本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種金黃色葡萄球菌特異基因的新用途，具體是將其應(yīng)用于建立金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)方法中。

背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌是一群常堆積成葡萄串狀革蘭氏陽性球菌，其在自然界分布廣泛。我國每年因金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件非常多，它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉?？焖贆z測與鑒定食品中病原菌對及時有效控制病原菌傳播、預(yù)防食物中毒有著至關(guān)重要的作用。目前病原菌的檢測主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法，需經(jīng)富集培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定等過程，一般需4到7天，操作繁瑣，費時耗力。本發(fā)明利用生物信息學(xué)尋找出金黃色葡萄球菌特異基因，并針對其設(shè)計引物，建立了金黃色葡萄球菌的檢測方法，實現(xiàn)了簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測出金黃色葡萄球菌的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：本發(fā)明目的在于通過生物信息學(xué)手段獲取可用于鑒定金黃色葡萄球菌的基因，該基因為假定的限制性酶（putativerestrictionenzyme）基因（Genbank登陸號為12329975），其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，該基因為金黃色葡萄球菌特有。本發(fā)明針對該特異基因設(shè)計特異引物，例如：設(shè)計金黃色葡萄球菌檢測用引物，序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，擴(kuò)增靶基因的特異堿基序列，該引物擴(kuò)增序列如SEQIDNO：4所示；所述靶基因為金黃色葡萄球菌putativerestrictionenzyme基因，Genbank登陸號為12329975，所述引物與所述靶基因的555位至641位的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)；利用該檢測引物組可以特異性的檢測金黃色葡萄球菌。本發(fā)明用上述引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測標(biāo)本中是否存在putativerestrictionenzyme基因，進(jìn)而確定標(biāo)本中是否存在金黃色葡萄球菌。本發(fā)明金黃色葡萄球菌特異基因在制備檢測金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，該金黃色葡萄球菌特異基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，該產(chǎn)品含有至少一對特異擴(kuò)增該特異基因的引物序列。本發(fā)明的有益效果在于:通過本地Blast比對和分析，獲得金黃色葡萄球菌的特異基因；針對特異基因設(shè)計特異引物，該引物可以快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測金黃色葡萄球菌。附圖說明圖1為本發(fā)明PCR條件優(yōu)化結(jié)果示意圖，圖中在每個溫度下，Mg2+濃度(從左至右）分別為0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mM；圖2為本發(fā)明特異性檢測圖，圖中M為2000bpmarker，1至3為三株金黃色葡萄球菌，4、肺炎克雷伯菌，5、弗勞地氏枸櫞酸桿菌，6、傷寒桿菌，7、瓊氏不動桿菌，8、大腸桿菌，9、糞腸球菌，10、溶血葡萄球菌，11、表皮葡萄球菌，12、摩氏摩根菌；圖3為本發(fā)明中靈敏度檢測圖，圖中M為2000bpmarker，0至9分別為100個/μL至109個/μL，C為陰性對照。具體實施方式下面通過實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實施例1：特異性靶基因篩選及引物設(shè)計1、本地BLAST分析從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）中下載的金黃色葡萄球菌全基因組序列，對本地的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地BLAST檢索，獲取得到金黃色葡萄球菌各序列片段與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果。2、BLAST重確認(rèn)使用在線BLAST功能，使用2種策略確認(rèn)其菌種特異性和金黃色葡萄球菌鑒定可用性。一種策略為BLAST時排除金黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示無任何相似序列者為金黃色葡萄球菌特異基因；第二種策略為BLAST時選擇在金黃色葡萄球菌內(nèi)進(jìn)行檢索，結(jié)果返回大量相似序列者是不同金黃色葡萄球菌菌株共有序列。結(jié)合兩種策略，最終得出putativerestrictionenzyme符合兩種策略標(biāo)準(zhǔn)。3、引物設(shè)計針對金黃色葡萄球菌putativerestrictionenzyme基因，設(shè)計特異引物；金黃色葡萄球菌特異引物通過在線設(shè)計特異性寡核苷酸引物工具Primer-BLAST設(shè)計完成；設(shè)計步驟和注意事項參照Primer-BLAST使用說明書進(jìn)行。實施例2：檢測方法的建立1、DNA的提取用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液5mL，12,000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清；(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入500μL細(xì)胞懸浮液，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，37℃溫浴30分鐘，每隔10分鐘顛倒混勻數(shù)次，12,000rpm離心2分鐘，盡量吸凈上清；(3)向菌體沉淀中加入225μL緩沖液A，振蕩至菌體徹底懸浮；(4)向管中加入6μLRNaseA溶液，振蕩15秒，室溫放置5分鐘；(5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，顛倒混勻；(6)加入25μL裂解緩沖液S，顛倒混勻；(7)加入250μL緩沖液B，振蕩10秒，70℃放置10分鐘，12,000rpm離心1分鐘，取上清放入一新管中，棄去沉淀；(8)加入250μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(9)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500μL緩沖液C，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；(11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中；(12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm離30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。然后12,000rpm離心2分鐘；將吸附柱置于一個新的1.5mL離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(13)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。2、PCR條件優(yōu)化：一、對退火溫度和Mg2+同時進(jìn)行優(yōu)化；退火溫度為6個梯度，49、51、53、55、57、59℃；Mg2+濃度為5個梯度，0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM；所述通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測金黃色葡萄球菌條件優(yōu)化擴(kuò)增體系為25μL；具體反應(yīng)體系為：TaqDNA聚合酶0.125μL，10×聚合酶緩沖液2.5μL，dNTP2μL，Mg2+分別為0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O補(bǔ)足25μL。二、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：(1)預(yù)變性95℃5分鐘(2)30個循環(huán)：95℃30秒鐘49、51、53、55、57、59℃30秒鐘72℃20秒鐘(3)后擴(kuò)增72℃1分鐘最終確立Mg2+為4.0mM，退火溫度為59℃條件為檢測的最優(yōu)化條件，結(jié)果如圖1所示。3、特異性檢測一、收集金黃色葡萄球菌臨床分離株3株，非金黃色葡萄球菌9株。將這些菌株用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒提取基因組，步驟如下：(1)取細(xì)菌培養(yǎng)液5mL，12,000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清；(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入500μL細(xì)胞懸浮液，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，37℃溫浴30分鐘，每隔10分鐘顛倒混勻數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，盡量吸凈上清；(3)向菌體沉淀中加入225μL緩沖液A，振蕩至菌體徹底懸??；(4)向管中加入6μLRNaseA溶液，振蕩15秒，室溫放置5分鐘；(5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，顛倒混勻；(6)加入25μL裂解緩沖液S，顛倒混勻；(7)加入250μL緩沖液B，振蕩10秒，70℃放置10分鐘。12,000rpm離心1分鐘，取上清放入一新管中，棄去沉淀；(8)加入250μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(9)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500μL緩沖液C，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；(11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中；(12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm離30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中，然后12,000rpm離心2分鐘；將吸附柱置于一個新的1.5mL離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(13)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。二、PCR反應(yīng)體系：把每個菌株的基因組分別用作模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)體系為25μL，Taq0.125μL，10×聚合酶緩沖液2.5μL，dNTP2μL，Mg2+4.0μL，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O補(bǔ)足25μL。三、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：(1)預(yù)變性95℃5分鐘(2)30個循環(huán)：95℃30秒鐘59℃30秒鐘72℃20秒鐘(3)后擴(kuò)增72℃1分鐘在Mg2+為4.0mM，退火溫度為59℃的條件下，該檢測方法可以特異性的檢測出金黃色葡萄球菌，而不受其他菌種影響，如圖2所示。4、靈敏度檢測一、陽性質(zhì)粒載體構(gòu)建1、以金黃色葡萄球菌基因組為模板，用上述特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為100μL，Taq0.5μL、10×聚合酶緩沖液10μL、dNTP8μL、Mg2+16μL、模板4μL、上下游引物各4μL，加ddH2O補(bǔ)足100μL。2、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增(1)預(yù)變性95℃5分鐘(2)30個循環(huán)：95℃30秒鐘59℃30秒鐘72℃20秒鐘(3)后擴(kuò)增72℃1分鐘；3、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：(1)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量；(2)向膠塊中加入2倍體積溶膠液，55℃水浴10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；(3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(4)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(5)向吸附柱中加入50μL漂洗液W2，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(6)將吸附柱放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7)將吸附柱放入一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30μL的洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。4、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)挑取單個DH5α菌落，接種于3mL不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50mLLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩2小時，當(dāng)OD600值達(dá)到0.35時，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物；(2)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個50mL預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻；(3)于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置l分鐘以使殘留的培養(yǎng)基流盡；(4)每50mL初始培養(yǎng)液且30mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重懸細(xì)胞沉淀；(5)于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出上清液，并將管倒置l分鐘以使殘留的液體流盡；(6)每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后備用。5、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(1)在微量離心管中加入1μLTakarapMD19-Tsimple載體、4μLputativerestrictionenzyme基因PCR產(chǎn)物及5μL的連接酶緩沖混合物；(2)16℃反應(yīng)3小時；(3)全量（10μL）加入至100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；(4)42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘；(5)加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μL，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；(6)取200μL涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h以形成單菌落。6、putativerestrictionenzyme基因PCR產(chǎn)物篩選及鑒定挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)4h，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件同前述最優(yōu)反應(yīng)條件，將經(jīng)PCR確證的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取后，以美國AppliedBiosystems3730A全自動核苷酸序列測定儀進(jìn)行核苷酸序列的測定，測序引物為BcaBESTTMSequencingPrimerM13-47（5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’），目的片段測序結(jié)果自5’端至3’端序列為:agacgaacaacaaatatctcggctatatgaaaaatttattctagagtactataaaaaagaatttccagagcttgttgtaacatcatc。7、陽性質(zhì)粒提取(1)取5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12,000rpm離心1分鐘，盡量吸除上清；(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；(3)向離心管中加入250μL溶液2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6－8次使菌體充分裂解；(4)向離心管中加入350μL溶液3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6–8次，充分混勻，即出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10分鐘，此時在離心管底部形成沉淀；將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(7)將吸附柱放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(8)將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加60μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。二、金黃色葡萄球菌靈敏度1、質(zhì)粒數(shù)目換算用紫外分光光度計測得質(zhì)粒濃度為：157ng/μL；質(zhì)粒數(shù)目換算公式：（注：X為質(zhì)粒濃度；Y為質(zhì)粒堿基對數(shù)；NA為阿伏伽德羅常數(shù)；2692為載體堿基對數(shù)；660為堿基平均分子量）得到putativerestrictionenzyme陽性質(zhì)粒的濃度為5.15×109個/μL；2、取1μLputativerestrictionenzyme陽性質(zhì)粒稀釋到1.0×109個/μL，取2μL稀釋好的陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成1.0×108至1.0×1009個梯度；分別取每個梯度稀釋液2μL為模板；反應(yīng)體系為25μL，Taq0.125μL、10×聚合酶緩沖液2.5μL、dNTP2μL、Mg2+4.0μL、模板2μL、上下游引物各1μL，加ddH2O補(bǔ)足25μL。3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：(1)預(yù)變性95℃5分鐘(2)30個循環(huán)：95℃30秒鐘59℃30秒鐘72℃20秒鐘(3)后擴(kuò)增72℃1分鐘在Mg2+為4.0mM，退火溫度為59℃的條件下，該檢測方法可以檢測到金黃色葡萄球菌的最低濃度為1個/μL，如圖3所示。序列表<110>昆明理工大學(xué)<120>一種金黃色葡萄球菌特異基因的用途<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1agacgaacaacaaatatctcggct24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2gatgatgttacaacaagctctgga24<210>3<211>1041<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>3atgattaatattaaaaatatttattatatgttatcttatgcatttacagtacttaacaaa60aaaggctatcagaagttagcaacagaacaatttgaaaatatatttgatttatattcagct120attcttataaaaggtatatcaagtcagttaaatagtggacttcatcatgaatatatagaa180cagacagattctctaaaagttattaggggaaaagttgatgttaagaattctatacaaggc240ttaggagttttaagtcaacgtattaattgtatttatgatgaattttcattaaatacatac300atgaacaagattttaaaaactacaatgaaatgtttaataaaaacagatatttctagaaag360aataagataaagctccgaaagttattagttcattttaataatgttgatactttagattat420agaaatattcaatggtatcattcgtttgatcgaaataatcagacgtataaaatgttaata480tctatatgctatttaatttttcaaggagtaatacaaactgaaagcaagggacaaaatgat540cttatggtatttgtagacgaacaacaaatatctcggctatatgaaaaatttattctagag600tactataaaaaagaatttccagagcttgttgtaacatcatcaaatattcaatggtcatta660gataatgatgataacgtgaatatgcttcctgtaatgagaagtgatattatgttgagatat720aaagataaatgtctaattatcgatgcaaaattttataaaaatacattacacaattattat780gatactaaaaagatccattcaactaacctgtatcaaatatttacttacgtgaaaaaccaa840caattaaatttaaaaaagaaagcaatacaggtctcaggaatgttgttatatgctaaaaca900gacgaaaatattgttttgaacgataaatttcatatgagtggtagtcaaatcattattaag960acattagatttgaactgtaattttactattattaaaaaacagttgaatgggatagttaat1020gatatatttttactaaaataa1041<210>4<211>87<212>DNA<213>Staphylococcusaureus<400>4agacgaacaacaaatatctcggctatatgaaaaatttattctagagtactataaaaaaga60atttccagagcttgttgtaacatcatc87