本發(fā)明涉及一種CTC分離純化方法，具體的涉及一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)臨床CTC分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細胞(CTC)，是指從源發(fā)瘤體脫落進入人體外周血的腫瘤細胞。循環(huán)腫瘤細胞進入血液循環(huán)后遷移到身體其他組織部位造成腫瘤的轉(zhuǎn)移，也被稱為擴散的腫瘤細胞。CTC與癌癥轉(zhuǎn)移、治療效果、癌癥復(fù)發(fā)、用藥指導(dǎo)及預(yù)后密切相關(guān)，因而被作為癌癥轉(zhuǎn)移早期診斷和治療的重要生物標志物。對CTC的研究有望闡明癌癥轉(zhuǎn)移、藥物敏感及耐藥性產(chǎn)生的內(nèi)在機理，從而實現(xiàn)對癌癥病人的個體化有效治療。為了得到純度高及生物活性良好的樣本，發(fā)展CTC的高效捕獲和分離技術(shù)具有極其重要的意義。

目前基于CTC分離的納米結(jié)構(gòu)基底的研究已經(jīng)成為一個熱點領(lǐng)域和方向。經(jīng)過近幾年的研究發(fā)展，已將硅納米柱、碳納米管、石墨烯、納米粒子以及納米纖維等納米結(jié)構(gòu)材料應(yīng)用于CTC捕獲基底的研究中。然而目前的研究結(jié)果表明三維納米結(jié)構(gòu)在提高CTC捕獲效率的同時，也增加了對血細胞的吸附，這實際上會降低CTC的捕獲純度。而CTC的分子鑒定和功能分析需要更高純度的CTC樣品。Hsian-Rong Tseng課題組通過在微流控芯片上電紡PLGA聚合物納米纖維捕獲CTC，并采用激光微切割技術(shù)對單個的CTC進行收集，并進行分子生物學(xué)分析。然而，此方法非常耗時，且很難操作，也容易對細胞造成破壞。

另外，CTC被捕獲在界面上后，實現(xiàn)其生物活性的保持，則要求基底界面的組成具有更好的細胞相容性。然而對于細胞相容性更好的天然生物高分子，包括殼聚糖，目前還沒有應(yīng)用于基于納米粒子界面的CTC捕獲的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種生物相容性良好的基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底，該基底在納米界面上對分子識別作用進行設(shè)計，將抗粘附分子與親和捕獲分子的作用進行有機結(jié)合，能夠有效抑制細胞非特異性捕獲且同時提高靶細胞的特異性識別，進而實現(xiàn)CTC的高效捕獲及純化。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述CTC捕獲與純化基底的方法，該方法工藝簡單 便捷，成本低，并且對不同性質(zhì)的材料具有普適性。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述CTC捕獲與純化基底的用途。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底，包括粒徑100-1000nm殼聚糖納米粒子，連接于殼聚糖納米粒子表面的抗粘附分子以及與所述抗粘附分子連接的CTC親和捕獲分子。

進一步的，所述CTC捕獲與純化基底包括主要由分布在基材表面的復(fù)數(shù)殼聚糖納米粒子組成的三維納米結(jié)構(gòu)。

其中，采用的殼聚糖納米粒子表面具有良好的細胞相容性。

進一步的，所述抗粘附分子旨在降低細胞在界面上的非特異粘附，可以包括各種功能化的聚乙二醇(PEG)分子，亦即，帶有功能基團的聚乙二醇分子，所述功能基團包括氨基和/或羧基，且不限于此。

在一較佳實施方案之中，所述抗粘附分子可采用NH₂-PEG-COOH。

進一步的，所述CTC親和捕獲分子用以實現(xiàn)CTC細胞的高特異捕獲，其可以包括EpCAM適配體(DNA分子)或EpCAM適配體的各種飾化產(chǎn)物，例如DNA-NH₂，且不限于此。

一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制法，其包括：

(1)將分子量為Mw 40000～50000Da的低分子量殼聚糖溶于有機酸體系中形成均相透明殼聚糖溶液；

(2)以靜電紡絲裝置將所述殼聚糖溶液通過電噴方式施加于基材表面，形成殼聚糖納米粒子；

(3)在所述殼聚糖納米粒子表面枝接抗粘附分子；

(4)將CTC親和捕獲分子與連接在所述殼聚糖納米粒子表面的抗粘附分子偶聯(lián)，獲得所述CTC捕獲與純化基底。

在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟(1)包括：將低分子量殼聚糖加入有機酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液，所述有機酸溶液包括濃度為60v/v％-90v/v％的乙酸或甲酸溶液。

在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟(2)包括：將步驟(1)所獲殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中電噴0.1-4h，在基材表面制得殼聚糖納米粒子。

其中，所述基材可以是玻璃片、單晶硅片、金屬鋁片、有機薄膜、金屬等，且不限于此。

在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟(3)包括：

將步驟(2)所獲殼聚糖納米粒子在氨水與甲醇的混合溶液(例如，氨水與甲醇的體積比 為4:96)中靜置1-4h，而后于40-60℃真空干燥24h以上；

以及，將所述殼聚糖納米粒子置于濃度為2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后于濃度為0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中浸漬12-24h，之后與濃度為0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH溶液反應(yīng)8-24h，從而在所述殼聚糖納米粒子表面枝接PEG分子。

在一較為優(yōu)選的實施方案之中，步驟(4)包括：在中性條件下，使CTC親和捕獲分子在具有活化羧基的偶聯(lián)試劑的作用下，與表面枝接有PEG分子的殼聚糖納米粒子進行偶聯(lián)。

進一步的，步驟(4)包括：

在中性條件下，使EpCAM適配體在具有活化羧基的偶聯(lián)試劑EDC及NHS(例如，其中EDC的濃度為0.2mol/L，NHS的濃度為0.05mol/L)的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖納米粒子偶聯(lián)；

以及，將所述殼聚糖納米粒子置于濃度為0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60min，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團，獲得所述CTC捕獲與純化基底。

在一更為具體的實施案例之中，一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制備方法可以包括如下步驟：

a)采用低分子量殼聚糖在有機酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液；

b)將步驟a中殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中進行電噴0.1-4h，在基材表面制得殼聚糖納米粒子；

c)將步驟b所獲的分布于基材表面的殼聚糖納米粒子置于氨水和甲醇的混合溶液中靜止1-4h，而后置于真空干燥箱40-60℃干燥24h；

d)將步驟c中的殼聚糖納米粒子表面置于濃度為2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后浸入濃度為0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中12-24h，而后與濃度為0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH溶液反應(yīng)8-24h，將PEG分子接枝到殼聚糖表面；

e)在中性條件下，使?jié)舛葹?.1-10μM的適配體DNA-NH₂在活化羧基的偶聯(lián)試劑例如EDC和NHS的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖進行偶聯(lián)；

f)將步驟e中的獲得殼聚糖納米粒子表面置于濃度為0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60min，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團，即制得所述基底。

前述的任一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底在CTC捕獲和純化中的應(yīng)用。

例如，其中的一種應(yīng)用方案可以是：一種裝置，其包含前述的任一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底。

又例如，其中的一種應(yīng)用方案可以是：一種CTC純化方法，包括：將被捕獲的CTC在 所述CTC捕獲與純化基底上原位培養(yǎng)。

其中，因CTC與血液細胞的增殖屬性差異，將已捕獲的細胞進行原位培養(yǎng)可以進一步提高靶細胞的純度。所述“原位培養(yǎng)”即：捕獲后的細胞在該基底后續(xù)培養(yǎng)的過程中“優(yōu)勝劣汰”，換言之：靶細胞(CTC)保證活性并持續(xù)增殖，而血細胞將逐漸失去活性被淘汰。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下有益效果：

1)基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底可以提供細胞相容性良好的“軟”三維納米界面，能夠更好的與細胞納米結(jié)構(gòu)匹配和作用；

2)該CTC捕獲與純化基底在修飾特異捕獲分子的基礎(chǔ)上，引入抗粘附分子能夠保證高效捕獲靶細胞的前提下降低非靶細胞的非特異粘附；

3)該CTC捕獲與純化基底所捕獲CTC具有良好生物活性，能在界面進行細胞的原位培養(yǎng)實現(xiàn)CTC的進一步純化。原位培養(yǎng)可以大量擴增CTC，提高CTC的數(shù)量，這對CTC的分子鑒定等研究非常有幫助。

4)利用本發(fā)明的制備方法，可以制備不同粒徑的均一納米粒子表面，其簡單便捷，成本低，實用性強。

5)本發(fā)明所述制備方法，所述的靜電紡絲納米粒子的制備方法對不同性質(zhì)的材料有普適性。

6)本發(fā)明所述制備方法可在不同基材上制備，包括玻璃片、單晶硅片、金屬鋁片、有機薄膜、金屬表面等。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的闡述。

圖1是本發(fā)明一實施方案之中利用一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底進行CTC捕獲以及純化的原理圖；

圖2是本發(fā)明實施例1中以電噴工藝制備的不同納米粒徑的殼聚糖納米粒子表面的SEM照片；

圖3是本發(fā)明實施例1中對殼聚糖納米粒子基底進行界面修飾的原理圖；

圖4是本發(fā)明實施例1中利用基底A、B、C三種不同界面捕獲細胞的熒光照片；

圖5a-圖5c是本發(fā)明實施例1中不同粒徑及界面修飾的基底的捕獲效率對比圖；

圖6是本發(fā)明實施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對不同細胞株捕獲特異性的考察結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明實施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對不同比例混合細胞株的捕獲行為的考察結(jié)果圖；

圖8a是本發(fā)明實施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對已捕獲靶細胞/白細胞按10⁴/106比例混合捕獲后的原位培養(yǎng)純化效果的考察圖；

圖8b是本發(fā)明實施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對已捕獲靶細胞/白細胞按10/106比例混合捕獲后的原位培養(yǎng)純化效果的考察圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)實際需要而做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和實踐，提出了本發(fā)明的技術(shù)方案，即，提供了一種基于殼聚糖納米粒子的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)捕獲與純化基底及其制備方法。

具體而言，本發(fā)明的一個方面包括：通過選擇細胞相容性良好的殼聚糖構(gòu)筑三維納米結(jié)構(gòu)“軟”基底，并引入抗粘附分子降低細胞在界面上的非特異粘附，以及，利用CTC親和捕獲分子實現(xiàn)CTC細胞的高特異捕獲；隨后基于CTC與血液細胞增殖屬性差異，通過被捕獲細胞原位培養(yǎng)的方式進一步提高靶細胞的純度。

本發(fā)明的另一個方面包括：利用電噴低分子量殼聚糖稀溶液的方法構(gòu)筑結(jié)構(gòu)均一的殼聚糖納米粒子，然后將抗粘附分子，例如聚乙二醇(PEG)分子，通過化學(xué)反應(yīng)連接在殼聚糖納米粒子表面，而后將親和捕獲分子，例如上皮細胞黏附分子(EpCAM)適配體，與PEG分子結(jié)合，獲得所述基底。

本發(fā)明提供的CTC捕獲與純化基底具備良好的細胞相容性，能保持表面附著細胞的活性，且制備簡單經(jīng)濟，并能實現(xiàn)所捕獲CTC細胞的原位培養(yǎng)純化。

實施例1該基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制備方法的具體步驟如下：

a)采用低分子量殼聚糖在有機酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液。

b)將步驟a中殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中進行電噴0.1-4h，在玻璃基板表面制得殼聚糖納米粒子。通過調(diào)整電噴液性質(zhì)、電噴參數(shù)及電噴時間制得不同納米粒徑及密度的殼聚糖納米粒子表面P1、P2、P3、P4、P5。所制得的不同殼聚糖納米粒子表面結(jié)構(gòu)形貌見圖2。

c)將步驟b中的殼聚糖納米粒子表面置于氨水/甲醇溶液(氨水與甲醇的體積比為4:96)中靜止1-4h，而后置于真空干燥箱40-60℃干燥24h。得到未經(jīng)修飾的殼聚糖納米粒子基底A，即bare殼聚糖納米粒子基底。

d)將步驟c中的殼聚糖納米粒子表面置于2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后浸 入0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中12-24h，而后與0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH反應(yīng)液作用8-24h，將PEG分子接枝到殼聚糖表面。得到PEG修飾的殼聚糖納米粒子基底B，即PEG殼聚糖納米粒子基底。

e)在中性條件下，使0.1-10μM的適配體DNA-NH₂在活化羧基的偶聯(lián)試劑EDC/NHS(其中EDC的濃度為0.2mol/L，NHS的濃度為0.05mol/L)的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖進行偶聯(lián)。

f)將步驟e中的獲得殼聚糖納米粒子表面置于0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60分鐘，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團。得到適配體修飾的殼聚糖納米粒子基底C，即PEG-aptamer(PEG-DNA)殼聚糖納米粒子基底。其修飾流程圖如圖3所示。

實施例2以EpCAM陽性的乳腺癌細胞株MCF-7為模型細胞，考察了納米結(jié)構(gòu)表面P4對癌細胞的捕獲行為。圖4為3種不同修飾界面的P4表面對MCF-7細胞的不同捕獲行為。經(jīng)PEG-aptamer修飾的表面(圖4，a))細胞捕獲量最大，同時PEG修飾的表面(圖4，c))細胞粘附量最小。

實施例3以EpCAM陽性的乳腺癌細胞株MCF-7為模型細胞，系統(tǒng)地考察了不同微納米結(jié)構(gòu)表面對癌細胞的捕獲效率和特異性。同時，每種納米結(jié)構(gòu)表面均構(gòu)筑了未做任何修飾的bare界面和只做PEG修飾的界面作為對照。將已培養(yǎng)兩天而且生長狀態(tài)良好的MCF-7細胞利用0.25％的胰酶消化剝離，而后棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞懸液至10⁵/ml。將已修飾完成的納米基底置于24孔板中，向每個孔中注入1ml已配置的細胞懸液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育10-60min后，利用PBS清洗3-5次，利用熒光顯微鏡觀察捕獲到的細胞，并計數(shù)。實驗結(jié)果表明，在PEG修飾的表面上細胞粘附量雖略有增加但是明顯被抑制，即PEG的引入能夠有效的減少細胞的非特異性粘附(圖5a)。為了更為準確的評價各表面的細胞捕獲行為，圖5b，5c分別匯總了不同結(jié)構(gòu)PEG-aptamer表面與PEG表面細胞捕獲率的比值和不同結(jié)構(gòu)PEG表面與bare表面細胞捕獲率的比值，以更為細致準確的分析各表面細胞的特異性捕獲量和非特異性粘附情況。通過綜合比較最終選擇了P4表面作為接下來細胞捕獲基底的結(jié)構(gòu)模型，既保證了細胞的高效捕獲同時盡可能的抑制了細胞的非特異性粘附。

上述實驗結(jié)果表明，通過調(diào)控基底的表面納米結(jié)構(gòu)和界面性質(zhì)可以得到具備高效捕獲性能的3D納米結(jié)構(gòu)基底。

實施例4測試適配體的特異性

選擇了另外2種EpCAM-陽性細胞株P(guān)C-3和Sk-Br-3，2種EpCAM-陰性細胞株293T和CCRM-CEM以及新鮮提取的白細胞進行了細胞捕獲實驗。適配體的捕獲特異性的評估結(jié)果匯 總見圖6)實驗結(jié)果表明，適配體修飾的殼聚糖納米粒子表面對EpCAM-陽性細胞株均具有較高的捕獲效率而對EpCAM-陰性細胞株和人類白細胞的捕獲率均較低。

實施例5所述基底對混合細胞株捕獲特異性考察

首先制備白細胞溶液：采集靜脈血2ml注入盛有0.1ml肝素的試管中混勻，加入等體積的PBS等倍稀釋血液。吸取淋巴細胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。室溫2000r/min離心20min。管內(nèi)可分為四層，用毛細吸管輕輕吸出灰白色的單個核細胞，加入另一支已含有5ml PBS的離心管中，混勻。室溫下,以1500rpm離心10min，可去除混雜的血小板。棄上清，重復(fù)洗滌一次。用完全RPMI-16401ml定容，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞懸液至10⁶/ml。

向每毫升白細胞溶液中加入5,10,100,1000,10000個已預(yù)先用DIO染色的MCF-7細胞制備成混合細胞樣本待用。將修飾好的玻片安裝在4孔培養(yǎng)板中，每孔中加入1ml制備好的細胞懸液，置于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)30-45min后，用PBS清洗2-5次。利用熒光顯微鏡觀察捕獲到的細胞，并計數(shù)。

殼聚糖納米粒子表面對不同比例靶細胞的人工混合樣本的捕獲行為結(jié)果顯示適配體修飾的殼聚糖納米粒子表面對靶細胞的捕獲具有極高的特異性。尤其當靶細胞含量極低時，該表面對MCF-7細胞的捕獲率高達90％，而對白細胞的捕獲效率不足2％。實驗結(jié)果見圖7。

實施例6已捕獲混合細胞株的原位培養(yǎng)

對靶細胞量為10⁴(1mL含10⁶個白細胞)的溶液樣本進行了捕獲和原位培養(yǎng)(圖8a)。結(jié)果顯示，捕獲后的靶細胞純度大概為35％±5％。經(jīng)過兩天的原位培養(yǎng)我們可以觀察到，殼聚糖納米粒子表面的白細胞逐漸失去活性而被“淘汰”，同時靶細胞開始增殖。4天后，靶細胞的純度高達99％以上，實現(xiàn)了靶細胞的增殖純化。

對靶細胞數(shù)目極少(5-10個)的混合細胞樣本的捕獲和原位培養(yǎng)行為進行了考察(圖8b)。當靶細胞注入量為7時，7個細胞全部被捕獲且保持活性。2天后，白細胞開始失去活性逐漸被淘汰，而同時靶細胞開始增殖，7天后靶細胞數(shù)目達到200左右，其純度達到90％。

綜述之，本發(fā)明構(gòu)筑了具有良好細胞相容性的殼聚糖納米粒子表面(亦即前述的三維納米結(jié)構(gòu))，該表面具有較高的細胞捕獲特異性和靈敏度，且通過對已捕獲細胞的原位培養(yǎng)實現(xiàn)靶細胞的增殖純化。

上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。