本發(fā)明涉及構(gòu)建ALK融合基因突變檢測文庫的方法和試劑盒。本發(fā)明還涉及通過對ALK融合基因突變檢測文庫進(jìn)行高通量測序?qū)崿F(xiàn)高靈敏度準(zhǔn)確檢測ALK基因融合突變的方法。
背景技術(shù)：
：間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)是一個由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域組成的酪氨酸受體激酶。在1％-7％的非小細(xì)胞肺癌(Non-SmallCellLungCancer，NSCLC)患者中發(fā)現(xiàn)了突變的ALK基因與其他基因的融合，從而造成胞內(nèi)酪氨酸激酶的高表達(dá)活性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與ALK基因融合的基因有EML4、KIF5B、TGF、KLC1、PTPN3、STRN等，并且融合位點(diǎn)具有多樣性。目前已知的EML4與ALK的融合位點(diǎn)就多達(dá)20余種。隨著研究的深入與發(fā)展，新的融合基因與新的融合位點(diǎn)還在被不斷地發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在的研究普遍認(rèn)為ALK的融合斷裂點(diǎn)集中在19號外顯子和20號外顯子之間，且該融合基因的斷裂點(diǎn)沒有固定的模式。對于ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者來說，小分子靶向藥克唑替尼(crizotinib)作為一線治療藥物與標(biāo)準(zhǔn)化療藥物相比，具有更好的治療效果，能更顯著地延長患者的無進(jìn)展生存期和中位生存期，提高患者的客觀緩解率，幫助患者降低痛苦，提高生活質(zhì)量，并于2011年獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)。因此如何有效地篩選出ALK陽性患者，成為臨床上克唑替尼靶向治療的重要前提。然而，目前由于檢測方法靈敏度的限制，臨床上常用的ALK基因融合的檢測方法都是適用于組織材料。臨床常見的組織檢測方法有：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)檢測法、熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)檢測法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測法。IHC檢測法實(shí)驗(yàn)操作簡單易行，敏感性高(假陰性率低)，適用于臨床篩查。但是IHC特異性低(假陽性高)。因此，常規(guī)IHC陽性患者還需要FISH、RT-PCR等其他方式的確診。FISH檢測法的原理是在ALK的端粒端和著絲粒端分別設(shè)計紅綠探針，一旦ALK基因發(fā)生斷裂重排，紅綠信號就會分離，從而檢測到熒光信號的變化。由于ALK基因融合結(jié)果的判讀涉及到對熒光信號的觀察和檢測技術(shù)，因此必須要由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師來完成。同時，15％的閾值(100個細(xì)胞中要有15個細(xì)胞出現(xiàn)紅綠信號分離)，使得該檢測法靈敏度受到限制。對于晚期患者的小活檢標(biāo)本而言，很難保證每個視野存在50個以上的癌細(xì)胞?？偟膩碚f，F(xiàn)ISH的價格昂貴，操作嚴(yán)格，對觀察視野要求嚴(yán)苛，需要非常專業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員來判讀結(jié)果，自動化程度低，成本高，不適合大規(guī)模臨床檢測篩選。而且，F(xiàn)ISH不能區(qū)分ALK融合變體的類型。RT-PCR法需要高質(zhì)量的RNA樣本來保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。但是，由于臨床樣本大多數(shù)為石蠟組織，RNA降解比較嚴(yán)重，因此逆轉(zhuǎn)錄的效率受到影響，從而導(dǎo)致最終檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，即會產(chǎn)生ALK基因融合的假陰性結(jié)果。如何獲得更高比例的合格RNA樣品是RT-PCR檢測技術(shù)的一個壁壘。此外，盡管在NSCLC患者中已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了20多種不同的ALK基因融合變體，但仍不能排除有未知變體的存在。由于RT-PCR的引物設(shè)計都是基于已知的融合基因和融合方式，導(dǎo)致該方法不能夠檢測新的融合基因以及新的融合方式。以上3種方法都不能獲得詳細(xì)的基因融合突變信息，即與ALK融合的具體基因以及融合的位點(diǎn)。因此，急需一種能高靈敏度準(zhǔn)確檢測ALK基因融合突變并獲得其詳細(xì)突變信息的方法。此外，以上3種檢測方法由于其設(shè)計的限制以及靈敏度不高的原因，只能用于臨床組織樣本的檢測。目前臨床上癌癥組織樣本主要通過手術(shù)或者活體穿刺獲得。這種創(chuàng)傷型的檢測方式伴隨著無謂的病患的痛苦以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。并且活體穿刺由于取樣部位的異質(zhì)性，可能會帶來假陰性的結(jié)果。創(chuàng)傷性的組織取樣還具有不可重復(fù)性，對患者的病情進(jìn)展無法進(jìn)行跟蹤。而在無創(chuàng)檢測ALK基因融合突變方面，現(xiàn)狀依然是空白。因此也迫切需要一種無創(chuàng)的、能準(zhǔn)確檢測ALK基因融合突變的方法。本發(fā)明提供了一種以血漿DNA或組織DNA為起始材料的適用于第二代高通量測序平臺的ALK融合基因突變文庫的構(gòu)建方法和試劑盒，以及通過對所述文庫進(jìn)行測序?qū)崿F(xiàn)ALK基因融合突變的高靈敏度檢測的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種高靈敏度的檢測ALK融合基因突變的方法，實(shí)現(xiàn)了ALK基因融合突變的準(zhǔn)確檢測。本發(fā)明基于以下事實(shí)：血漿DNA或組織DNA在連接接頭之后經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，DNA分子被放大，形成預(yù)文庫；單個DNA分子在環(huán)化酶的作用下獨(dú)立地形成了單鏈環(huán)，每個環(huán)都含有一個DNA分子的信息；再通過特異性的背向延伸的引物選擇性地擴(kuò)增靶區(qū)域，最后通過通用引物擴(kuò)增測序所需的序列，并在第二代測序平臺上進(jìn)行測序。根據(jù)本發(fā)明，可以有效選擇擴(kuò)增含有靶向區(qū)域的血漿DNA或組織DNA分子，并通過第二代測序平臺進(jìn)行序列信息分析。因此，本發(fā)明的一個方面是提供一種用于構(gòu)建檢測ALK基因融合突變文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取DNA；2)構(gòu)建DNA預(yù)文庫；3)環(huán)化DNA；4)以環(huán)化產(chǎn)物為模板用ALK特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集靶區(qū)域，獲得終文庫。根據(jù)本發(fā)明的方法，起始材料的DNA可以來自于血漿DNA或組織DNA，優(yōu)選血漿DNA。值得注意的是，當(dāng)采用血漿DNA作為起始材料用于構(gòu)建檢測ALK基因融合突變的文庫時，可以實(shí)現(xiàn)對ALK基因融合突變的準(zhǔn)確的無創(chuàng)檢測。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以用市售的各種DNA抽提的試劑盒提取DNA。同時，通過打斷提取出來的DNA獲得的合適大小的DNA片段也適用于接下來的步驟。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述DNA預(yù)文庫的構(gòu)建，需要將DNA分子與接頭連接，再使用與接頭序列相匹配的引物，通過PCR預(yù)擴(kuò)增將DNA分子數(shù)目放大，形成預(yù)文庫。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述與DNA分子連接的接頭為雙鏈接頭，并通過選自以下的一種或兩種酶來進(jìn)行連接：T4DNA連接酶和T7DNA連接酶。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述與DNA分子連接的接頭含有標(biāo)簽序列。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述雙鏈接頭由互補(bǔ)配對部分和不互補(bǔ)配對部分組成。所述雙鏈接頭的組成，根據(jù)與DNA分子連接位點(diǎn)由遠(yuǎn)及近，是：不配對通用序列，配對通用序列。優(yōu)選的，不配對通用序列為5-15nt，配對通用序列為10-20nt。本發(fā)明中所用接頭序列示例如下：上鏈(topstrand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQIDNO：1)下鏈(bottomstrand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQIDNO：2)根據(jù)本發(fā)明的方法，在DNA分子連上接頭后，進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，以放大DNA分子的數(shù)目，從而形成預(yù)文庫。所述預(yù)擴(kuò)增的酶為一種或多種熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，選自LA-Taq、rTaq、Phusion、DeepVent、DeepVent(exo-)、Gold360、PlatinumTaq和KAPA2GRobust。本發(fā)明中所用的預(yù)擴(kuò)增引物序列示例如下：FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：3)RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：4)根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟3)是將放大后的連有接頭的DNA分子進(jìn)行環(huán)化。環(huán)化過程為夾板介導(dǎo)的單鏈DNA環(huán)化。其中使用的單鏈DNA環(huán)化酶選自T4DNA連接酶、TaqDNA連接酶、E.coliDNA連接酶、9°NDNA連接酶，以及它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述單鏈DNA環(huán)化所需的夾板與成環(huán)后的預(yù)文庫接頭序列互補(bǔ)，可以根據(jù)接頭序列的變化而變化。本發(fā)明中所用夾板序列示例如下：5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：5)根據(jù)本發(fā)明的方法，在將環(huán)化的DNA分子作為模板用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增前，需要將未環(huán)化的線性DNA消化掉。所述線性DNA包括單鏈DNA和雙鏈DNA。用到的消化酶為核酸外切酶，包含但不限于，核酸外切酶I、核酸外切酶III、Lamda核酸外切酶和T7核酸外切酶，以及它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述檢測ALK基因融合突變的特異性引物是20對相鄰且背向延伸的引物對。所述20對背向延伸的引物對之間的間隔為50-300nt，優(yōu)選地針對DNA的長度設(shè)計為70-90nt。引物對之內(nèi)的2條引物可以間隔0-10nt，或者重疊0-10nt。所述20對背向延伸的引物對以覆瓦的方式，覆蓋了ALK基因融合突變熱點(diǎn)區(qū)域，例如ALK基因的19號內(nèi)含子、19號外顯子的3’端以及20號外顯子的5’端。所述20對特異性引物對的具體序列如表1所示：表1.用于檢測ALK基因融合突變的20對特異性引物對的序列此外，用于檢測對克唑替尼耐藥的ALK基因融合突變的特異性引物是6對背向延伸的引物對，其分別針對ALK外顯子22、23和25上的耐藥性突變，如點(diǎn)突變和插入突變。所述6對背向延伸的引物對的具體序列如表2所示：表2.用于檢測對克唑替尼耐藥的ALK基因融合突變的6對特異性引物對的序列序列號名稱核酸序列SEQIDNO：46ALKE22P1F3ATCCAGTTCGTCCTGTTCAGAGSEQIDNO：47ALKE22P1R3TCCTCATGGAAGCCCTGATCSEQIDNO：48ALKE22P2FGTGTCTCTCTGTGGCTTTACCTGSEQIDNO：49ALKE22P2RCTCACCCCAACTCCCCTCT[0041][0041]SEQIDNO：50ALKE23P1FAGCCTGCAATCCCTGCCSEQIDNO：51ALKE23P1RCACCCCAATGCAGCGAACSEQIDNO：52ALKE23P2FGCGGGTCTCTCGGAGGAAGSEQIDNO：53ALKE23P2RCGCCCGGTGAGTGAGAACSEQIDNO：54ALKE25P1FCTGGAAGAGTGGCCAAGATTGSEQIDNO：55ALKE25P1RGGCCTGGACAGGTCAAGAGSEQIDNO：56ALKE25P2FGATGTCTCGGGCCATCCCSEQIDNO：57ALKE25P2RTGAGTAAAGACTGCCTCACCCC根據(jù)本發(fā)明的方法，所述檢測ALK基因融合突變的特異性引物的5’端都含有用于高通量測序的接頭序列。此高通量測序接頭適用于Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和LifeTechnologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等測序平臺。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述檢測ALK基因融合突變的方法適用于檢測發(fā)生在ALK19號內(nèi)含子的融合突變，包括已知突變和新突變。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法準(zhǔn)確檢測到了新的融合突變，如EML4、EXOC6B和ALK這3個基因的融合突變以及EML4與ALK融合的新位點(diǎn)。本發(fā)明的另一個方面提供一種用于構(gòu)建檢測ALK基因融合突變文庫的試劑盒，該試劑盒包含：1.用于提取DNA的試劑；2.用于構(gòu)建DNA預(yù)文庫的試劑，如酶、緩沖液、接頭和dNTP等；3.用于純化預(yù)文庫DNA的設(shè)備和試劑，如磁珠、洗滌液和洗脫液；4.用于環(huán)化DNA的試劑，包括酶、緩沖液和夾板以及用于消化線性DNA的試劑，如酶和緩沖液；5.用于特異性擴(kuò)增的試劑，如擴(kuò)增酶、緩沖液、特異性引物和dNTP；6.用于純化終文庫的設(shè)備和試劑，如磁珠、洗滌液和洗脫液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述DNA來自于血漿DNA或組織DNA，優(yōu)選血漿DNA，所述用于提取DNA的試劑可以來自各種市售的DNA抽提的試劑盒。同時，通過打斷抽提出來的DNA獲得的合適大小的DNA片段也適用于接下來的步驟。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述用于構(gòu)建預(yù)文庫的酶包括用于對DNA末端進(jìn)行補(bǔ)平修復(fù)的酶；用于為DNA的3’端加上腺嘌呤和鳥嘌呤的酶，包括T4DNA聚合酶、Klenow酶、DNA聚合酶、Taq酶和klenowex-(3’-5’外切活性缺失)；和用于接頭連接的酶，包括T4DNA連接酶、T7DNA連接酶、或它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述接頭為雙鏈接頭。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述接頭包含標(biāo)簽序列。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述雙鏈接頭由互補(bǔ)配對部分和不互補(bǔ)配對部分組成。雙鏈接頭的組成，按照與DNA分子連接位點(diǎn)由遠(yuǎn)及近，是：不配對通用序列，配對通用序列。優(yōu)選的，不配對通用序列為5-15nt，配對通用序列為10-20nt。本發(fā)明試劑盒中所用接頭序列示例如下：上鏈(topstrand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQIDNO：1)下鏈(bottomstrand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQIDNO：2)根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，用于預(yù)擴(kuò)增與接頭連接的DNA分子的酶為一種或多種熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，選自LA-Taq、rTaq、Phusion、DeepVent、DeepVent(exo-)、Gold360、PlatinumTaq和KAPA2GRobust。本發(fā)明中所用的預(yù)擴(kuò)增引物序列示例如下：FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：3)RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：4)根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，在DNA環(huán)化過程中所用的單鏈DNA環(huán)化酶包括T4DNA連接酶、TaqDNA連接酶、E.coliDNA連接酶和9°NDNA連接酶，以及它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述單鏈DNA的環(huán)化所需的夾板與成環(huán)后的預(yù)文庫接頭序列互補(bǔ)，可以根據(jù)接頭序列的變化而變化。本發(fā)明試劑盒中所用夾板序列示例如下：5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：5)根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，用于消化未環(huán)化線性DNA的消化酶為核酸外切酶，包含但不限于，核酸外切酶I、核酸外切酶III、Lamda核酸外切酶和T7核酸外切酶，或者它們的組合。所述的線性DNA包括單鏈DNA和雙鏈DNA。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述檢測ALK基因融合突變的特異性引物是20對相鄰且背向延伸的引物對。所述20對背向延伸的引物對之間的間隔為50-300nt，優(yōu)選地針對血漿DNA或組織DNA的長度設(shè)計為70-90nt。引物對之內(nèi)的2條引物可以間隔0-10nt，或者重疊0-10nt。所述20對背向引物對以覆瓦的方式，覆蓋了ALK基因融合突變的熱點(diǎn)區(qū)域，例如ALK基因的19號內(nèi)含子，以及19號外顯子的3’端以及20號外顯子的5’端，其具體序列如表1所示。此外，用于檢測對克唑替尼耐藥的ALK基因融合突變的特異性引物是6對背向延伸的引物對，其分別針對ALK外顯子22、23和25上的耐藥性的突變，如點(diǎn)突變和插入突變。所述6對背向延伸的引物對的具體序列如表2所示。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，所述用于檢測ALK基因融合突變的特異性引物的5’端都含有用于高通量測序的接頭的序列。此高通量測序接頭適用于Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和LifeTechnologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等測序平臺。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒適用于檢測發(fā)生在ALK19號內(nèi)含子的融合突變，包括已知突變和新突變。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒檢測到了新的融合突變，如EML4、EXOC6B和ALK這3個基因的融合突變以及EML4與ALK融合的新位點(diǎn)。本發(fā)明的另一個方面還提供一種檢測ALK基因融合突變的方法，包括以下步驟：(1)提供血漿DNA或組織DNA樣品，(2)根據(jù)本發(fā)明所述的方法或試劑盒制備終文庫(3)對所述終文庫進(jìn)行高通量測序，(4)對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，并判斷是否存在ALK基因融合突變以及當(dāng)存在ALK基因融合突變時，識別與ALK基因融合的配對基因和融合位點(diǎn)。本發(fā)明的方法適用于多種第二代測序平臺，包括但不限于，如Roche/454FLX、Illumina/Hiseq、Miseq和LifeTechnologies/SOLIDsystem、PGM、Proton等測序平臺。本發(fā)明的另一個方面還提供ALK特異性引物在制備用于檢測受試者中ALK基因融合突變的診斷試劑或試劑盒中的用途，其特征在于，所述診斷試劑或試劑盒適用于本發(fā)明的檢測ALK基因融合突變的方法。所述ALK特異性引物的具體序列如表1和表2所示。本發(fā)明基于第二代測序平臺，具有優(yōu)異的靈敏度，可以以血漿DNA或組織DNA為起始材料檢測ALK基因融合突變以及對克唑替尼的耐藥突變。本發(fā)明可以高靈敏度地檢測出與ALK發(fā)生融合的配對基因，并且準(zhǔn)確地獲得基因融合位點(diǎn)信息。本發(fā)明的方法還可以同時檢測出血漿DNA或組織DNA中野生型分子和突變型分子的數(shù)目，從而計算突變的比例，并用來跟蹤和評估對患者的治療效果和病情進(jìn)展。此外，當(dāng)在本發(fā)明的方法和試劑盒中使用血漿DNA作為起始材料時，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)ALK基因融合突變以及克唑替尼耐藥突變的無創(chuàng)檢測，從而及時有效地指導(dǎo)患者的用藥，減輕病患的痛苦，同時還填補(bǔ)了ALK無創(chuàng)檢測的空白，提供了一種全新的ALK基因融合突變檢測的方法。附圖說明圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的無創(chuàng)檢測ALK基因融合突變文庫的構(gòu)建方法，起始材料是血漿DNA或組織DNA片段。該方法包括以下步驟：提取DNA(步驟101)→制備DNA預(yù)文庫(步驟102)→環(huán)化預(yù)文庫DNA，并消化線性DNA(步驟103)→用ALK基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得終文庫(步驟104)。圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的無創(chuàng)檢測ALK基因融合突變文庫構(gòu)建方法的原理。其中虛線代表ALK基因，實(shí)線代表與ALK融合的基因。實(shí)心圓圈代表融合位點(diǎn)，空心圓圈代表融合位點(diǎn)在ALK上的位置。矩形代表接頭。折線箭頭代表ALK特異性的背向延伸的引物。直線箭頭代表測序引物。DNA片段連上接頭后通過PCR預(yù)擴(kuò)增獲得預(yù)文庫，然后用ALK特異性引物以預(yù)文庫的環(huán)化產(chǎn)物為模板擴(kuò)增得到終文庫。經(jīng)過雙端測序，將測序結(jié)果還原成片段化DNA的初始狀態(tài)，從而分析ALK基因的融合突變情況。圖3示出了用于檢測ALK基因融合突變的引物的位置和檢測位點(diǎn)的序列信息。其中一對背向延伸的引物對由黑色下劃線的引物和方框中的引物組成，內(nèi)含子序列用小寫表示，外顯子序列用大寫表示。圖4示出了根據(jù)本發(fā)明檢測出來的ALK基因融合突變。圖5示出了根據(jù)本發(fā)明檢測出來的ALK基因融合突變用第一代測序技術(shù)驗(yàn)證的結(jié)果。具體實(shí)施方式需要說明的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的附圖及其實(shí)施例僅僅是為了示范的目的，并不能對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。在不矛盾的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1用血漿DNA作為起始材料構(gòu)建ALK融合基因突變檢測文庫的方法主要包括以下步驟：(1)抽提血漿DNA：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于抽提血漿DNA的方法和試劑進(jìn)行此步驟。(2)末端補(bǔ)平，之后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于末端補(bǔ)平以及隨后清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可利用T4DNA聚合酶、Klenow酶補(bǔ)平末端。(3)末端懸A，之后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于末端懸A以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可以使上步產(chǎn)物在klenowex-(NewEnglandBiolabs)(是一種改進(jìn)的Klenow酶，其3’-5’外切活性缺失)的作用下將雙鏈末端懸出A堿基。(4)與預(yù)文庫接頭連接，之后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于連接接頭以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可在T4DNA連接酶、T7DNA連接酶或兩種酶的組合的作用下，使末端懸A產(chǎn)物與雙鏈預(yù)文庫接頭連接。其中，預(yù)文庫接頭可商購或自行合成而獲得。本發(fā)明中所用接頭序列示例如下：上鏈(topstrand)：5’-GTCTCATCCCTGCGTGT-3’(SEQIDNO：1)下鏈(bottomstrand)：5’-CACGCAGGGTACGTGT-3’(SEQIDNO：2)(5)對連接的產(chǎn)物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，之后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于PCR擴(kuò)增以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可在熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶Phusion的作用下放大血漿DNA分子的數(shù)目。本發(fā)明中所用預(yù)擴(kuò)增引物序列示例如下：FP：5’-GTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：3)RP：5’-ACACGTACCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：4)(6)擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)化，之后對環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化，即可使每個DNA分子獨(dú)立成環(huán)：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的單鏈DNA環(huán)化酶以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。本發(fā)明中所用夾板序列示例如下：5’-CACGCAGGGTACGTGTGTCTCATCCCTGCGTG-3’(SEQIDNO：5)(7)對純化后的環(huán)化體系中剩余的線性DNA進(jìn)行消化，之后對環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的DNA外切酶以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可在ExonucleaseI(E.coli)以及ExonucleaseIII(E.coli)的作用下完成消化。(8)以環(huán)化DNA為模板，用ALK特異性的背向延伸的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物的5’端含有測序所需要的接頭序列，之后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化：可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適用于PCR擴(kuò)增以及隨后對產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化的方法和試劑進(jìn)行此步驟。例如，可在熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶Phusion的作用下進(jìn)行特異性擴(kuò)增。所述ALK特異性引物序列如表1和表2所示。以下示出利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的方法構(gòu)建ALK基因融合突變檢測文庫的一個具體實(shí)例。步驟1：抽提血漿DNA約20ng。步驟2：制備如表3所示的末端補(bǔ)平反應(yīng)混合液，在20℃溫浴30分鐘；在純化柱上純化DNA樣品，并在32μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。其中，本專利中所使用的洗脫緩沖液為10mMTris-Cl，pH8.0，但適用于本發(fā)明的洗脫緩沖液并不局限于此。表3步驟3：制備如表4所示的用于在3’端加腺嘌呤尾的反應(yīng)混合液，在37℃溫浴30分鐘；在純化柱上純化DNA樣品，并在37μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。表4步驟4：制備如表5所示的含DNA片段與預(yù)文庫接頭的連接反應(yīng)混合液，在20℃溫浴15分鐘，65℃溫浴10分鐘，保持在4℃；用BeckmanAmpureXPbeads回收連接后的血漿DNA樣本，并用48μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。表5步驟5：制備如表6所示的預(yù)擴(kuò)增體系混合液，用BeckmanAmpureXPbeads回收擴(kuò)增得到的預(yù)文庫，并用39μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。PCR方案為：98℃預(yù)變性30秒，98℃變性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共14個循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘。表6步驟6：制備如表7所示的環(huán)化體系，在PCR儀上進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)：95℃30秒，50℃2分鐘，30個循環(huán)。用BeckmanAmpureXPbeads回收環(huán)化產(chǎn)物，并用43μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。表7步驟7：制備如表8所示的線性DNA消化體系，在PCR儀上進(jìn)行消化反應(yīng)：37℃30分鐘。用BeckmanAmpureXPbeads回收環(huán)化消化產(chǎn)物，并用20μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。表8步驟8：制備如表9所示的DNA擴(kuò)增體系，用BeckmanAmpureXPbeads回收擴(kuò)增得到的上機(jī)文庫，并用20μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。PCR方案為：98℃預(yù)變性30秒，98℃變性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后72℃延伸3分鐘。表9結(jié)果：經(jīng)上機(jī)測序驗(yàn)證后表明，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的用于檢測ALK基因融合突變的文庫符合第二代高通量測序的設(shè)計要求。實(shí)施例2實(shí)施例2的構(gòu)建血漿DNA檢測ALK基因融合突變文庫的方法基本上類似于實(shí)施例1，不同之處在于：在實(shí)施例2中，末端補(bǔ)平和末端懸A在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行，省卻了中間純化的步驟。以下示出利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的方法構(gòu)建ALK基因融合突變檢測文庫的一個具體實(shí)例。步驟1：抽提血漿DNA約20ng。步驟2：制備如表10所示的末端補(bǔ)平以及3’端懸A的反應(yīng)混合液，在37℃溫浴20分鐘，并在72℃溫浴20分鐘，從而在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行末端補(bǔ)平和末端懸A；在純化柱上純化DNA樣品，并在37μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。根據(jù)適用于不同設(shè)計需要的不同的反應(yīng)混合液的組成，末端補(bǔ)平和末端懸A的溫度和時間可以有所不同。表10之后的步驟3-7分別與實(shí)施例1中步驟4-8相同。結(jié)果：經(jīng)上機(jī)測序驗(yàn)證后表明，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2構(gòu)建的用于檢測ALK基因融合突變的文庫符合第二代高通量測序的設(shè)計要求。實(shí)施例3以下示出利用根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行組織基因組DNA樣品測序的一個具體實(shí)例。步驟1：抽提組織DNA約200ng，溶于25μlEB中。步驟2：制備如表11所示的反應(yīng)混合液，用片段化酶將組織DNA打斷到200bp左右，在37℃反應(yīng)20分鐘，反應(yīng)完成后加入5μl0.5MEDTA終止反應(yīng)。用BeckmanAmpureXPbeads打斷后的DNA片段，并用41.5μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。表11步驟3：制備如表12所示的末端補(bǔ)平以及3’懸A的反應(yīng)混合液，在37℃溫浴20分鐘，并在72℃溫浴20分鐘，從而在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行末端補(bǔ)平和末端懸出；在純化柱上純化DNA樣品，并在37μl的無菌dH2O或洗脫緩沖液中洗脫。根據(jù)適用于不同設(shè)計需要的不同的反應(yīng)混合液的組成，末端補(bǔ)平和末端懸A的溫度和時間可以有所不同。表12之后的步驟4-8分別與實(shí)施例1中步驟4-8相同。結(jié)果：經(jīng)上機(jī)測序驗(yàn)證后表明，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3構(gòu)建的用于檢測ALK基因融合突變的文庫符合第二代高通量測序的設(shè)計要求。實(shí)施例4：通過高通量測序平臺對實(shí)施例1-3中構(gòu)建的用于檢測ALK基因融合突變的文庫進(jìn)行測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得ALK基因融合突變的3個陽性結(jié)果，如圖4所示。圖4中，基因1代表了轉(zhuǎn)錄本5’的基因，基因2代表了轉(zhuǎn)錄本3’的基因。所示3個樣品中基因的融合均為EML4基因的啟動子及其部分外顯子與ALK基因19號外顯子的融合，但融合位點(diǎn)有差異。圖4還示出了根據(jù)本發(fā)明的方法檢測到的基因融合位點(diǎn)在各個基因上的精確坐標(biāo)，以及融合位點(diǎn)之間存在的堿基重疊和堿基插入情況。例如，對于1號和2號樣品，我們都檢測到了EML4與ALK基因的融合和新的融合位點(diǎn)。此外，我們還分別在兩個樣品的基因融合位點(diǎn)檢測到了一個堿基(c)的重疊和一個堿基(t)的插入。我們還首次在3號樣品中檢測到了3個基因片段的融合，即EML4、EXOC6B和ALK的融合。同時，我們發(fā)現(xiàn)，在EML4與EXOC6B的融合位點(diǎn)沒有堿基重疊或插入情況，而在EXOC6B與ALK的融合位點(diǎn)則發(fā)生了兩個堿基(ac)的重疊。此外，除了獲得與ALK基因融合的配對基因以及具體的融合位點(diǎn)這些信息外，我們還計算了具有基因融合突變的DNA分子數(shù)占總DNA分子數(shù)的比例，得到圖4所示的“突變比例”。該比例可以用來動態(tài)反應(yīng)血液或組織中具有基因融合突變的DNA分子(如腫瘤DNA)的含量，從而用來追蹤治療的效果以及病情的進(jìn)展。發(fā)明人還用第一代測序技術(shù)(Sanger鏈終止法)直接對上述相同的3個樣品進(jìn)行了測序，以驗(yàn)證本發(fā)明的無創(chuàng)檢測ALK基因融合突變方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果如圖5所示。第一代測序的驗(yàn)證結(jié)果與圖4所示ALK的基因融合突變檢測結(jié)果完全相符，證實(shí)了本發(fā)明的檢測方法的準(zhǔn)確度。參考文獻(xiàn)：1.SodaM，ChoiYL，EnomotoM，TakadaS，YamashitaY，etal.(2007)IdentificationofthetransformingEML4-ALKfusiongeneinnon-small-celllungcancer.Nature448：561-5662.SetoT，KiuraK，NishioM，NakagawaK，MaemondoM，etal.(2013)CH5424802(RO5424802)forpatientswithALK-rearrangedadvancednon-small-celllungcancer(AF-001JPstudy)：asingle-arm，open-label，phase1-2study.LancetOncol14：590-5988.GandhiL，JannePA(2012)CrizotinibforALK-rearrangednon-smallcelllungcancer：anewtargetedtherapyforanewtarget.ClinCancerRes18：3737-37423.YiES，BolandJM，MaleszewskiJJ，RodenAC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