本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，揭示了兩個新穎tetramic acid類生物堿的制備方法及具降脂用途。

背景技術(shù)：

高血脂癥是代謝綜合癥疾病中的一種，因其能夠?qū)е聞用}粥樣硬化、冠心病等心血管疾病，并呈現(xiàn)發(fā)病率逐年升高，人口年輕化趨勢。降血脂藥物已成為新藥研究的重點方向之一。目前臨床經(jīng)常使用的降血脂藥物主要有他汀類、貝特類、煙酸類，以及膽酸螯合劑類等。雖然具有較好的治療效果，但也存在一定的不良反應(yīng)。如他汀類大劑量服用后會產(chǎn)生肌肉毒性并升高肝轉(zhuǎn)氨酶，貝特類及鹽酸類藥物會引起胃腸道不適、肝腎損傷等。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的不斷加快、生活壓力的不斷加大，飲食結(jié)構(gòu)的不合理現(xiàn)象增多，以及食品安全衛(wèi)生等問題的日益嚴(yán)峻，高血脂癥疾病的發(fā)病幾率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，因此研制高效、低毒的全新靶點降脂新藥具有重要的社會意義。

專利發(fā)明者通過前期研究，從一株海洋真菌Eurotium intermedium中發(fā)現(xiàn)了兩個化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎的tetramic acid類生物堿，并通過體外藥理活性篩選，首次發(fā)現(xiàn)該類生物堿具有顯著降脂活性，具有進(jìn)一步開發(fā)成新型降脂藥物的潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供兩個新穎結(jié)構(gòu)的teramic acid類生物堿。

本發(fā)明的另一目的在于提供該類生物堿的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于揭示該類生物堿的降脂用途。

在本發(fā)明的第一方面提供式I和式II所示化合物，其藥學(xué)上可接受的鹽或它們的混合物的用途，用于制備藥物，所述藥物用于預(yù)防或治療高血脂癥疾病。

本發(fā)明的第二方面提供上述生物堿的制備方法，包括如下步驟：

1)以海洋來源Eurotium intermedium為菌種，利用液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含上述生物堿的發(fā)酵物；

2)將發(fā)酵物萃取，萃取物用硅膠、凝膠、ODS等色譜手段分離與純化，在同一發(fā)酵物中制備上述生物堿。

本發(fā)明中各生物堿的降脂活性通過以下藥學(xué)實驗得到證明：

1)使用人肝癌細(xì)胞，建立脂質(zhì)堆積細(xì)胞模型，評價發(fā)明中各生物堿的降脂活性。

2)使用人肝癌細(xì)胞，建立脂質(zhì)堆積細(xì)胞模型，評價發(fā)明中各生物堿對細(xì)胞內(nèi)膽固醇(TC)及甘油三酯(TG)合成的抑制作用。

附圖說明

圖1：式I和式II化合物對膽固醇(TC)的影響

圖2：式I和式II化合物對甘油三酯(TG)的影響

圖3：油紅O染色實驗

圖4：式I化合物的¹H NMR譜

圖5：式I化合物的APT譜

圖6：式I化合物的高分辨質(zhì)譜

圖7：式II化合物的¹H NMR譜

圖8：式II化合物的APT譜

圖9：式II化合物的高分辨質(zhì)譜

具體實施方案：

本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容，是為了讓本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下述實施方案僅作示例。

實例1：式I和式II化合物的制備

利用固體培養(yǎng)基對菌株Eurotium intermedium進(jìn)行發(fā)酵，固體培養(yǎng)基的制備方法為：將100mL人工海水與100g大米加入500mL三角瓶中，靜置12h，后于121℃高壓濕熱滅菌30min，放涼待用。菌株發(fā)酵方法為：在PDA(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂)培養(yǎng)皿上挑取長有新鮮E.intermedium的瓊脂片(1～2cm²)，接種于大米培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30瓶，25℃下避光恒溫培養(yǎng)25d，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

發(fā)酵產(chǎn)物搗碎后用乙酸乙酯超聲萃取3次，每次1.5h，減壓濃縮得粗浸膏(51.4g)。浸膏用等比例硅膠(160～200目)扮樣，利用減壓硅膠柱色譜以石油醚/丙酮為流動相梯度洗脫。以石油醚/丙酮(20∶1，v/v)洗脫三個柱體積，后用石油醚/丙酮(10∶1，v/v)洗脫，得到白色粉末(5.2g)。取五分之一(約1g)該白色粉末，溶于2mL甲醇，利用半制備高效液相色譜以74％乙腈/水(v/v)為流動相洗脫純化，得到式I化合物(6.4mg)，式II化合物(10.6mg)。

實例2：式I和式II化合物的降脂活性實驗：

試驗材料：式I和式II化合物，油酸，油紅O，試劑盒(總膽固醇TC、總甘油三酯TG)

細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株HepG2

試驗方法：

發(fā)明中化合物的脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用

取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、計數(shù)，以適宜濃度接種到已放入無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h小時至細(xì)胞完全貼壁。細(xì)胞生長匯合至70％-80％時，用100μM不飽和脂肪酸-油酸(OA)刺激細(xì)胞制成脂質(zhì)堆積模型；給藥組同時給予不同濃度的式I和式II化合物(1μmol/L)；陽性藥組給予辛伐他汀(1μmol/L)。24h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，加4％多聚甲醛在4℃固定12h。每孔加油紅O工作液20μL室溫染色15min，PBS洗凈油紅工作液，每孔加DMSO 150μL微升溶解附著脂質(zhì)上染料， 酶標(biāo)儀358nm波長下測定OD值。

發(fā)明中化合物對脂質(zhì)堆積模型細(xì)胞內(nèi)TC、TG含量的影響

1)細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞分為空白組、模型組、給藥組式I和式II化合物(1μmol/L)、陽性藥組辛伐他汀(1μmol/L)，除空白組外，其它組需添加油酸100mmol/L共孵育24小時.。

2)細(xì)胞內(nèi)TC測量

棄去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，收集細(xì)胞于管中；加200μL氯仿∶異丙醇∶NP40(7∶11∶0.1)，超聲裂解細(xì)胞；13000r/min離心15min，取上清于新管中50℃烘1h，以除去氯仿；將樣品放于真空濃縮離心機(jī)中抽干，除去剩余有機(jī)溶劑。試劑盒測定樣品中TC含量，樣品加200μL Assay Buffer溶解，具體操作見Cholesterol/Cholesteryl Ester Quantitation Kit(BioVision)說明書。BCA試劑盒測定樣品中蛋白含量。

3)細(xì)胞內(nèi)TG含量測定

收集細(xì)胞(約107個)，加300μL 5％NP-40超聲破碎細(xì)胞；將樣品放到80-100℃水浴中緩慢加熱2～5min至樣品變渾濁，冷卻至室溫，重復(fù)3次。于12000r/min離心2min，取上清于新管中，加適量去離子水稀釋樣品。試劑盒測定樣品中TG含量，具體操作按Triglyceride Quantification Kit(BioVision)說明書進(jìn)行。BCA試劑盒測定樣品蛋白含量。

實驗結(jié)果：用不飽和脂肪酸建立脂質(zhì)堆積模型對式I和式II化合物降脂活性進(jìn)行了研究，以辛伐他汀為陽性對照藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)式I和式II化合物具有較好的降脂活性，對細(xì)胞內(nèi)的總膽固醇(TC)和總甘油三酯(TG)均具有明顯降低作用(見附圖1-3，其中數(shù)值平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，***P＜0.001，脂質(zhì)堆積模型組vs正常對照組；+P＜0.05，++P＜0.01，+++P＜0.001，給藥組vs脂質(zhì)堆積模型組)。