本發(fā)明涉及一種雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，屬于細胞培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：單克隆抗體藥物是有別于傳統(tǒng)化學(xué)藥物的生物類藥物。它通過與相應(yīng)抗原結(jié)合，清除抗原表達細胞，達到治療目的。目前已經(jīng)廣發(fā)應(yīng)用于腫瘤和自身免疫性疾病的治療，是近來藥物研發(fā)的熱點?，F(xiàn)今，已經(jīng)上市的單克隆抗體藥物已達數(shù)十種，許多是當年年銷售額超過10億美元的“重磅炸彈”藥物。國內(nèi)外著名藥企正在開發(fā)并已經(jīng)進入臨床實驗的單克隆抗體藥物也有數(shù)十種，華爾街預(yù)測，未來單克隆抗體藥物的市場份額將達到350億美元。單克隆抗體是由雜交瘤細胞分泌而成。雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液是促進雜交瘤細胞增殖，分泌單克隆抗體的關(guān)鍵因素。一個好的雜交瘤無血清培養(yǎng)液不但能夠提高單克隆抗體的產(chǎn)量，還能夠便于下游單克隆抗體的純化。目前市場已有幾款雜交瘤無血清培養(yǎng)液，但是在單位單克隆抗體的產(chǎn)量和后續(xù)抗體純化方面仍顯不足，需要進一步改進和提升，來提高單位單克隆抗體的產(chǎn)量和減少下游單克隆抗體的純化步驟，節(jié)省藥物的制作成本。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于單克隆抗體生產(chǎn)的雜交瘤細胞無血 清培養(yǎng)液，以解決上述問題。本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：一種雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，其特征在于，包括：RPMI1640培養(yǎng)基，以及額外添加于RPMI1640培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組分，營養(yǎng)組分的種類和單位體積的添加質(zhì)量如下：類胰島素-I類活性多肽4.75-5.25mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白活性多肽1.9-2.1mg/L。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，還可以具有這樣的特征：其中，類胰島素-I類分子活性多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)鐵蛋白活性多肽的序列的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，還可以具有這樣的特征：其中，營養(yǎng)組分還包括額外添加的L-精氨酸157～173mg/L，L-天門冬酰胺53-59mg/L，L-天門冬氨酸17-19mg/L，L-谷氨酸19-21mg/L，L-谷氨酰胺190-210mg/L，甘氨酸14-16mg/L，L-組氨酸23.75-26.5mg/L，L-異亮氨酸53-59mg/L，L-賴氨酸鹽酸33-37mg/L，L-蛋氨酸23.75-26.5mg/L，L-苯丙氨酸21.85-25mg/L，L-脯氨酸19-21mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-絲氨酸28.5-31.5mg/L，L-蘇氨酸21-23mg/L，L-色氨酸11-12.6mg/L，L-纈氨酸23-26mg/L，L-亮氨酸52-58mg/L，β-巰基乙醇2.85-3.15mg/L，二水L-酪氨酸二鈉304-336mg/L，乙醇胺2.85-3.15mg/L，L-胱氨酸二鹽酸52.25-57.75mg/L，地塞米松0.002-0.004mg/L，CuSO4·5H2O0.0095-0.0105mg/L，MnCl2·4H2O0.0004-0.0006mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00007-0.00009mg/L，ZnSO4·7H2O 0.19-0.21mg/L，CoCl2·6H2O0.004-0.006mg/L，SnC12·2H2O0.00005-0.00007mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.15-1.25mg/L，維生素C0.475-0.525mg/L，對羥基苯甲酸0.95-1.05mg/L，丙酮酸鈉190-210mg/L，亞油酸0.025-0.035mg/L。優(yōu)選的，上述營養(yǎng)組分還包括額外添加的L-精氨酸165mg/L，L-天門冬酰胺56mg/L，L-天門冬氨酸18mg/L，L-谷氨酸20mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，甘氨酸15mg/L，L-組氨酸25mg/L，L-異亮氨酸56mg/L，L-賴氨酸鹽酸35mg/L，L-蛋氨酸25mg/L，L-苯丙氨酸23mg/L，L-脯氨酸20mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-絲氨酸30mg/L，L-蘇氨酸22mg/L，L-色氨酸12mg/L，L-纈氨酸25mg/L，L-亮氨酸55mg/L，β-巰基乙醇3.0mg/L，二水L-酪氨酸二鈉320mg/L，乙醇胺3mg/L，L-胱氨酸二鹽酸55mg/L，地塞米松0.003mg/L，CuSO4·5H2O0.001mg/L，MnCl2·4H2O0.0005mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00008mg/L，ZnSO4·7H2O0.2mg/L，CoCl2·6H2O0.005mg/L，SnC12·2H2O0.00006mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.2mg/L，維生素C0.5mg/L，對羥基苯甲酸1.0mg/L，丙酮酸鈉200mg/L，亞油酸0.03mg/L。另外，本發(fā)明還提供上述任意一項的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液在單克隆抗體生產(chǎn)過程中的應(yīng)用。發(fā)明的有益效果根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，與現(xiàn)有雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液相比，具有以下優(yōu)勢：1.不含有大分子蛋白，利于后續(xù)單克隆抗體的純化2.與市場上的同類產(chǎn)品相比，單克隆抗體的表達量提升20％?？梢詼p少單克隆抗體的生產(chǎn)成本。具體實施方式以下說明本發(fā)明的具體實施方式。以下各實施例中所使用的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基成分如表1所示。表1：RPMI-1640細胞培養(yǎng)基成分<實施例一>本實施方式中所使用的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液，成分包括：RPMI1640培養(yǎng)基，以及額外添加于RPMI1640培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組分，營養(yǎng)組分的種類和單位體積的添加質(zhì)量如下：類胰島素-I類分子活性多肽4.75mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白活性多肽1.9mg/L，L-精氨酸157mg/L，L-天門冬酰胺53mg/L，L-天門冬氨酸17mg/L，L-谷氨酸19mg/L，L-谷氨酰胺190mg/L，甘氨酸14mg/L，L-組氨酸23.75mg/L，L-異亮氨酸53mg/L，L-賴氨酸鹽酸33mg/L，L-蛋氨酸23.75mg/L，L-苯丙氨酸21.85mg/L，L-脯氨酸19mg/L，葡萄糖2500mg/L，L-絲氨酸28.5mg/L，L-蘇氨酸21mg/L，L-色氨酸11mg/L，L-纈氨酸23mg/L，L-亮氨酸52mg/L，β-巰基乙醇2.85mg/L，二水L-酪氨酸二鈉304mg/L，乙醇胺2.85mg/L，L-胱氨酸二鹽酸52.25mg/L，地塞米松0.002mg/L，CuSO4·5H2O0.0095mg/L，MnCl2·4H2O0.0004mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00007mg/L，ZnSO4·7H2O0.19mg/L，CoCl2·6H2O0.004mg/L，SnC12·2H2O0.00005mg/L，Na2SeO30.002mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.15mg/L，維生素C0.475mg/L，對羥基苯甲酸0.95mg/L，丙酮酸鈉190mg/L，亞油酸0.025mg/L。<實施例二>RPMI1640培養(yǎng)基，以及額外添加于RPMI1640培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組分，營養(yǎng)組分的種類和單位體積的添加質(zhì)量如下：類胰島素-I類分子活 性多肽5mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白活性多肽2mg/L，營養(yǎng)組分還包括額外添加的L-精氨酸165mg/L，L-天門冬酰胺56mg/L，L-天門冬氨酸18mg/L，L-谷氨酸20mg/L，L-谷氨酰胺200mg/L，甘氨酸15mg/L，L-組氨酸25mg/L，L-異亮氨酸56mg/L，L-賴氨酸鹽酸35mg/L，L-蛋氨酸25mg/L，L-苯丙氨酸23mg/L，L-脯氨酸20mg/L，葡萄糖2500-3000mg/L，L-絲氨酸30mg/L，L-蘇氨酸22mg/L，L-色氨酸12mg/L，L-纈氨酸25mg/L，L-亮氨酸55mg/L，β-巰基乙醇3.0mg/L，二水L-酪氨酸二鈉320mg/L，乙醇胺3mg/L，L-胱氨酸二鹽酸55mg/L，地塞米松0.003mg/L，CuSO4·5H2O0.001mg/L，MnCl2·4H2O0.0005mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00008mg/L，ZnSO4·7H2O0.2mg/L，CoCl2·6H2O0.005mg/L，SnC12·2H2O0.00006mg/L，Na2SeO30.002mg/L～0.01mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.2mg/L，維生素C0.5mg/L，對羥基苯甲酸1.0mg/L，丙酮酸鈉200mg/L，亞油酸0.03mg/L。<實施例三>RPMI1640培養(yǎng)基，以及額外添加于RPMI1640培養(yǎng)基中的營養(yǎng)組分，營養(yǎng)組分的種類和單位體積的添加質(zhì)量如下：類胰島素-I類分子活性多肽5.25mg/L，人轉(zhuǎn)鐵蛋白活性多肽2.1mg/L。營養(yǎng)組分還包括額外添加的L-精氨酸173mg/L，L-天門冬酰胺59mg/L，L-天門冬氨酸19mg/L，L-谷氨酸21mg/L，L-谷氨酰胺210mg/L，甘氨酸16mg/L，L-組氨酸26.5mg/L，L-異亮氨酸59mg/L，L-賴氨酸鹽酸37mg/L，L-蛋氨酸26.5mg/L，L-苯丙氨酸25mg/L，L-脯氨酸21mg/L，葡萄糖3000mg/L，L-絲氨酸31.5mg/L，L-蘇氨酸23mg/L，L-色氨酸12.6mg/L，L-纈氨酸 26mg/L，L-亮氨酸58mg/L，β-巰基乙醇3.15mg/L，二水L-酪氨酸二鈉336mg/L，乙醇胺3.15mg/L，L-胱氨酸二鹽酸57.75mg/L，地塞米松0.004mg/L，CuSO4·5H2O0.0105mg/L，MnCl2·4H2O0.0006mg/L，Ni(NO3)2·6H2O0.00009mg/L，ZnSO4·7H2O0.21mg/L，CoCl2·6H2O0.006mg/L，SnC12·2H2O0.00007mg/L，Na2SeO30.01mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O1.25mg/L，維生素C0.525mg/L，對羥基苯甲酸1.05mg/L，丙酮酸鈉210mg/L，亞油酸0.035mg/L。<對比例一>比較上述三個實施例所提供的雜交瘤無血清培養(yǎng)液與GibcoAGT雜交瘤無血清培養(yǎng)液對雜交瘤細胞增殖和單克隆抗體表達量的作用。選取可以分別表達CD4，Her2/neu，gp100單克隆抗體的GK1.5，雜交瘤細胞作為對照檢測細胞。首先接種1×106個分別至25ml實施例一至三中所提供的培養(yǎng)液中。同時接種GK1.5，HN-1以及GP1到25mlGibcoAIMV培養(yǎng)液中。放置于CO2培養(yǎng)箱中。72小時后，收取培養(yǎng)上清，通過間接ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中抗CD4、Her2/neu和gp100抗體的效價來比較各培養(yǎng)液對單克隆抗體產(chǎn)量的影響。結(jié)果如表2所示，表2中BM-I-1代表實施例一所提供的培養(yǎng)基配方，BM-I-2代表實施例一所提供的培養(yǎng)基配方，BM-I-3代表實施例一所提供的培養(yǎng)基配方。表2：小規(guī)模培養(yǎng)條件下各培養(yǎng)液培養(yǎng)效果的比較<對比例二>在5L發(fā)酵罐中，進行中試實驗來比較在擴大培養(yǎng)過程中，本發(fā)明的培養(yǎng)液與現(xiàn)有培養(yǎng)液對細胞增殖和單克隆抗體的影響。如前，分別接種50ml濃度為1×106GK1.5，HN-1以及GP1細胞到5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液分別為實施例一至三中所提供的雜交瘤無血清培養(yǎng)液與GibcoAIMV雜交瘤無血清培養(yǎng)液。在發(fā)酵罐設(shè)置37℃和5％CO2的條件下，攪拌培養(yǎng)72小時后，分別取1ml細胞懸液，計數(shù)細胞濃度。另分別取1ml細胞懸液，離心后，取上清。通過間接ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中抗CD4抗體的效價來比較兩種培養(yǎng)液在擴大中試培養(yǎng)中對單克隆抗體產(chǎn)量的影響。結(jié)果分析如表3所示：表3：中試實驗條件下各培養(yǎng)液培養(yǎng)效果的比較細胞系GibcoAGTBM-I-1BM-I-1BM-I-1單抗?jié)舛?ug/ml)單抗?jié)舛?ug/ml)單抗?jié)舛?ug/ml)單抗?jié)舛?ug/ml)GK1.535.2739.1540.0139.62HN-133.0938.2339.1338.50GP133.4638.1438.2138.09從對比例一和對比例二的結(jié)果中可以看出，本發(fā)明的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液與市場同類產(chǎn)品相比，單克隆抗體的表達量提升20％。因此可以有效減少單克隆抗體的生產(chǎn)成本。當前第1頁1 2 3