本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)化脂肪酸衍生物生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)鏈二元酸是指碳鏈上含有10個(gè)以上碳原子的直鏈二元酸,是重要的化工原料。長(zhǎng)鏈二元酸制成的尼龍工程塑料具有極強(qiáng)的耐拉、耐磨、耐熱性及柔韌性，以此改造的汽車(chē)輪胎，使用壽命是普通汽車(chē)的5～10倍。長(zhǎng)鏈二元酸制成的潤(rùn)滑油不僅耐高溫，而且能耐特低溫。長(zhǎng)鏈二元酸制成的高檔服裝耐水洗、耐干洗，版型挺括。以長(zhǎng)鏈二元酸為原料制造的高級(jí)油漆，具有色澤光亮，耐磨，附著力強(qiáng)，柔韌，抗老化等特點(diǎn)，廣泛作為轎車(chē)、國(guó)防帳篷、軍用車(chē)輛及高級(jí)豪華物體表面涂漆等。由于長(zhǎng)鏈二元酸下游產(chǎn)品的優(yōu)良性能，直接促進(jìn)了我國(guó)精細(xì)化工行業(yè)飛速發(fā)展，下游行業(yè)對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸的需求不斷增長(zhǎng)。
目前，國(guó)內(nèi)所有生產(chǎn)企業(yè)都以石油中分離的長(zhǎng)鏈烷烴為原料生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，但是石油不可再生且我國(guó)石油嚴(yán)重依賴(lài)進(jìn)口。而脂肪酸及其衍生物屬于可再生原料，且末端已經(jīng)具有一個(gè)α-羧基，只需一步ω-氧化即可合成長(zhǎng)鏈二元酸，作為替代底物具有顯著優(yōu)勢(shì)，在節(jié)能環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。脂肪酸衍生物的物理化學(xué)性質(zhì)與長(zhǎng)鏈烷烴類(lèi)似，可以替代烷烴成為底物生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸。因此本發(fā)明采用脂肪酸衍生物為底物合成長(zhǎng)鏈二元酸。利用脂肪酸及其衍生物生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸是一個(gè)較新的領(lǐng)域，發(fā)酵技術(shù)與工藝尚不成熟。
催化烷烴合成長(zhǎng)鏈二元酸的細(xì)胞色素P450單加氧酶需要誘導(dǎo)，現(xiàn)有的長(zhǎng)鏈二元酸發(fā)酵工藝多采用3％～10％的重蠟油為誘導(dǎo)劑，但重蠟油會(huì)抑制細(xì)胞增殖。
另外，本領(lǐng)域存在多種補(bǔ)加葡萄糖提高烷烴轉(zhuǎn)化率的方法，例如，美國(guó)專(zhuān)利US6066480公開(kāi)了在流加烷烴或脂肪酸的同時(shí)，流加葡萄糖， 提高了底物轉(zhuǎn)化率。中國(guó)專(zhuān)利CN102994402A和CN1570124公開(kāi)了在長(zhǎng)鏈二元酸發(fā)酵過(guò)程的24h、48h、72h批次補(bǔ)加1％的葡萄糖，使不同鏈長(zhǎng)烷烴的重量轉(zhuǎn)化率達(dá)到了80％～90％之間(折合成烷烴的摩爾轉(zhuǎn)化率約為55％～67％之間)。但是全程流加葡萄糖或批次補(bǔ)加葡萄糖會(huì)造成細(xì)胞代謝流向改變，轉(zhuǎn)向利用葡萄糖進(jìn)行細(xì)胞繁殖，從而降低了生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效果不理想、葡萄糖添加時(shí)機(jī)不合適、長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)效率低的技術(shù)問(wèn)題，提供一種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效果理想、葡萄糖添加時(shí)機(jī)合適、脂肪酸衍生物轉(zhuǎn)化率高的轉(zhuǎn)化脂肪酸衍生物生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法。
為此，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化脂肪酸衍生物生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的方法，其采用脂肪酸衍生物為底物，用誘導(dǎo)劑脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯進(jìn)行誘導(dǎo)，在發(fā)酵初期，流加葡萄糖以供應(yīng)菌體生長(zhǎng)，在發(fā)酵產(chǎn)酸的時(shí)間段采用流速補(bǔ)加葡萄糖。
優(yōu)選地，長(zhǎng)鏈二元酸為具有10～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪族二元酸。
優(yōu)選地，長(zhǎng)鏈二元酸為十二碳二元酸。
優(yōu)選地，脂肪酸衍生物為脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸丙酯、以及其他含10～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸與含1～12個(gè)碳原子的直鏈脂肪醇合成的可溶于水的脂肪酸酯類(lèi)物質(zhì)。
優(yōu)選地，脂肪酸衍生物為月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸甘油酯，以及月桂酸與其他含1～12個(gè)碳原子的直鏈脂肪醇合成的可溶于水的脂肪酸酯類(lèi)物質(zhì)。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)劑的體積百分比濃度范圍為0.1％～5％之間。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)劑的體積百分比濃度范圍0.5％～1％之間。
優(yōu)選地，在0～14h補(bǔ)加的0.75g/mL葡萄糖的量為150～200ml。
優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)酸的時(shí)間段為48～96h之間，葡萄糖的流加速度為0.1～1g/L/h。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)的時(shí)間為搖瓶種子生長(zhǎng)期、罐上細(xì)胞生長(zhǎng)期或從搖瓶種子到罐上細(xì)胞生長(zhǎng)期全程。
優(yōu)選地，誘導(dǎo)的時(shí)間為從搖瓶種子到罐上細(xì)胞生長(zhǎng)期全程。
假絲酵母Candida sp.CGMCC 8927在標(biāo)準(zhǔn)的5-L發(fā)酵體系中、按照上面所述的發(fā)酵條件，發(fā)酵140-150h，可以生產(chǎn)至少145g/kg的十二碳二元酸，且達(dá)到80％以上的摩爾轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明涉及的假絲酵母Candida sp.CGMCC 8927，分類(lèi)命名為假絲酵母(Candida sp.)TDTC002；其保藏機(jī)構(gòu)為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期為2014年3月18日，保藏號(hào)編號(hào)為：CGMCC No.8927。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中所用到的試劑均從公開(kāi)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。
實(shí)施例1
(1)YPD固體平板培養(yǎng)基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨、2％的瓊脂。
(2)液體種子培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米漿40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自來(lái)水配制，月桂酸甲酯5％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110℃滅菌20min，接種前加入并混勻。
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀8～10g，酵母膏2～3g，玉米漿40～50g，葡萄糖15～20g，尿素1.2～2g，硝酸鉀6～8g，吐溫602～4g，泡敵2～4mL定容至1L，自然pH，121℃滅菌30min。其中葡萄糖和尿素單獨(dú)110℃滅菌20min，滅好菌后再合并混勻。
(4)平板培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，按照無(wú)菌操作從-80℃冰箱保存的凍存管中挑取假絲酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固體平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從YPD固體平板培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)理想的菌落再次劃線(xiàn)YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化。
(5)搖床培養(yǎng)：將二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含誘導(dǎo)劑的種子培養(yǎng)基中，混勻后分別取1ml接入不含誘導(dǎo)劑、含5％(v/v)月桂酸甲酯的50mL種子培養(yǎng)基中，29.5℃，220r/min搖床中培養(yǎng)，OD620達(dá)到10左右時(shí)，取3mL種子液接入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于29.5℃，220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，培養(yǎng)16-20h，當(dāng)OD620達(dá)到15.0以上時(shí)，調(diào)節(jié)pH至7.0～8.0之間，加入500μL月桂酸甲酯，之后間隔12h補(bǔ)加500μL月桂酸甲酯，并用2.5mol/L的NaOH將pH調(diào)至7.0～8.0之間，發(fā)酵過(guò)程共加入月桂酸甲酯3ml。96h調(diào)pH至9.0，測(cè)定十二碳二元酸產(chǎn)量。每組6個(gè)重復(fù)。
(6)搖瓶中十二碳二元酸總產(chǎn)量的測(cè)定：培養(yǎng)96h時(shí)，將各搖瓶pH調(diào)至9.0，11000r/min離心10min，取上清用稀硫酸調(diào)pH至3.0～3.5，抽濾得沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀至pH為中性。用無(wú)水乙醇溶解沉淀，并用0.1mol/L的NaOH進(jìn)行滴定，記錄達(dá)到滴定終點(diǎn)時(shí)消耗的NaOH的體積V。
DC12(g/L)＝0.05*V*230.3/30
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1
實(shí)施例2
(1)YPD固體平板培養(yǎng)基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的瓊脂。
(2)液體種子培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米漿40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自來(lái)水配制，月桂酸甲酯1％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110℃滅菌20min，接種前加入并混勻。
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀8～10g，酵母膏2～3g，玉米漿40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸鉀6～8g，吐溫602～4g，泡敵2～4mL定容至1L，自然pH，121℃滅菌30min。其中尿素單獨(dú)110℃滅菌20min，滅好菌后再合并混勻。葡萄糖配制成0.75g/ml葡萄糖溶液，105℃滅菌20min，發(fā)酵0-14h進(jìn)行流加。
(4)平板培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作從-80℃冰箱保存的凍存管中挑取假絲酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固體平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從YPD固體平板培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)理想的菌落再次劃線(xiàn)YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化。
(5)搖床培養(yǎng)：將二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含誘導(dǎo)劑的種子培養(yǎng)基中，混勻后分別取1ml接入含0％、1％、3％、5％月桂酸甲酯的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，置于29.5℃，220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12-16h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：1.80以上。再次分別轉(zhuǎn)入含0％、1％、3％、5％月桂酸甲酯的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二次培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：10.00以上。
(6)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將活化好的種子液按5％～10％接種量接入含1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L罐，溫度29.5℃，通風(fēng)量2L/min，培養(yǎng)時(shí)間為140h-150h，在發(fā)酵第0-14h之間流加150mL 0.75g/mL的葡萄糖溶液。發(fā)酵過(guò)程通過(guò)5mol/L的NaOH逐級(jí)調(diào)控pH，控制體系pH值在4.5～6.5之間以生長(zhǎng)菌體；進(jìn)入產(chǎn)酸期，控制體系pH值在7.2～8.2之間。攪拌轉(zhuǎn)速為300～600r/min，發(fā)酵過(guò)程中使溶氧保持在15～％25％。通過(guò)分批次補(bǔ)加的方式使發(fā)酵液中的底物濃度維持在3％～5％(v/v)之間。
(7)十二碳二元酸產(chǎn)量的測(cè)定：取適量混合均勻的發(fā)酵液，精密稱(chēng) 定(X)，稀釋4～5倍，充分?jǐn)嚢琛⑺岢林羛H 3.0，抽濾收集沉淀，70℃干燥后，稱(chēng)重(Xs)，研成粉末。精密稱(chēng)定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸標(biāo)品100mg±2mg(Ws)，分別用甲醇定容至10mL，并超聲處理10min。離心，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件如下：Luna 5μmC8(2)柱，進(jìn)樣量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脫，起始乙腈體積比為30％，20min時(shí)達(dá)到100％；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。分別記錄所測(cè)樣品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面積S和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積Ss。根據(jù)以下公式計(jì)算發(fā)酵液中二元酸的濃度(g/g)。
月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化率和十二碳二元酸的產(chǎn)量如表2
實(shí)施例3
(1)YPD固體平板培養(yǎng)基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的瓊脂。
(2)液體種子培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米漿40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自來(lái)水配制，月桂酸甲酯1％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110℃滅菌20min，接種前加入并混勻。
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀8～10g，酵母膏2～3g，玉米漿40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸鉀6～8g，吐 溫602～4g，泡敵2～4mL定容至1L，自然pH，121℃滅菌30min。其中尿素單獨(dú)110℃滅菌20min，滅好菌后再合并混勻。葡萄糖配制成0.75g/mL的葡萄糖溶液，105℃滅菌20min，發(fā)酵0-14h進(jìn)行流加。
(4)平板培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作從-80℃冰箱保存的凍存管中挑取假絲酵母(Candida sp.)TDTC002于YPD固體平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從YPD固體平板培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)理想的菌落再次劃線(xiàn)YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化。
(5)搖床培養(yǎng)：將二次活化YPD平板上的菌落刮入30ml不含誘導(dǎo)劑的種子培養(yǎng)基中，混勻后，a)取1ml接入不含月桂酸甲酯的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，作為從發(fā)酵罐細(xì)胞生長(zhǎng)期開(kāi)始誘導(dǎo)組的一級(jí)種子；b)分別取1ml接入含1％的月桂酸甲酯的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，作為僅種子誘導(dǎo)組和從種子開(kāi)始誘導(dǎo)組的一級(jí)種子。置于29.5℃，220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12-16h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：1.80以上。再次分別對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二次培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：10.00以上。
(6)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將活化好的種子液按5％～10％接種量接入含1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L罐，分別向從發(fā)酵罐細(xì)胞生長(zhǎng)期開(kāi)始誘導(dǎo)組和從種子開(kāi)始誘導(dǎo)組中加入1％的月桂酸甲酯進(jìn)行誘導(dǎo)。溫度29.5℃，通風(fēng)量2L/min，培養(yǎng)時(shí)間為140h-150h，在發(fā)酵第0-14h之間流加150mL0.75g/mL的葡萄糖溶液。發(fā)酵過(guò)程通過(guò)5mol/L的NaOH逐級(jí)調(diào)控pH，控制體系pH值在4.5～6.5之間以生長(zhǎng)菌體；進(jìn)入產(chǎn)酸期，控制體系pH值在7.2～8.2之間。攪拌轉(zhuǎn)速為300～600r/min，發(fā)酵過(guò)程中使溶氧保持在15％～25％。通過(guò)分批次補(bǔ)加的方式使發(fā)酵液中的底物濃度維持在3％～5％(v/v)之間。
(7)十二碳二元酸產(chǎn)量的測(cè)定：取適量混合均勻的發(fā)酵液，精密稱(chēng)定(X)，稀釋4～5倍，充分?jǐn)嚢琛⑺岢林羛H 3.0，抽濾收集沉淀，70℃干燥后，稱(chēng)重(Xs)，研成粉末。精密稱(chēng)定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸標(biāo)品100mg±2mg(Ws)，分別用甲醇定容至10mL，并超聲處理10min。離心，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件如下： Luna 5μmC8(2)柱，進(jìn)樣量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脫，起始乙腈體積比為30％，20min時(shí)達(dá)到100％；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。分別記錄所測(cè)樣品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面積S和標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積Ss。根據(jù)以下公式計(jì)算發(fā)酵液中二元酸的濃度(g/g)。
月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化率和十二碳二元酸的產(chǎn)量如表3
實(shí)施例4
(1)YPD固體平板培養(yǎng)基：1％的酵母粉、2％的葡萄糖、2％的蛋白胨，2％的瓊脂。
(2)液體種子培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀7～9g，酵母膏1.5～2g，玉米漿40～50g，葡萄糖7～12g，尿素1～2g，自來(lái)水配制，月桂酸甲酯0.8％(v/v)，自然pH，定容至1L。其中月桂酸甲酯、蔗糖和尿素分開(kāi)單獨(dú)110℃滅菌20min，接種前加入并混勻。
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀8～10g，酵母膏2～3g，玉米漿40～50g，葡萄糖100～120g，尿素1.2～2g，硝酸鹽6～8g，吐溫602～4g，泡敵2～4mL定容至1L，自然pH，121℃滅菌30min。其中尿素單獨(dú)110℃滅菌20min，滅好菌后再合并混勻。葡萄糖配制成0.75g/ml的葡萄糖溶液，105℃滅菌20min，發(fā)酵0-14h進(jìn)行流加。另配 制0.5g/ml的葡萄糖溶液，105℃滅菌20min，發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程的特定時(shí)段以不同的方式進(jìn)行補(bǔ)加。
(3)平板培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作從-80℃冰箱保存的凍存管中挑取假絲酵母(Candida sp.)TDTC002YPD于固體平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從YPD固體平板培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)理想的菌落再次劃線(xiàn)YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化。
(4)搖床培養(yǎng)：從二次活化YPD平板上挑取生長(zhǎng)理想的菌落接入液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，置于29.5℃，220r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12-16h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：1.80以上。再次轉(zhuǎn)入種子液中進(jìn)行二次培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14h，鏡檢：無(wú)雜菌污染，OD620：10.00以上。
(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將活化好的二級(jí)種子液按5％～10％接種量接入含1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L罐，加入0.8％的月桂酸甲酯，溫度29.5℃，通風(fēng)量2L/min，培養(yǎng)時(shí)間為140h-150h，在發(fā)酵第0-14h之間流加200mL 0.75g/mL的葡萄糖溶液。發(fā)酵過(guò)程通過(guò)5mol/L的NaOH逐級(jí)調(diào)控pH，控制體系pH值在4.5～6.5之間以生長(zhǎng)菌體；進(jìn)入產(chǎn)酸期，控制體系pH值在7.2～8.2之間。攪拌轉(zhuǎn)速為300～600r/min，發(fā)酵過(guò)程中使溶氧保持在15％～25％。通過(guò)分批次補(bǔ)加的方式使發(fā)酵液中的底物濃度維持在3％～5％(v/v)之間。并在產(chǎn)酸期分別按以下策略補(bǔ)加葡萄糖：a)以0.1～2g/L/h的流速全程流加；b)在24h、48h或72h中任選一個(gè)時(shí)間點(diǎn)一次性補(bǔ)加葡萄糖30g；c)以1g/L/h速度在以下時(shí)間段中任選一個(gè)時(shí)間段進(jìn)行流加：24～48h、24～72h、48～72h、48～96h、60～84h、60～108h。
(6)十二碳二元酸產(chǎn)量的測(cè)定：取適量混合均勻的發(fā)酵液，精密稱(chēng)定(X)，稀釋4～5倍，充分?jǐn)嚢?、酸沉至pH 3.0，抽濾收集沉淀，70℃干燥后，稱(chēng)重(Xs)，研成粉末。精密稱(chēng)定粉末100mg±2mg(W1g)和十二碳二元酸標(biāo)品100mg±2mg(Ws)，分別用甲醇定容至10mL，并超聲處理10min。離心，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件如下：Luna 5μmC8(2)柱，進(jìn)樣量20μL，流速1mL/min；水-乙腈梯度洗脫，起始乙腈體積比為30％，20min時(shí)達(dá)到100％；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。分別記錄所測(cè)樣品的二元酸峰(10.6min-10.8min)的峰面積S和 標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積Ss。根據(jù)以下公式計(jì)算發(fā)酵液中二元酸的濃度(g/g)。
月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化率和十二碳二元酸的產(chǎn)量如下表4、表5、表6所示：
實(shí)施例5轉(zhuǎn)化月桂酸乙酯生產(chǎn)十二碳二元酸
按照實(shí)施案例4的方法，底物采用月桂酸乙酯，用0.5％的月桂酸乙酯進(jìn)行誘導(dǎo)，在發(fā)酵0-14h流加150mL 0.75g/mL的葡萄糖供應(yīng)菌體生長(zhǎng)。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖耗盡時(shí)，加入100ml月桂酸乙酯進(jìn)入產(chǎn)酸階段。發(fā)酵過(guò)程中保持月桂酸乙酯的濃度為3％～5％(v/v),用5M的NaOH自動(dòng)流加控制pH。在發(fā)酵第48-72h間，以0.5g/L/h的速度流加0.5g/mL的葡萄糖溶液。發(fā)酵時(shí)間為144h。月桂酸乙酯的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到83.39％，十二碳二元酸的濃度為151g/kg。