236mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟2的樹脂中，混合搖動(dòng)1分鐘，再加入DIPEA 117mL，充入氮?dú)鈹嚢?80分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。再稱取653.0g Arg(Mtr)-OH，HOBt181.4g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 618mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入以上處理的樹脂中，混合搖動(dòng)1分鐘，再加入DIPEA 117mL，充入氮?dú)鈹嚢?80分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。處理后的樹脂在45℃下減壓干燥120分鐘，肽樹脂重量1345.5g，實(shí)際增重311.9g，縮合率99.8％。

步驟4.向步驟3處理的樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾3分鐘，再向樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?0分鐘，抽濾3分鐘，然后加入DCM，95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟5.稱取776.0g Boc-Leu-OH，HOBt 453.5g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1679mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟4的樹脂中，混合搖動(dòng)1分鐘，再加入DIPEA 117mL，充入氮?dú)鈹嚢?80分鐘， 反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟6.向步驟5處理的樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?0分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DCM，95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟7.稱取776.0g Boc-D-Leu-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟6的樹脂中，混合搖動(dòng)1分鐘，再加入DIPEA 117mL，充入氮?dú)鈹嚢?80分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟8.向步驟7處理的樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入3.5N HCl/HOAC 3100mL，充入氮?dú)鈹嚢?0分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DCM，95％EtOH，DMF，EtOAC，Et₂O依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。處理后的樹脂在45℃下減壓干燥25分鐘，肽樹脂重量1360.2g，實(shí)際增重326.6g，縮合率99.6％。

步驟9.稱取1548.6g Fmoc-Tyr(tBu)-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟8的樹脂中，混合搖動(dòng)1分鐘，充入氮?dú)鈹嚢?40分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟10.向步驟9處理的樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?5分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DMF對(duì)多肽樹脂洗滌5次。

步驟11.稱取1306.8g Fmoc-Ser(tBu)-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟10的樹脂中，充入氮?dú)鈹嚢?40分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟12.向步驟11處理的樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?5分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DMF對(duì)多肽樹脂洗滌5次

步驟13.稱取1773.7g Fmoc-Trp(Boc)-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟12的樹脂中，充入氮?dú)鈹嚢?40分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟14.向步驟13處理的樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?5分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DMF對(duì)多肽樹脂洗滌5次

步驟15.稱取2277.6g Fmoc-His(Trt)-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟14的樹脂中，充入氮?dú)鈹嚢?40分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。再稱取2277.6g Fmoc-His(Trt)-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟1的樹脂中，充入氮?dú)鈹嚢?20分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL.抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。

步驟16.向步驟15處理的樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?分鐘，抽濾2分鐘，再向樹脂中加入20％PIP/DMF 12403mL，充入氮?dú)鈹嚢?5分鐘，抽濾2分鐘，然后加入DMF對(duì)多肽樹脂洗滌5次。

步驟17.稱取430.3g pGlu-OH，HOBt 453.8g，在燒杯中用3100mL DMF溶解，在冰浴冷卻下，加入2mmol/mL的DIC/DMF 1680mL，放置20分鐘。將上述活化的羧基組分溶液倒入步驟16的樹脂中，充入氮?dú)鈹嚢?40分鐘，反應(yīng)過程中對(duì)反應(yīng)器壁的樹脂和氨基酸用DMF進(jìn)行淋洗，每次約10mL。抽濾除去反應(yīng)液，向以上樹脂中加入DMF，甲醇，DCM依次進(jìn)行多肽樹脂的洗滌。然后將所得樹脂45℃減壓干燥2小時(shí)至恒重，得到樹脂2176.1g，增重1142.5g，縮合率102.1％

步驟18.將507.0g(156.5mmol)全保護(hù)肽樹脂加入到圓底燒瓶中，加入2500mL TFA切割液，室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將反應(yīng)混合液倒入3#砂芯漏斗進(jìn)行過濾，抽濾10min除去反應(yīng)液，，用TFA切割液沖洗圓底燒瓶3次(30mL/次)，然后向樹脂中加入2500m L以下各溶劑，DCM，95％乙醇，DMF，6％TEA/DCM，乙酸乙酯，乙醚依次反復(fù)洗滌，將樹脂在45℃ 下減壓真空干燥2小時(shí)，得樹脂重量415.3g。

步驟19.將以上樹脂放入圓底燒瓶中，加入5000mL 70％EtNH₂/H₂O-THF(1∶1)溶液，室溫反應(yīng)24小時(shí)，將反應(yīng)混合液倒入3#砂芯漏斗中，抽濾10分鐘，用95％乙醇沖洗圓底燒瓶3次(30mL/次)，將沖洗液倒入砂芯漏斗，抽濾1分鐘。

步驟20.將以上全部溶液在45℃下減壓濃縮至干，得淺黃色殘?jiān)缓蠹尤?0000mL冷乙醚攪拌洗滌過濾，得沉淀，加乙醚200mL反復(fù)洗滌2次。將所得沉淀減壓真空干燥15.5小時(shí)，即得亮丙瑞林粗品214.1g，切割收率113％，純度81.5％。

與專利CN 102464702 B公開的醋酸亮丙瑞林的Boc合成法收率僅有17％，專利CN 1865280 B公開的亮丙瑞林的Fmoc合成法收率僅有22％相比，本發(fā)明方法合成亮丙瑞林收率為36％，并且純度更高。