本發(fā)明屬于基因工程和生物質(zhì)利用領(lǐng)域，具體涉及一種高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863及其編碼基因和應用。

背景技術(shù)：

果膠是一類主要存在于植物初生細胞壁和胞間層的多糖，它與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的微纖絲以及某些伸展蛋白相互交聯(lián)，使植物組織保持結(jié)構(gòu)完整性和剛性，進而對生物質(zhì)的抗降解性有重要作用。果膠的分子量一般較大并且結(jié)構(gòu)較為復雜，其基本結(jié)構(gòu)由兩大不同結(jié)構(gòu)域組成：線性的同聚半乳糖醛酸區(qū)域(homogalacturonan,HG)和分支的鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖區(qū)域(rhamnogalacturonan,RG)。HG是由100-200個D-半乳糖醛酸通過α(1,4)糖苷鍵連接而成的線性同聚物，其中70-80％的半乳糖醛酸殘基發(fā)生了甲基酯化，也有部分C2和C3位置的羥基發(fā)生了乙?；?Chiliveri&Linga,2014)。RG區(qū)域又分為RG-和RG-II兩種類型，RG-I的主鏈是由含半乳糖醛酸和鼠李糖的重復二糖單位構(gòu)成的，其結(jié)構(gòu)可大致表示為GalAp-α-(1,2)-Rhap-α-(1,4)-GalAp-α-(1,2)-Rhap；RG-II是由HG的主鏈和11種不同的糖側(cè)鏈組成的分支型結(jié)構(gòu)，主要有L-阿拉伯糖，D-半乳糖和D-木糖共價連接到主鏈的C1或C2位置上(Itoh et al.,2006)。

果膠的降解涉及多種酶的作用，主要有果膠甲酯酶(pectin methyl esterase,[PME][EC3.1.1.11])，多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,[PG][EC 3.2.1.15])和果膠/果膠酸裂解酶(pectin lyase,[PNL][EC 4.2.2.10]/pectate lyase，[PEL][EC 4.2.2.2])。果膠酸裂解酶是果膠酶中作用方式較為特殊的一類，它通過反式消除方式切割半乳糖醛酸單位間的α(1,4)糖苷鍵，生成(4,5)不飽和寡聚半乳糖醛酸(Sukhumsiirchart et al.,2009；Wang et al.,2011)。果膠酸裂解酶因其在紡織、造紙、茶或咖啡發(fā)酵、果膠廢水處理及植物油提取等領(lǐng)域的廣泛應用而備受關(guān)注(Chiliveri&Linga,2014)。值得一提的是，棉麻等植物纖維應用于紡織之前尤為重要的前處理便是脫膠過程，即去除果膠質(zhì)及一些雜質(zhì)。傳統(tǒng)的煮堿脫膠法不僅帶來嚴重的環(huán)境污染，而且會對纖維本身造成一定的傷害，應用果膠酸裂解酶的生物酶法脫膠在去除非纖維類物質(zhì)的同時，保持了原纖維的完整性，也大大減少了化學品的消耗，是一種能夠替代堿法脫膠的環(huán)境友好的方法。同時，由于果膠物質(zhì)在堿性高溫條件下更易溶解，所以嗜熱菌或嗜堿菌來源的果膠酸裂解酶具有非常大的工業(yè)應用潛質(zhì)及競爭力。目前發(fā)現(xiàn)及研究的果膠酸裂解酶主要來自于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及曲霉真菌屬(Li et al.,2014；Sasaki et al.,2015)。

熱解纖維素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis是分離自堪察加半島熱泉中的嚴格厭氧的革蘭氏陽性菌，其可在較高溫度(45-82℃)下利用纖維素、濾紙以及果膠等物質(zhì)(Miroshnichenko et al.,2008)。對其基因組分析發(fā)現(xiàn)，該菌是迄今發(fā)現(xiàn)的具有最高糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolases family)多樣性的厭氧嗜熱微生物，包含84個GH結(jié)構(gòu)域，分屬于38個糖苷水解家族(Blumer-Schuette et al.,2012)。已報道的Caldicellulosiruptor菌屬來源的降解酶類如纖維素酶、木聚糖酶、α-葡萄糖醛酸苷酶等均具有較高的作用溫度和良好的熱穩(wěn)定性，同時表現(xiàn)出對天然底物的降解優(yōu)勢。本發(fā)明實現(xiàn)了C.kronotskyensis中果膠酸裂解酶的高效異源表達，該酶的最適溫度為70℃，最適pH為9.0，可替代強堿溶液進行麻纖維脫膠，并且可明顯促進天然秸稈的降解。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863及其基因工程制備方法和應用，具體包括：

1.本發(fā)明提供一種來源于熱解纖維素菌Caldicellulosiruptorkronotskyensis的果膠酸裂解酶Pel-863，該酶屬于多糖裂解酶家族3，其編碼基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。其中，該酶包含447個氨基酸，N端32個氨基酸為其預測的信號肽序列，即“MSNRKILAIVVSLIMVVSLFTGIGLRNEVAKA”(SEQ ID NO.5)。成熟的果膠酸裂解酶Pel-863的氨基酸序列即為去掉信號肽(SEQ ID NO.5)之后的序列，如SEQ ID NO.4所示，該成熟酶對應的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

2.本發(fā)明提供包含上述果膠酸裂解酶基因的重組載體，包括大腸桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、酵母菌表達載體、枯草桿菌表達載體及絲狀真菌表達載體等。將本發(fā)明的高溫堿性果膠酸裂解酶基因與線性質(zhì)粒片段連接獲得重組表達載體。重組表達質(zhì)粒pET-28b-Pel-863作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的重組表達載體。

3.本發(fā)明提供包含上述果膠酸裂解酶基因的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌(如Escherichia coli BL 21(DE3)、E.coli Top10、E.coli Rosetta(DE3)等)、乳酸菌(如Lactococcuslactis等)、酵母菌(如Pichiapastoris、Saccharomyces cerevisiae等)、枯草桿菌(如Bacillus subtilis BS168等)和絲狀真菌(如Trichodermareesei、Aspergillusniger等)，優(yōu)選為大腸桿菌E.coli Rosetta(DE3)。

4.本發(fā)明還提供上述果膠酸裂解酶Pel-863的基因工程制備方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體pET-28b-Pel-863轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株，誘導果膠酸裂解酶Pel-863的表達；

3)回收并純化所表達的果膠酸裂解酶Pel-863。

5.本發(fā)明還提供上述果膠酸裂解酶Pel-863在酶解多聚半乳糖醛酸、果膠以及蘋果渣、麻纖維、玉米秸稈及水稻秸稈中果膠質(zhì)成分的應用，尤其是在麻纖維脫膠和天然秸稈降解過程中的應用。

本發(fā)明的技術(shù)方案:

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

(1)包含上述高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863編碼基因的工程菌的構(gòu)建

提取熱解纖維素菌Caldicellulosiruptor kronotskyensis的基因組，設(shè)計引物擴增Pel-863。得到的目的基因片段和載體經(jīng)處理后，連接轉(zhuǎn)化宿主細胞。篩選陽性克隆并測序，然后對測序正確的工程菌提取重組質(zhì)粒，獲得重組表達載體。所述表達載體，是指大腸桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、酵母菌表達載體、枯草桿菌表達載體及絲狀真菌表達載體等，優(yōu)選為將本發(fā)明的高溫堿性果膠酸裂解酶基因與線性質(zhì)粒pET-28b相連接，得到的重組表達質(zhì)粒pET-28b-Pel-863。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得含高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863基因的重組菌。所述菌株為大腸桿菌(如Escherichia coli BL 21(DE3)、E.coli Top10、E.coli Rosetta(DE3)等)、乳酸菌(如Lactococcuslactis等)、酵母菌(如Pichiapastoris、Saccharomyces cerevisiae等)、枯草桿菌(如Bacillus subtilis BS168等)和絲狀真菌(如Trichodermareesei、Aspergillusniger等)，優(yōu)選為大腸桿菌E.coli Rosetta(DE3)。

(2)制備高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863

培養(yǎng)上述重組菌株，進行誘導表達。收集菌體，超聲破碎，60℃熱失活，收集上清，利用親和層析以及凝膠過濾層析純化重組蛋白。最后利用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達和純化情況。

(3)高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863的酶學性質(zhì)測定

測定Pel-863的最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度、熱穩(wěn)定性、不同金屬離子和化學試劑對Pel-863活性的影響以及其動力學參數(shù)。

(4)高溫堿性果膠酸裂解酶在降解蘋果渣、麻纖維、玉米秸稈及水稻秸稈中果膠質(zhì)成分的應用。

稱取一定量粉碎、水洗并干燥的蘋果渣、麻纖維、玉米秸稈及水稻秸稈原料，加入一定量的重組果膠酸裂解酶Pel-863酶液，于70℃、pH9.0條件下振蕩反應過夜。離心取上清液通過紫外分光光度法測定生成的不飽和寡聚半乳糖醛酸含量并用用薄層層析法定性分析蘋果渣、麻纖維、玉米秸稈及水稻秸稈原料酶解液的成分。

附圖說明

圖1重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863的凝膠過濾層析(A)及各收集組分的SDS-PAGE電泳分析(B)。

圖2重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863的最適pH(A)，pH穩(wěn)定性(B)，最適溫度(C)，熱穩(wěn)定性(D)以及新提取酶的米氏方程動力學(E)和貯存酶的變構(gòu)動力學(F)。

圖3不同金屬離子和化學試劑(A)及不同鈣離子濃度(B)對重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863活性的影響。

圖4重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863對不同底物的降解及TLC分析。

圖5不同處理下的麻纖維的紅外光譜圖(A)和掃描電鏡圖(B：對照組1即未處理纖維，C：對照組2即僅使用緩沖液處理，D：實驗組1即Pel-863處理，E：實驗組2即1％NaOH處理)。

圖6重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863對玉米秸稈(A)和水稻秸稈(B)糖化的促進作用。

具體實施方式

實施例1：含高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863基因的工程菌構(gòu)建

1.1C.kronotskyensis基因組DNA的提取

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech)提取熱解纖維素菌C.kronotskyensis的基因組DNA,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2Pel-863基因及載體pET-28b的PCR擴增

根據(jù)已發(fā)表的C.kronotskyensis基因組信息及其注釋，設(shè)計擴增果膠酸裂解酶基因的引物如下：

Calkro_0863-F 5'-GCCGCGCGGCAGCATGGCGACACTTTTAACA-3'

Calkro_0863-R 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTAGTATTGATGTATCTGTG-3'

以提取的基因組DNA為模板，進行目的基因的PCR擴增。

載體pET-28b經(jīng)Hind III和Nhe I雙酶切過夜后進行瓊脂糖凝膠電泳，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大小約為5.3kb的片段。以所回收片段為模板，進行質(zhì)粒PCR擴增。

PCR反應產(chǎn)物均進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。

1.3果膠酸裂解酶基因與載體的處理和連接

回收得到的Pel-863基因片段和質(zhì)粒pET-28b片段用T4DNA Polymerase處理后，22℃連接20min，獲得重組表達載體pET-28b-Pel-863。

1.4重組質(zhì)粒pET-28b-Pel-863轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10

取重組質(zhì)粒1-3μl加入到100μl Top10感受態(tài)細胞中，冰浴30min。然后42℃熱激60s后立即冰浴2min。加入500μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃下200rpm培養(yǎng)1h。取菌液低速離心棄部分上清，將剩余菌液全部涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培養(yǎng)過夜。

1.5重組質(zhì)粒的鑒定和提取

挑選轉(zhuǎn)化成功的單菌落過夜培養(yǎng)進行菌液PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確定為陽性克隆的菌液由生工測序公司測序。測序顯示正確后使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)

按1.4所述方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)12-16h獲得單菌落。挑取3-5個單克隆于5ml含有50μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，加入終濃度為15-20％的甘油，于-80℃保存菌種。至此獲得以pET-28b為載體，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主菌構(gòu)建的含高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863基因的工程菌。

實施例2：重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863的誘導表達和純化

將實施例1中得到的工程菌培養(yǎng)于含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達到0.6左右時，加入IPTG至終濃度0.1mM，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)4-6h。4000g離心15min收集菌體，重懸于Binding Buffer(50mM Tris-HCl,pH7.5,300mMNaCl)中，于冰浴中超聲破碎。而后4℃10000g離心15min去除細胞碎片，所得上清即為粗酶液。

將粗酶液于60℃加熱處理30min去除熱不穩(wěn)定蛋白，4℃10000g離心15min留上清。600μL Ni-NAT親和層析柱用6mL Binding Buffer平衡后，將上清過柱3-5次。過柱后先用6ml Binding Buffer洗滌，再用400μL Elution Buffer(50mM Tris-HCl,pH 7.5，300mMNaCl，150mM咪唑)洗脫，收集洗脫的樣品液。將所得樣品液使用透析袋去除咪唑并換成酶液貯存緩沖液(50mM Tris-HCl pH 7.0,300mM NaCl)。30mL Superdex 200葡聚糖凝膠柱(GE Healthcare)預先用酶液貯存緩沖液平衡后，將樣品液過柱，在出現(xiàn)波峰時收集蛋白。取各個操作時期的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達和純化情況。凝膠過濾層析譜圖和SDS-PAGE電泳圖顯示，天然Pel-863以單體和同源三聚體兩種狀態(tài)存在(圖1)。

實施例3：重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863的酶學性質(zhì)測定

3.1高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863活性測定

采用紫外分光光度法對果膠酸裂解酶Pel-863活性進行分析：1.5mL反應管中含80μLpH7.0,2％(W/V)PGA-NaOH溶液，320μLPel-863緩沖液(50mM甘氨酸-氫氧化鈉，pH9.0,150mM NaCl,1.5mM CaCl₂)，加入10μL適當稀釋的純化后酶液，70℃反應10min，加入400μL50mM HCl終止反應，離心取上清于235nm處測定紫外吸收值。以未加入酶液的一組為對照。1個酶活單位(U)定義為在給定條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol不飽和寡聚半乳糖醛酸的酶量，其中不飽和寡聚半乳糖醛酸的摩爾吸光系數(shù)ε₂₃₅為4075M^-1cm^-1。

3.2高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863最適pH和pH穩(wěn)定性的測定

Pel-863的最適pH的測定為在不同pH緩沖條件下(pH7.8-8.5為Tris-HCl緩沖液；pH9.0-10.5為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)進行酶促反應。Pel-863于上述各種不同pH的緩沖液中室溫放置36h，然后于最適pH下測定酶活以研究其pH穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，Pel-863的最適pH為9.0，在pH9.5時保持93％以上活性(圖2A)。Pel-863的最適儲存pH為7.0，在pH7.0-8.5范圍內(nèi)室溫放置36h后剩余酶活在85％以上(圖2B)。

3.3高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定

Pel-863的最適溫度的測定為在甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0)及不同溫度下進行酶促反應。熱穩(wěn)定性為將Pel-863在60℃，65℃，70℃及75℃下保溫不同時間，再于最適溫度下進行酶活測定。結(jié)果顯示，Pel-863的最適溫度為70℃，75℃時保持90％以上的活性(圖2C)，在60℃溫育8h，酶活力保留70％以上(圖2D)。

3.4高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863動力學參數(shù)的測定

Pel-863動力學參數(shù)K_m和V_max是通過在不同PGA濃度(0.1-2g/L)下收集酶活數(shù)據(jù)然后應用Graph Pad Prism 6軟件中的米氏方程擬合得到的。擬合結(jié)果顯示，新提取的高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863以多聚半乳糖醛酸為底物時的K_m值為0.5942g/L，V_max為172.8U/mg(圖2E)。于4℃放置約1個月的Pel-863呈現(xiàn)變構(gòu)酶的動力學性質(zhì)，K_half值變?yōu)?.3594g/L，V_max值下降為80.88U/mg(圖2F)

3.5不同金屬離子及化學試劑對高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863活性影響的測定

在酶促反應體系中加入不同金屬離子及化學試劑來研究其對Pel-863酶活的影響。其中各金屬離子終濃度為1mM，化學試劑終濃度為0.1％(W/V)并加入終濃度為1mM的鈣離子。此外，不同鈣離子濃度(0.5-5mM)對Pel-863活性的影響也被研究。結(jié)果顯示，Ca²⁺是該酶必不可少的激活劑，F(xiàn)e³⁺對其有部分激活作用，K⁺,Cu²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Ni²⁺,Mn²⁺對其沒有激活作用；EDTA可完全抑制其活性，0.1％的SDS便可使其喪失50％左右的活性(圖3A)。在以多聚半乳糖醛酸為底物時，兼顧酶活性和反應液流動性，較為適宜的Ca²⁺濃度為3-5mM(圖 3B)。

3.6高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863對天然底物中果膠質(zhì)的降解作用

Pel-863分別以2％PGA、果膠、麻纖維、蘋果渣、玉米秸稈和水稻秸稈為底物，在70℃，pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖條件(含5mM Ca²⁺)下酶解過夜，生成的不飽和寡聚半乳糖醛酸通過測定OD_235nm及薄層層析(TLC)來確定，結(jié)果如圖4所示。Pel-863作用PGA生成不飽和半乳糖醛酸單體和二聚體；Pel-863對蘋果渣、麻纖維、玉米秸稈及水稻秸稈中果膠質(zhì)成分的降解均優(yōu)于對果膠的降解，尤其是蘋果渣，產(chǎn)生的不飽和寡聚半乳糖醛酸濃度達到2mM。

實施例4：重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863應用于麻纖維脫膠

Pel-863對麻纖維的脫膠效果是通過與1％NaOH處理對比研究實現(xiàn)的。稱取0.015g粉碎、水洗并干燥的麻纖維，實驗組1加入750μL pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(含5mM Ca²⁺)及12μg/mg纖維的Pel-863，實驗組2加入750μL 1％NaOH溶液，對照組1不加任何試劑，對照組2僅加入750μL pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(含5mM Ca²⁺)，所有樣品于70℃振蕩反應過夜。處理后的纖維經(jīng)水洗干燥后進行紅外光譜和掃描電鏡研究，結(jié)果如圖5所示。Pel-863處理的纖維與1％NaOH處理的纖維基本達到一致(圖5A)，而且，Pel-863脫膠過程明顯降低了對麻纖維的損害(圖5D；圖5E)

實施例5：重組高溫堿性果膠酸裂解酶Pel-863應用于玉米和水稻秸稈降解

按照實施例4中實驗組1的加入比例對玉米秸稈和水稻秸稈進行預降解，反應液測定OD_235nm后于85℃烘箱中蒸干水分，而后加入750μL pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，實驗組再加入比例為7.5μg/mg秸稈的諾維信酶Cellic CTec2，于50℃下振蕩反應過夜，使用高效液相色譜(HPLC)分析其還原糖產(chǎn)生量，結(jié)果如圖6所示。對玉米秸稈來說，Pel-863預降解使葡萄糖產(chǎn)生量增加了14.2％，木糖產(chǎn)生量增加了311.6％(圖6A)；對水稻秸稈來說，Pel-863預降解使葡萄糖產(chǎn)生量增加了6.5％，木糖產(chǎn)生量增加了55％(圖6B)?？傊邷貕A性果膠酸裂解酶Pel-863可明顯提高玉米和水稻秸稈的降解糖化率，尤其是木糖產(chǎn)生量。