本發(fā)明涉及一種疾病相關(guān)基因的檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因的引物，以及檢測(cè)試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

伴有皮層下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leucoencephalopathy，CADASIL)是一種較為少見(jiàn)的，在成人時(shí)發(fā)病且以顯性方式遺傳的小動(dòng)脈血管病變。患者常有包括腦血管阻塞造成的腦梗死或短暫性腦缺血發(fā)作、癡呆癥、先兆性偏頭痛，以及精神方面的問(wèn)題(中國(guó)卒中雜志，2010,5(7),573～8)。

研究發(fā)現(xiàn)，位于染色體19p13.1-13.2區(qū)域的NOTCH3基因的突變是造成該疾病的致病病因。NOTCH3有33個(gè)外顯子，且與致病有關(guān)的集中在2號(hào)～24號(hào)外顯子的突變體。在亞洲人群中，4號(hào)外顯子突變率最高，占40％以上(中國(guó)卒中雜志，2012,7(2),136～140)。

中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL 200510098513.1提供了一種與CADASIL相關(guān)的基因突變類(lèi)型及其檢測(cè)方法，在外顯子Exon4中的密碼子134的TGC突變?yōu)門(mén)AC，在Exon4中的密碼子141的CGC突變?yōu)門(mén)GC，在Exon3中的密碼子90的CGT突變?yōu)門(mén)GT，在Exon4中的密碼子117的TGC突變?yōu)镃GC，在Exon4中的密碼子169的CGC突變?yōu)門(mén)GC，在Exon4中的密碼子182的CGC突變?yōu)門(mén)GC。

在臨床病例中，仍有病患無(wú)法依據(jù)上述技術(shù)進(jìn)行確診。為此，仍有必要對(duì)CADASIL相關(guān)基因進(jìn)行探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因的引物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)NOTCH3基因突變的確定，利于臨床防治手段的實(shí)施。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)試劑盒，以檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因，為臨床診斷提供判斷的參照依據(jù)。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種引物對(duì)，其在檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種引物對(duì)，其正向引物具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列，反向引物具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列。

本發(fā)明引物對(duì)能用于判斷NOTCH3基因4號(hào)外顯子上的201位密碼子是否由TGT 突變?yōu)門(mén)AT，所獲得DNA片段長(zhǎng)度為536bp。

本發(fā)明引物對(duì)在檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因中的應(yīng)用，判斷NOTCH3基因的p.C201Y位點(diǎn)是否突變。

本發(fā)明提供的引物對(duì)，還包括在其5’端結(jié)合標(biāo)記物，如：但不僅限于熒光標(biāo)記物(TAMRA、FAM、FITC、Dansyl和Biotin等)和同位素標(biāo)記物等。

本發(fā)明引物對(duì)用于制作檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因的試劑盒。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)試劑盒，包括由具有SEQ ID No 1所示序列或其同源序列的正向引物和具有SEQ ID No 2所示序列或其同源序列的反向引物組成的引物對(duì)。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果：

本發(fā)明提供的引物對(duì)適用于檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因的新的突變位點(diǎn)，為該病癥的診斷提供有益參考，與其它診斷手段一起互相應(yīng)證，而利于患者的臨床確診，還對(duì)該病癥的診療方案的確定和實(shí)施提供依據(jù)。

本發(fā)明提供的引物進(jìn)行常規(guī)的分子生物學(xué)操作即可獲得突變位點(diǎn)的DNA片段，操作簡(jiǎn)單、所需的試劑種類(lèi)少，便于應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明引物對(duì)檢測(cè)CADASIL相關(guān)基因而獲得的電泳圖，其中，“M”表示marker，四條條帶從下至上分別對(duì)應(yīng)200、500、750和1200，“E04”表示獲得的目標(biāo)DNA片段。

具體實(shí)施方式

以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，若沒(méi)有特別注明，可參考自《分子克隆》一書(shū)(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學(xué)出版社，1994)。該書(shū)及其后續(xù)出版版本是本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行與分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)最常用的具有指導(dǎo)性的參考書(shū)籍。此外，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康模绢I(lǐng)域技術(shù)人員在各種商品化試劑盒(Kit)所附帶的操作手冊(cè)的指導(dǎo)下完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)或委托專(zhuān)業(yè)化的公司進(jìn)行，如：基因測(cè)序、質(zhì)粒測(cè)序和確定分子量等。

本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自于西格瑪－奧德里奇(Sigma－Aldrich)。

患者男性，64歲，反復(fù)腦梗死3次，表現(xiàn)出智能下降(簡(jiǎn)易智能量表MMSE評(píng)分為20分)，頭顱核磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)顯示雙側(cè)腦白質(zhì)病變，磁敏感加權(quán) 成像(Susceptibility weighted imaging，SWI)顯示腦干、雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多量微出血灶。

從該患者處取得血液試樣，并將具有SEQ ID No 1所示序列的正向引物和具有SEQ ID No 2所示序列的反向引物進(jìn)行基因檢測(cè)，具體步驟如下：

1，血液提?。?/p>

采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)，提取血液DNA。具體步驟為：

1)取500μl抗凝血，加入700ul的細(xì)胞裂解液CL，靜置5min。

2)12,000rpm離心3min，吸去上清，留下細(xì)胞核沉淀，加入200μlGS，振蕩混勻，加入20ul Proteinase K溶液，混勻。

3)加200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10min，期間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮。

4)加200μl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻。

5)將上一步得到的溶液轉(zhuǎn)入一個(gè)CB3吸附柱中，12000rpm離心30s后去除廢液。

6)利用試劑盒的GD和PW依次洗脫柱子，室溫放置7min晾干。

7)加入100μl的洗脫緩沖液TB，靜置3min后離心，收集洗脫液。

8)紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值，檢測(cè)DNA濃度和純度，保證DNA濃度>50ng/ml。

9)保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系為：

反應(yīng)條件為：

3.PCR產(chǎn)物鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)序或通過(guò)標(biāo)記物判斷是否獲得目標(biāo)基因(參見(jiàn)圖1)。

結(jié)果顯示該患者的NOTCH3基因第4號(hào)外顯子突變，突變位點(diǎn)為p.C201Y，由此初步判斷其癥狀與CADASIL有關(guān)。