本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了沼澤紅假單胞菌分離與擴(kuò)大培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria，簡稱PSB)是地球上最早出現(xiàn)具有原始光能合成體系的原核生物，是一大類在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌的總稱，為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于地球生物圈的各處。光合細(xì)菌菌體無毒，蛋白質(zhì)含量高達(dá)60％，含B族維生素、輔酶Q和類胡蘿卜素。因其特有的固氮、吸氫、固碳、利用硫化物等的新陳代謝方式而具有降解水中亞硝、氨氮及凈化水質(zhì)的作用。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度不斷提高，水質(zhì)惡化使病原微生物種類增多、傳播速度加快，導(dǎo)致水產(chǎn)生物病害發(fā)生日趨頻繁，最終給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前市場上出現(xiàn)各式各樣的光合細(xì)菌制劑，但是很多產(chǎn)品出現(xiàn)光合細(xì)菌濃度不夠、顏色不鮮艷或包裝桶底部含有大量的菌體沉淀的問題，因此，篩選出優(yōu)良的具有生物修復(fù)功能的光合細(xì)菌菌種并且實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種沼澤紅假單胞菌分離與擴(kuò)大培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供的用于分離沼澤紅假單胞菌的富集培養(yǎng)基，每L培養(yǎng)基含有：NaHCO₃1～3g，酵母粉0.5～1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-0.3g，NH₄Cl 0.5-2g，NaAc 0.2g-0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g，NaCl 1-3g，Na₂S₂O₃·5H₂O 0.5～1g。

本發(fā)明提供的用于分離沼澤紅假單胞菌的分離培養(yǎng)基，其為在所述的富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0-2.0％的瓊脂。

本發(fā)明提供的用于沼澤紅假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)基每L培養(yǎng)基含有：CaCl₂0.1～0.5g，KH₂PO₄0.5～1.0g，NH₄Cl 0.5-2.0g，MgCl₂·6H₂O 0.3-1.0g，NaCl 0.5-2.0g，NaAc·3H₂O 0.5～1.0g，丁二酸鈉0.5～1.0g,酵母粉0.1～0.5g，蛋白胨0.1～0.3g，維生素B₁0.001g，維生素B₃0.001g，維生素B₇0.01-0.03mg，H₃BO₃1.0-3.0mg，MnSO₄·H₂O 1.0-2.0mg，NaM_OO₄·2H₂O 0.5-1.5mg，Cu(NO₃)₂·3H₂O0.02-0.05mg，ZnSO₄·7H₂O 0.1-0.3mg。

本發(fā)明還提供一種沼澤紅假單胞菌的富集分離純化方法，其包括如下步驟

⑴取自然池塘邊的濕潤泥土樣品與權(quán)利要求1所述的富集培養(yǎng)基按重量體積比1:20混合于厭氧管中，上面覆蓋1-2cm石蠟油，30℃，1000-2000lx光照厭氧培養(yǎng)至培養(yǎng)液變紅；

⑵富集一周后，從培養(yǎng)基變紅的厭氧管中取出1mL液體，取稀釋度為10^-3、10^-4，10^-5的液體100μL涂板；

⑶觀察平板菌落生長狀況，7-10天可以見到紅色針尖狀菌落，及時(shí)將菌落挑出劃線純化2-3次，放于光照厭氧箱培養(yǎng)。

用本發(fā)明中擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的光合菌劑原料成本低、菌體生長迅速，顏色鮮艷，液體菌劑穩(wěn)定、均勻、無沉淀，純度達(dá)到90％以上，目標(biāo)活菌數(shù)可以達(dá)到10⁹cfu/ml以上，是現(xiàn)有培養(yǎng)基的7-15倍。

附圖說明

圖1沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的菌落圖。

圖2所示為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)發(fā)酵液。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明中所涉及到的實(shí)驗(yàn)器材和試劑如下所示：

超凈臺(tái)：蘇凈安泰SW-CJ-2FD型

生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SPX-250B-X型

分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司721N型

顯微鏡：OLIMPUS CX31型

光照厭氧操作箱：Thermo SCIENTIFIC Forma Anaerobic system

其他試劑購自北京智博鼎盛生物科技有限公司。

實(shí)施例1

1.配制光合細(xì)菌培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(/L)：NaHCO₃2g，酵母粉1g，K₂HPO₄·3H₂O0.2g，NH₄Cl 1g，NaAc·3H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，Na₂S₂O₃·5H₂O 1g，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。

分離培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂，最終質(zhì)量分為1.5％，121℃高壓滅菌20min。

維生素母液配制如下：各稱量VB1、VB3、VB71g、1g、0.015g溶于100mL水中，0.2μm孔徑的薄膜濾菌器過濾除菌，用時(shí)每L取100μl；

微量元素母液配制如下：

各稱取H₃BO₃0.7g、MnSO₄·H₂O 0.3898g、NaM_OO₄·2H₂O0.188g、Cu(NO₃)₂·3H2O 0.01g、ZnSO₄·7H₂O 0.06g溶于250mL水中，121℃滅菌20min，用時(shí)每L取100mL。

擴(kuò)大培養(yǎng)基(/L)：CaCl₂0.1g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1g，NaAc·3H₂O 1g，二水合丁二酸鈉1g，酵母粉0.1g，蛋白胨0.1g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

2.富集：

取自然池塘邊的濕潤泥土樣品1g與所述的富集培養(yǎng)基20ml混合于厭氧管中，上面覆蓋1-2cm石蠟油，30℃，1000-2000lx光照厭氧培養(yǎng)至培養(yǎng)液變紅；

富集一周后，從培養(yǎng)基變紅的厭氧管中取出1mL液體，取稀釋度為10^-3、10^-4，10^-5的液體100μL涂布分離培養(yǎng)基平板，10天左右觀察到有紅色菌落長出；挑出紅色菌落平板畫線至純。

3.鑒定

挑取單菌落進(jìn)行16S rRNA菌落PCR，送Invitrogen測序。測得序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對，初步鑒定為沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustri，與沼澤紅假單胞菌R.palustris ATCC17003的16S rRNA基因相似性距離為100％。該菌的菌落圖如圖1所示：生長緩慢，5天可出現(xiàn)單菌落，大小0.5mm～1mm；厭氧狀態(tài)下為暗紅色菌落，革蘭氏染色為陰性短桿狀，固體平板培養(yǎng)為短桿狀。

將分離到沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2014年5月8日，保藏編號(hào)分別為：CGMCC No.9136。

4.擴(kuò)大培養(yǎng)

在含4.5L培養(yǎng)基的桶中接種10％的種子液，封蓋，放于紙箱中，每箱6桶，箱內(nèi)懸掛一盞60W白熾燈，培養(yǎng)4天后菌液變?yōu)轷r紅色。之后用10桶各5L培養(yǎng)好的種子液接種于含有1噸培養(yǎng)基的透明塑料薄膜管中，兩端密封，光照培養(yǎng)5～6天左右，分裝至5L桶中(圖2)。

對比例1擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制及比較

1.沼澤紅假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制(/L)：

CaCl₂0.1g，KH₂PO₄1.0g，NH₄Cl0.5g，MgCl₂·6H₂O0.3g， NaCl 1g，NaAc·3H₂O 0.5g，二水合丁二酸鈉1g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.1g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

2.本發(fā)明中用的擴(kuò)大培養(yǎng)基與現(xiàn)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較

2.1本發(fā)明中的擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟

(1)按照培養(yǎng)基配方稱取各個(gè)組分，其中維生素母液過濾除菌，微量元素母液與其他培養(yǎng)基組分單獨(dú)滅菌，滅完后微量元素母液每升加1mL，維生素母液每升加100μl。

(2)將滅好菌的培養(yǎng)基分裝至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每桶4.5L，接種CGMCC No.9136種子液500mL，封蓋。置于紙箱中白熾燈光照培養(yǎng)4天，可以作為下一步大規(guī)模培養(yǎng)的種子液。

(3)稱量1噸培養(yǎng)液所需要的各個(gè)成分，先用少量自來水完全溶解，再與剩下的自來水充分混合于一端已經(jīng)封好、長度2m的透明塑料薄膜管中，接種10桶光合細(xì)菌種子液，上方均勻懸掛白熾燈若干。光照培養(yǎng)5天，得到高純度的光合細(xì)菌菌液，分裝于5L桶中封蓋即可。

2.2對照實(shí)驗(yàn)

(1)通用光合菌RCVBN培養(yǎng)基成分(/L)：

D-L蘋果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

按照培養(yǎng)基成分稱量所需養(yǎng)分，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

將滅菌的培養(yǎng)液分裝至已消毒5L桶中，種子液接種量10％，放于紙箱中光照培養(yǎng)5天。

2.3效果比較

以得到光合菌液的純度和目標(biāo)活菌數(shù)作為比較指標(biāo)，應(yīng)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度為80％，活菌數(shù)為5.3×10⁸cfu/mL，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度可達(dá)到90％，活菌數(shù)可以達(dá)到3.8×10⁹cfu/mL，提高了近7倍，此外從外觀上觀察菌液也更加的鮮艷。

對比例2擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制及比較

1.沼澤紅假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制(/L)：

CaCl₂0.5g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1.0g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1.0g，NaAc·3H₂O 1.0g，二水合丁二酸鈉0.8g，酵母粉0.2g，蛋白胨0.2g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

2.本發(fā)明中用的擴(kuò)大培養(yǎng)基與現(xiàn)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較

2.1本發(fā)明中的擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟

(1)按照培養(yǎng)基配方稱取各個(gè)組分，其中維生素母液過濾除菌，微量元素母液與其他培養(yǎng)基組分單獨(dú)滅菌，滅完后微量元素母液每升加1mL，維生素母液每升加100μl。

(2)將滅好菌的培養(yǎng)基分裝至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每桶4.5L，接種CGMCC No.9136種子液500mL，封蓋。置于紙箱中白熾燈光照培養(yǎng)4天，可以作為下一步大規(guī)模培養(yǎng)的種子液。

(3)稱量1噸培養(yǎng)液所需要的各個(gè)成分，先用少量自來水完全溶解，再與剩下的自來水充分混合于一端已經(jīng)封好、長度2m的透明塑料薄膜管中，接種10桶光合細(xì)菌種子液，上方均勻懸掛白熾燈若干。光照培養(yǎng)5天，得到高純度的光合細(xì)菌菌液，分裝于5L桶中封蓋即可。

2.2對照實(shí)驗(yàn)

(1)通用光合菌RCVBN培養(yǎng)基成分(/L)：

D-L蘋果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

按照培養(yǎng)基成分稱量所需養(yǎng)分，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

將滅菌的培養(yǎng)液分裝至已消毒5L桶中，種子液接種量10％，放于紙箱中光照培養(yǎng)5天。

2.3效果比較

以得到光合菌液的純度和目標(biāo)活菌數(shù)作為比較指標(biāo)，應(yīng)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度為80％，活菌數(shù)為6.1×10⁸cfu/mL，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度可達(dá)到93％，活菌數(shù)可以達(dá)到6.5×10⁹cfu/mL，提高了近10倍，此外從外觀上觀察菌液也更加的鮮艷。

對比例3擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制及比較

1.沼澤紅假單胞菌擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制(/L)：

CaCl₂0.3g，KH₂PO₄0.6g，NH₄Cl 1.5g，MgCl₂·6H₂O 0.8g，NaCl 1.5g，NaAc·3H₂O 1.0g，二水合丁二酸鈉0.5g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.1g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

2.本發(fā)明中用的擴(kuò)大培養(yǎng)基與現(xiàn)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)效果比較

2.1本發(fā)明中的擴(kuò)大培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟

(1)按照培養(yǎng)基配方稱取各個(gè)組分，其中維生素母液過濾除菌，微量元素母液與其他培養(yǎng)基組分單獨(dú)滅菌，滅完后微量元素母液每升加1mL，維生素母液每升加100μl。

(2)將滅好菌的培養(yǎng)基分裝至5L已用酒精消毒的塑料桶中，每 桶4.5L，接種CGMCC No.9136種子液500mL，封蓋。置于紙箱中白熾燈光照培養(yǎng)4天，可以作為下一步大規(guī)模培養(yǎng)的種子液。

(3)稱量1噸培養(yǎng)液所需要的各個(gè)成分，先用少量自來水完全溶解，再與剩下的自來水充分混合于一端已經(jīng)封好、長度2m的透明塑料薄膜管中，接種10桶光合細(xì)菌種子液，上方均勻懸掛白熾燈若干。光照培養(yǎng)5天，得到高純度的光合細(xì)菌菌液，分裝于5L桶中封蓋即可。

2.2對照實(shí)驗(yàn)

(1)通用光合菌RCVBN培養(yǎng)基成分(/L)：

D-L蘋果酸4g，MgSO₄·6H₂O 0.12g，(NH₄)₂SO₄4g，CaCl₂0.075g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，EDTA-Na 0.02g，維生素母液100μl，微量元素母液1mL。

(2)培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

按照培養(yǎng)基成分稱量所需養(yǎng)分，pH6.8，121℃高壓滅菌20min。

將滅菌的培養(yǎng)液分裝至已消毒5L桶中，種子液接種量10％，放于紙箱中光照培養(yǎng)5天。

2.3效果比較

以得到光合菌液的純度和目標(biāo)活菌數(shù)作為比較指標(biāo)，應(yīng)用RCVBN培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度為80％，活菌數(shù)為5.5×10⁸cfu/mL，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)出的光合細(xì)菌純度可達(dá)到93％，活菌數(shù)可以達(dá)到8.1×10⁹cfu/mL，提高了近15倍，此外從外觀上觀察菌液也更加的鮮艷。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。