本發(fā)明涉及中藥化學(xué)及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)中得到的一個(gè)新化合物、制備方法和藥物用途。

背景技術(shù)：

海芋(Alocasia macrorrhiza(L.)SCHOTT)為天南星科海芋屬植物，主要分布于我國(guó)廣東、四川等地，喜生于溪谷濕地或田邊，是著名的壯藥，最早記載于《廣西實(shí)用中草藥新選》，其味微苦，大寒，有毒，有解毒退熱，消腫鎮(zhèn)痛之功效。臨床多用于治療鉤端螺旋體病、毒蛇咬傷等，也可配伍甘草等治療哮喘^[3]。值得關(guān)注的是，其根莖在中醫(yī)臨床被用于治療乳腺癌，效果良好，且四川等地民間常用其水煎液口服治療各種癌癥，亦有良好效果。迄今，海芋的化學(xué)研究只有2篇文獻(xiàn)見諸報(bào)道：Kaur等從卜芥中分離得到一種對(duì)人宮頸癌細(xì)胞有一點(diǎn)細(xì)胞毒活性(IC₅₀＝100μg/mL)的外源凝集素N-acetyl-D-lactosamine。我們利用氣質(zhì)聯(lián)用的方法對(duì)其50％乙醇提取物的石油醚部位進(jìn)行化學(xué)研究，鑒定了其中43個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，主要成分為長(zhǎng)鏈不飽和脂肪。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一個(gè)新化合物的結(jié)構(gòu)及其在制備抗腫瘤藥物中的運(yùn)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

本發(fā)明目的在于提供一個(gè)從海芋中得到的新化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供提取、分離本發(fā)明新化合物的方法。

本發(fā)明的另一目的是上述新化合物在制備抗腫瘤的藥物方面的用途。

本發(fā)明的目的通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明人從尖尾芋中分離得到一個(gè)新化合物，其結(jié)構(gòu)如附圖1所示。

該新化合物從尖尾芋中分離得到，其方法包括以下步驟：

(1)取海芋根莖，用溶劑提取，回收提取液，得到稠浸膏。

(2)將稠浸膏經(jīng)過大孔樹脂、正相和反相以及凝膠色譜層析分離，得到目標(biāo)化合物。

提取溶劑可以是水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶劑以及任意比例混合的醇水溶劑，優(yōu)選5％-100％的含水甲醇或乙醇。提取方法可以是煎煮、回流、冷浸、滲漉、微波提取或超聲提取，優(yōu)選是回流和超聲提取。

提取液濃縮后可通過極性或非極性大孔吸附樹脂，用水洗去雜質(zhì)，用含水低于95％的甲醇或乙醇進(jìn)行洗脫，將含有目標(biāo)化合物1和2的洗脫液進(jìn)行濃縮，得 到精制液。也可以用正相和反相硅膠，優(yōu)選反相硅膠，用洗脫液洗脫，收集含有目標(biāo)化合物1和2的濃縮，分別得到精制液。

濃縮后的精制液分別可在硅膠、氧化鋁等正相吸附材料中進(jìn)行色譜分離，也可在硅烷鍵合硅膠、含有氰基或氨基的硅烷鍵合硅膠等反相材料中進(jìn)行色譜分離，收集含有目標(biāo)化合物的洗脫液，洗脫液重結(jié)晶或蒸干溶劑后分別得到該新化合物。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制生長(zhǎng)作用。

附圖說明

附圖1.化合物1的結(jié)構(gòu)式

附圖2.化合物1的HMBC譜

具體實(shí)施例

實(shí)施例1.新化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide的制備。

干燥海芋根莖粉末4kg，用50％的含水乙醇提取三次，每次10升，合并提取液，提取液過濾，濾液減壓回收溶劑，得稠浸膏200g。稠浸膏用D101柱層析進(jìn)行分離，分別用水、20％和40％含水乙醇進(jìn)行洗脫，40％含水乙醇洗脫液減壓回收溶劑，得稠浸膏35g。該稠浸膏用正相硅膠柱層析分離、梯度洗脫，洗脫劑為氯仿-甲醇-水，根據(jù)薄層層析情況分成5個(gè)部分(fr.A-fr.E)。fr.B(2.6g)進(jìn)行反復(fù)硅膠和凝膠柱層析分離得到化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide。

實(shí)施例2.新化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-metho-xyphenyl)acry-lamide結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物1為白色無定型粉末，茴香醛-硫酸顯色顯綠色，以及Ehrlich反應(yīng)呈陽性提示該化合物含有吲哚基團(tuán)。

UV光譜在223、280、270和299nm的特征強(qiáng)吸收揭示該化合物含有吲哚基團(tuán)。

IR光譜在1619、1489、1480cm^-1處有強(qiáng)烈吸收提示該化合物有吲哚苯環(huán)存在，3486cm^-1、1646cm^-1處有強(qiáng)吸收提示有酰胺羰基官能團(tuán)存在。

由負(fù)離子高分辨HR-ESI-MS(m/z 365.1138)推定分子式為C₂₁H₂₀O₅N₂，不飽和度為12。

¹H NMR給出2個(gè)芳環(huán)ABX系統(tǒng)，1對(duì)反式雙鍵，1個(gè)雜環(huán)質(zhì)子，4個(gè)活潑氫質(zhì)子，1個(gè)亞甲基雙氫質(zhì)子，分別為(δ ppm)：[6.92(d，J＝8.0)，7.15(d d， J＝1.6，8.0)，7.29(d，J＝1.6)]，[7.38(d，J＝8.8)，6.82(d d，J＝2.4，8.8)，7.68(d，J＝2.4)]，[7.48(d，J＝15.6)，6.80(d，J＝15.6)]，8.45(d，J＝3.2)，11.7(s)，9.57(s)，9.31(s)，8.34(t，J＝5.6)，4.68(2H，d，J＝5.6)，提示該化合物含雙取代吲哚和鄰位雙取代苯反式乙稀結(jié)構(gòu)片段。¹³C NMR和DEPT譜給出21個(gè)碳，其中有16個(gè)芳香碳和烯碳，2個(gè)羰基碳，1個(gè)甲氧基碳，1個(gè)甲乙基碳，1個(gè)亞甲基碳；據(jù)HMQC把其碳譜和氫譜化學(xué)位移對(duì)應(yīng)起來和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，結(jié)合上述顯色反應(yīng)，紫外和紅外光譜，推斷化合物1含(反式)N-阿魏酸?；鶊F(tuán)^[12]，6′-羥基吲哚基團(tuán)；如前所述，化合物1還含有1個(gè)羰基(δ(C)190.4)和1個(gè)亞甲基((δ(C)46.3，δ(2H)4.68)，HMBC譜(表1，圖2)顯示δ 190.4和δ 166.1兩個(gè)羰基均和亞甲基氫相關(guān)，所以該亞甲基4.68(2H，d，J＝5.6)連接δ 190.4羰基和(反式)N-阿魏酸?；鶊F(tuán)中的酰胺基，又δ 190.4羰基和6′-羥基吲哚基團(tuán)中的2′位質(zhì)子(δ 8.45)相關(guān)，并且其中的4′位C(δ 113.1)也和它相關(guān)，所以羰基δ 190.4連接于6′-羥基吲哚基團(tuán)的2′位和亞甲基之間，即乙酮基連接了(反式)N-阿魏酸酰基和6′-羥基吲哚2個(gè)化合物1主要結(jié)構(gòu)片段。并如HMBC譜(圖2)所示δ 131.1和A′B′X′自旋系統(tǒng)中的B′質(zhì)子6.82(d d，J＝2.4，8.8)相關(guān)，而126.96不和該質(zhì)子相關(guān)，δ153.6和A′B′X′自旋系統(tǒng)中3個(gè)質(zhì)子7.38(d，J＝8.8)，6.82(d d，J＝2.4，8.8)，7.68(d，J＝2.4)均相關(guān)，所以δ 131.05，126.96，153.6分別定位于4′a，7′a，6′位，即證實(shí)了該結(jié)構(gòu)片段是6′-羥基吲哚基團(tuán)。δ 148.3碳和甲氧基質(zhì)子(δ 3.94)相關(guān)，但它和ABX自旋系統(tǒng)中的B質(zhì)子(δ 7.15)不相關(guān)，所以甲氧基連于6位，δ 148.8碳和ABX自 旋系統(tǒng)中的三個(gè)質(zhì)子6.92(d，J＝8.0)，7.15(d d，J＝1.6，8.0)，7.29(d，J＝1.6)均相關(guān)，所以該碳定位于7位并連接羥基，即證實(shí)了該結(jié)構(gòu)片段是(反式)N-阿魏酸?；鶊F(tuán)。綜上所述化合物1結(jié)構(gòu)推斷為(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3--(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acry-lamide。該化合物氫譜、碳譜及HMBC譜全歸屬如表1所示。

表1、化合物(E)-N-(2-(6-hydroxy-1H-indol-2-yl)-2-oxoethyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acry-lamide氫譜、碳譜及HMBC譜全歸屬(DMSO-d₆，δ，ppm.O-TMS).

實(shí)施例5.新化合物1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

1.材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器

SF-160 B型高速粉碎機(jī)(上海中聯(lián)制藥裝備有限公司)；R200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；QL-9010旋渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；FA 2104 N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)

1.1.2試藥

二甲亞砜(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；胰蛋白酶(Thermo公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(Thermo公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；超純水(自制)；尖尾芋藥材(2010年4月采自四川)；其余試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠)

1.1.3實(shí)驗(yàn)材料

P-388、HT-29。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)：

1.2.1.2.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)方法：

接板：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待篩選細(xì)胞(除K-562人骨髓性的白血病細(xì)胞外)， 胰蛋白酶消化，吸取適量含細(xì)胞的培養(yǎng)液至加樣槽中，加適量空白培養(yǎng)液，用排槍接取加入96孔板中，每孔100μL，5％CO₂，37℃孵育。

加樣：待細(xì)胞貼壁后后，加入梯度濃度(孔濃度100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL)供試品，設(shè)置5個(gè)梯度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，每孔100μL。

檢測(cè)：分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入MTT 10uL(0.5g/L)，孵育4-6h，棄去上清，每孔加入DMSO溶液150uL，振蕩15min，待結(jié)晶充分溶解后，在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光光度(OD)值，計(jì)算樣品抑制率(inhibitory rate，IR)，以及腫瘤細(xì)胞存活率(survival rate，SR)。

IR＝(空白組OD值-加藥組OD值)/空白組OD值×100％

SR＝(1-IR)×100％

檢測(cè)結(jié)果表明新化合物對(duì)P-388和HT-29有顯著的抑制作用，IC₅₀分別為2.9±0.3、1.6±0.8(ug/mL)。

以上藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：上述來自中藥海芋得到的新化合物具有顯著的細(xì)胞毒活性，因?yàn)槌Ｒ?guī)抗腫瘤化合物的體外活性篩選是以化合物的細(xì)胞毒活性來體現(xiàn)的，所以本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，可以與藥用載體混合，制備抗腫瘤藥物。