一種改善碳纖維表面親水性的方法，具體涉及碳纖維表面利用強氧化劑進行氧化改性增強親水性的方法，并作為載體應(yīng)用于細胞固定化的多批式發(fā)酵生產(chǎn)中。

背景技術(shù)：

固定化細胞的使用能夠緩解胞內(nèi)酶的隔離和凈化過程中多余的耗時和復(fù)雜的步驟，且能夠防止微生物細胞被稀釋于開放的水域系統(tǒng)中。載體材料為微生物提供外部保護和足夠的孔隙空間，并為微生物細胞的生存和功能性輸出創(chuàng)造了有利條件，因此受到越來越多的關(guān)注。目前，許多研究人員致力于在不同固定化載體上以維持高性能、高持久性的細胞活性為前提進行高效、連續(xù)發(fā)酵。因此，對于載體的選擇至關(guān)重要，且載體表面的性質(zhì)影響細胞的生長和新陳代謝。一個具有理想表面性質(zhì)的固定化載體不僅具有適當?shù)奈锢韺傩允辜毎軌蛄己玫恼掣?，而且所選擇的的載體應(yīng)該為降低生產(chǎn)成本的可生物降解材料。

碳具有良好的生物相容性并廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物工程、材料等領(lǐng)域，以碳基材料作為固定化載體具有廣闊的發(fā)展前景。碳纖維本身具備優(yōu)良的生物相容性，已應(yīng)用于骨替代品、固定骨碎片等醫(yī)療方面；并且其自身對細菌擁有較好的吸附性，已經(jīng)應(yīng)用于碳纖維生物膜進行細菌吸附高效率的治理廢水的研究中。因此，將碳纖維作為載體應(yīng)用于細胞固定化的發(fā)酵生產(chǎn)中是可以實現(xiàn)的。細胞固定化階段中，潤濕性、表面張力、極性、形態(tài)和粗糙度等材料表面性質(zhì)影響細胞的粘附性能。若想取得最優(yōu)的表面性質(zhì)，通常會對載體材料進行改性操作。一些報道表明，微生物細胞的粘附能力隨著材料表面的親水性增加而得以改善。

碳纖維作為一種具有非極性表面的新型纖維材料，通過對表面含氧官能團的改性達到提高碳纖維親水性和生物相容性的目的。本發(fā)明采用硝酸、硫酸或雙氧水等強氧化劑對碳纖維表面的含氧官能團進行氧化處理，提高碳纖維表面親水性及生物相容性。目前對于氧化改性后的碳纖維作為固定化載體應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)的報道較少，本發(fā)明將采用改性碳纖維作為固定化載體，投入到細胞固定化的多批式發(fā)酵生產(chǎn)中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是，提供一種氧化改性后的碳纖維材料作為細胞的固定化載體，由此可顯著增強固定化載體的親水性及生物相容性，提高固定化細胞多批式發(fā)酵的產(chǎn)率。

一種碳纖維的改性方法及應(yīng)用，具體步驟如下：

（1）碳纖維的表面清洗：將碳纖維利用3-5倍碳纖維體積的有機試劑，然后用4-6倍碳纖維體積的去離子水洗掉殘留的有機試劑，烘干備用；

（2）碳纖維的表面改性：將表面清洗后的碳纖維浸泡在3-5倍碳纖維體積的強氧化劑中0.5-6 h，然后將強氧化劑倒入試劑回收桶內(nèi)，并用4-6倍碳纖維體積的去離子水清洗掉碳纖維表面殘留的試劑，烘干備用；

（3）改性碳纖維的應(yīng)用：將改性后的碳纖維按照5-25g/L的加入量加入到培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)液并接種后進行多批式發(fā)酵生產(chǎn)。

進一步，所述的碳纖維為布狀或0.4cm以上的束狀的200T、300T、700T級的PAN基碳纖維。

進一步，所述的碳纖維選用2k、3k、6k、12k、24k、補強布等紡織型碳纖維布或碳纖維束。

進一步，所述的碳纖維是利用3-4倍倍丙酮和石油醚等有機試劑浸泡5-10 h，對碳纖維絲束進行索氏提取以達到表面清洗的目的。

進一步，所述的碳纖維在清洗之后需放入100℃的烘箱中先進行烘干1-3 h；改性后的碳纖維需進行同樣的烘干操作。

進一步，所述的碳纖維是利用3-5倍碳纖維體積的濃度為62%-78%濃硝酸、濃硫酸或25-40%的雙氧水等進行0.5h、1h、2 h、3h、4 h、6 h的改性。

進一步，所述的碳纖維在進行表面改性之后將用過的強氧化劑倒入試劑回收桶內(nèi)，并用4-6倍碳纖維體積的去離子水反復(fù)清洗4-6次，去掉表面殘留的試劑。

進一步，所述的碳纖維改性方法為一種碳纖維表面的氧化改性方法。

進一步，所述的碳纖維改性方法主要是利用強氧化劑改性后引入含氧官能團。

進一步，所述的碳纖維在進行氧化改性之后由疏水性變?yōu)橛H水性，改性后碳纖維表面接觸角由無接觸角變?yōu)?0-120°，表面氧官能團由6.32-9.21%增加至16.9-22.32%。

進一步，所述的碳纖維在經(jīng)過強氧化劑改性之后，碳纖維表面粗糙度增加，比表面積增加至26.23-32.67㎡·g^-1。

進一步，所述的改性碳纖維按照10-20 g/L的加入量投入到培養(yǎng)瓶內(nèi)，在向其中加入培養(yǎng)基后放入反應(yīng)器內(nèi)，進行5-10次多批式連續(xù)發(fā)酵應(yīng)用。

進一步，所述的改性碳纖維的應(yīng)用是通過吸附作用對熱帶假絲酵母進行固定，且吸附作用由表面上親水力-親水力之間的控制和靜電相互作用所影響。

進一步，所述的改性碳纖維固定化細胞參與的多批式發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品得率比未改性的碳纖維參與的結(jié)果提高了5%-15%，固定化效率提高10%以上，至0.94-1.32g/g。原因與改性后的碳纖維的表面極性發(fā)生了改變，相對于未改性的碳纖維，表面積性更強，細胞固定化效率更高，細胞活性更強，在連續(xù)發(fā)酵過程中細胞對底物的消耗更少，發(fā)酵效率和產(chǎn)率得以提高。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明。

實施例1

65%硝酸改性碳纖維固定化熱帶假絲酵母發(fā)酵木糖醇

將300T級PAN基補強布碳纖維短切為0.5cm，然后利用3倍碳纖維體積的丙酮對其進行索式提取10 h，取出用3倍碳纖維體積的去離子清洗碳纖維表面殘留的丙酮，再放入100℃風(fēng)箱中烘干2 h，一部分留做備用。

將另一部分烘干之后的碳纖維浸泡在2倍體積的65%濃硝酸中3h，然后將用過的濃硝酸倒入酸性試劑回收桶內(nèi)，并用5倍體積的去離子水反復(fù)清洗直至洗滌掉碳纖維表面多余的濃硝酸，最后放入100℃的烘箱中烘干2h后，取出測定性質(zhì)并備用。結(jié)果表明，碳纖維表面接觸角為101.2°，表面含氧量為20.51%，比表面積為30.28㎡·g^-1。

改性碳纖維載體固定化細胞的種子培養(yǎng)基：木糖（20g/l），葡萄糖（20g/l），酵母浸粉（10g/l），KH2PO4(3g/L),(NH4)2HPO4(2 g /L)，pH為4.0-5.5。

改性碳纖維載體固定化細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖（80g/l），葡萄糖（15g/l），酵母浸粉（8g/l）， MgSO4.7H2O(0.4g/L) , KH2PO4(3 g /L),pH為4.0-5.0。

將未經(jīng)硝酸改性的碳纖維與硝酸改性后的碳纖維分別按照10g/L的加入量投入到250mL的培養(yǎng)瓶中，并加入50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，然后再121℃的高溫下滅菌20min。

滅菌后于無菌環(huán)境下接種熱帶假絲酵母6%。最后放入180rpm、30℃的反應(yīng)器中每48h為一批進行多批次發(fā)酵。其中每批次發(fā)酵結(jié)束時需進行換液：在第一批發(fā)酵結(jié)束時保留固定有細胞的改性碳纖維載體及約20%的發(fā)酵液，同時加入新配制的補液進行第二批的發(fā)酵。同樣在第二批發(fā)酵結(jié)束時再次保留固定有細胞的改性碳纖維載體及約20%的發(fā)酵液，加入新配制的補液進行第三批的發(fā)酵。以此類推進行多批發(fā)酵，并對發(fā)酵產(chǎn)率和固定化效率進行檢測。

在進行了8批次連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的驗證后得出，未改性碳纖維固定化細胞的木糖醇的發(fā)酵產(chǎn)率達65.7%，木糖醇平均生成速率為0.87 g/h L，固定化細胞效率為1.02g/g；而改性后的碳纖維發(fā)酵產(chǎn)率、木糖醇平均生成速率和固定化細胞效率分別提高了13%，18%和11%，分別達到了74.6%，為1.04 g/h L，為1.13 g/g。

實施例2

30%雙氧水改性碳纖維固定化克雷伯氏菌發(fā)酵丁二酸

將300T級的PAN基6 k碳纖維短切為0.5cm，然后利用5倍碳纖維體積的丙酮對其進行索式提取10 h，用去離子水清洗之后烘干。

將烘干之后的碳纖維浸泡在2倍體積的30%的雙氧水中6h，然后將用過的雙氧水倒入試劑回收桶內(nèi)，并用6倍體積的去離子水反復(fù)清洗直至洗滌掉碳纖維表面多余的雙氧水，最后放入100℃的烘箱中烘干2h后，取出測定性質(zhì)并備用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g， K2HPO4 3 g，NaCl 0.1 g，CaCl2 0.5 g，MgCl2 0.5g ，pH7.0，121℃，滅菌15 min。。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g，酵母膏15 g，NaHCO3 15 g，Na2HPO4 0.5 g，NaH2PO4 9.6 g，K2HPO4 5 g，NaCl 0.5 g，pH 7.0，121℃，滅菌15 min。

將上述改性處理后的碳纖維按照10g/L的加入量投入到250mL的培養(yǎng)瓶中，并加入50mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為37℃，pH 值自然，轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵周期72 h。

發(fā)酵結(jié)果表明，改性后的碳纖維載體固定化克雷伯氏菌的固定化效率提高了15%，發(fā)酵產(chǎn)丁二酸產(chǎn)率提高了12%。在進行了7批次連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的驗證，固定化效率不降低，且發(fā)酵結(jié)果無顯著下降，平均發(fā)酵產(chǎn)率達53.2%，丁二酸平均生成速率為0.72 g/h L，固定化細胞效率為1.03 g/g。