本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌的制備方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌是一類重要的益生菌生產(chǎn)菌株，相對(duì)于其他類型益生菌(如乳酸菌)，芽孢桿菌一般對(duì)營養(yǎng)要求簡單，代謝速度快，而且易于分離、培養(yǎng)和保藏，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)條件不苛刻，此外，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢對(duì)熱、紫外線、電離輻射和低pH(2-3)等不良環(huán)境有極強(qiáng)的抵抗能力。因此，芽孢桿菌作為益生菌劑易于保存，使用方便?；钚猿煞指撸泻艽蟮耐茝V和應(yīng)用價(jià)值，芽孢桿菌常以芽孢的形式作為飼料添加劑。
枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活菌數(shù)量低、芽孢形成率低等問題。提高活菌數(shù)尤其是提高芽孢形成率，對(duì)以芽孢的形式作為飼料添加劑生產(chǎn)有著積極意義。目前文獻(xiàn)報(bào)道枯草芽孢桿菌發(fā)酵技術(shù)制備得率是80-120cfu/ml左右，其中芽孢得率在40％-90％。研究重點(diǎn)多集中在培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和初始pH等方面，忽視了發(fā)酵過程pH調(diào)控可能帶來的影響。
中國專利CN 102168055A公布了一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法，該方法是經(jīng)激活枯草芽孢桿菌、二步發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品。先接種激活的枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為35～38℃、罐壓0.02～0.06Mpa、通氣比例為1∶0.5～1∶1、攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為150rpm～200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)8～14小時(shí)，得到種子菌液，再將種子菌液接種培養(yǎng)20～26小時(shí)，得到高芽孢率枯草芽孢桿菌液體產(chǎn)品。本發(fā)明方法的培養(yǎng)基成分易得且價(jià)格便宜、工藝參數(shù)簡單、發(fā)酵周期短，所得的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)高，并且芽孢率高，達(dá)到3.0×109CFU/ml以上，顯著提高產(chǎn)品的芽孢數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量。但是上述方法同樣是通過優(yōu)化培養(yǎng)基來提高芽孢率的。同時(shí)上述專利中培養(yǎng)基成分復(fù)雜，尤其是碳源和氮源。既有豆粕又有黃豆；尿素在高溫下可進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成縮二脲、縮三脲和三聚氰酸。三聚氰酸很 容易生成三聚氰胺。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種高活菌數(shù)、高芽孢形成率的枯草芽孢桿菌的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)將枯草芽孢桿菌菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行斜面培養(yǎng)；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，進(jìn)行種子培養(yǎng)；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵開始到5～6小時(shí)不控制pH值，在5～6小時(shí)到8小時(shí)之間pH值控制在6.0-6.5之間，8小時(shí)后pH控制在7.0-7.5之間至發(fā)酵結(jié)束，得到枯草芽孢桿菌產(chǎn)品，枯草芽孢桿菌產(chǎn)品中活菌數(shù)200-400cfu/ml，芽孢形成率87～92％。
所述的斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。
進(jìn)行斜面培養(yǎng)的條件為：將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子.
所述的種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L。
進(jìn)行種子培養(yǎng)的條件為：控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：豆粕25-35g/L，玉米粉5-15g/L，酵母粉0.1-1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.1-1g/L，硫酸亞鐵0.1-1g/L，碳酸鈣0.1-1g/L硫酸錳0.1-1g/L，氯化鈉1-10g/L。
作為優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L。
進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：控制發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35～38℃，從發(fā)酵開始到5～6小時(shí)不控制pH值，在5～6小時(shí)到8小時(shí)之間添加氨水控制pH值在6.0-6.5 之間，8小時(shí)后開始補(bǔ)加磷酸溶液使pH控制在7.0-7.5之間，至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵培養(yǎng)總時(shí)間為48-56h。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
1、采用新的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，尤其是對(duì)碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化，碳源和氮源的優(yōu)化是通過對(duì)眾多碳源、氮源進(jìn)行單因子的篩選，在此基礎(chǔ)上選取一些因子，再設(shè)計(jì)不同濃度和因素的正交試驗(yàn)；通過多次正交試驗(yàn)和驗(yàn)證優(yōu)選得到。本發(fā)明通過選取代謝過程指標(biāo)性的系列酶，監(jiān)測酶活變化數(shù)據(jù)得出本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。例如：限定CaCO30.1-1g/L是由于CaCO3有利于芽孢的形成，芽孢富含鈣離子，而且大多數(shù)鈣離子與芽孢所特有的化學(xué)成分吡啶二羧酸結(jié)合，因此需要通過測定Ca-吡啶二羧酸的量判斷該培養(yǎng)基的優(yōu)效。
2、在發(fā)酵過程中，從發(fā)酵開始到5～6小時(shí)不控制pH值，在5～6小時(shí)到8小時(shí)之間不加或少量添加氨水控制pH值在6.0-6.5之間，8小時(shí)后開始補(bǔ)加磷酸溶液使pH控制在7.0-7.5之間，至發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)可達(dá)200-400cfu/ml，芽孢形成率90％左右。本發(fā)明采用不用于其他培養(yǎng)基的發(fā)酵控制條件，該培養(yǎng)基在發(fā)酵開始到5～6小時(shí)，該階段是淀粉酶、蛋白酶等大量分解培養(yǎng)基底物轉(zhuǎn)化為速效氮源和碳源的階段，補(bǔ)加氨水會(huì)與分解的底物反應(yīng)和抑制酶活；8小時(shí)以后生長明顯加快pH值很快上升，避免pH值過高需加酸控制。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
對(duì)比例
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕30g/L，葡萄糖5g/L，玉米粉5g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH為7.0，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值控制在6.8-7.2的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)51小時(shí)其發(fā)酵水平為110cfu/ml其中芽孢占比80％。
實(shí)施例1
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH為7.4，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值控制在7.0--7.4的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)54小時(shí)其發(fā)酵水平為240cfu/ml其中芽孢占比88％。
實(shí)施例2
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋 白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH為7.4，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值6-8小時(shí)控制在6.0-6.5之間，其后控制在7.0--7.4發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)58小時(shí)其發(fā)酵水平為430cfu/ml其中芽孢占比90％。
實(shí)施例3
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH為7.4，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值6-8小時(shí)控制在6.0-6.5之間，其后控制在7.0--7.4發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)53小時(shí)其發(fā)酵水平為370cfu/ml其中芽孢占比87％。
實(shí)施例4
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基 pH7.3-7.5，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)16～24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.5g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.2g/L，氯化鈉5g/L，PH為7.4，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值6-8小時(shí)控制在6.0-6.5之間，其后控制在7.0--7.4發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)55小時(shí)其發(fā)酵水平為460cfu/ml其中芽孢占比92％。
實(shí)施例5
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為38℃，培養(yǎng)48h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為38℃，培養(yǎng)24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕25g/L，玉米粉5g/L，酵母粉0.1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂0.1g/L，硫酸亞鐵0.1g/L，碳酸鈣0.1g/L硫酸錳0.1g/L，氯化鈉1g/L，PH為7.0，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在35～38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值6-8小時(shí)控制在6.0-6.5之間，其后控制在7.0--7.4發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)55小時(shí)其發(fā)酵水平為480cfu/ml其中芽孢占比90％。
實(shí)施例6
一種枯草芽孢桿菌的制備方法，包括以下步驟：
(1)斜面培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂20g/L。將枯草芽孢桿菌接種在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36℃，培養(yǎng)24h，直至長出孢子；
(2)斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基上，控制種子培養(yǎng)基pH7.3-7.5，控制溫度為36℃，培養(yǎng)24h，種子培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉10g/L；
(3)將經(jīng)種子培養(yǎng)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆粕35g/L，玉米粉15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，硫酸鎂1g/L，硫酸亞鐵1g/L，碳酸鈣1g/L硫酸錳1g/L，氯化鈉10g/L，PH為7.5，配置成的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入種子液，在38℃、轉(zhuǎn)速為200rpm、pH值6-8小時(shí)控制在6.0-6.5之間，其后控制在7.0-7.4發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)55小時(shí)其發(fā)酵水平為470cfu/ml其中芽孢占比91％。
上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。