本發(fā)明屬于基因載體領(lǐng)域，具體涉及一種含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物及其制備方法以及在制備siRNA載體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因沉默(gene silencing)是指生物體內(nèi)特定基因由于某些因素而無(wú)法表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)是較為普遍的、且備受研究者所關(guān)注的一種基因沉默。PTGS是在RNA分子水平的基因調(diào)控結(jié)果,因而又稱作RNA干擾(RNA interference，RNAi)。RNAi可以理解為由雙鏈RNA(dsRNA)靶向序列特異性調(diào)控基因表達(dá)而導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象，是保守的基因調(diào)節(jié)機(jī)能，在細(xì)胞的發(fā)育、分裂、分化以及疾病等各種生理過(guò)程中扮演重要的轉(zhuǎn)錄后(post-transcriptional)基因調(diào)控角色。通過(guò)遺傳學(xué)與生物化學(xué)的探索研究，在2000年提出了RNAi的作用機(jī)制模型，RNA干涉機(jī)制可以概括為：外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)，在細(xì)胞內(nèi)首先被核酸內(nèi)切酶(Drosha和Dicer等)特異性識(shí)別并降解為小的雙鏈RNA(siRNA，21～23bp)；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，siRNA結(jié)合到argonaute蛋白進(jìn)而負(fù)載到RISC(RNA-Induced Silencing Complex)復(fù)合物中；結(jié)合到RISC上的siRNA經(jīng)過(guò)解旋與解鏈，正義鏈被排除，反義鏈留在RISC里指導(dǎo)結(jié)合與其堿基序列互補(bǔ)的同源于siRNA的mRNA[5]并使之降解，導(dǎo)致特定的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

siRNA與其它類型的藥物的相比有顯著的優(yōu)越性：(1)傳統(tǒng)的小分子藥物一般都針對(duì)特定的蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)小分子庫(kù)并從中篩選出有效抑制劑(inhibitor)。當(dāng)某一蛋白由于缺少結(jié)構(gòu)信息，無(wú)法設(shè)計(jì)小分子抑制劑或無(wú)法制備抗體時(shí)，可以抑制或降解特定基因產(chǎn)物(即mRNA) 從而降低或抑制相關(guān)蛋白的生物合成。如利用反義鏈技術(shù)(antisense technology)制備的單鏈寡聚DNA能夠降解ApoB的mRNA，從而治療家族性高血脂病。而ApoB很難用小分子藥物來(lái)抑制。到目前為止，美國(guó)的Isis Pharmaceutials公司已經(jīng)推出兩個(gè)基于反義鏈技術(shù)的臨床藥物，即Fomivirsen(1998年獲得FDA批準(zhǔn),治療cytomegalovirus retinitis)和Mipomersen(2013年獲批，治療familial hypercholesterolemia)。于本世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)在mRNA的抑制效率、專一性、持續(xù)性等方面均具有優(yōu)越性；然而，由于缺乏安全有效的載體等原因，RNA干擾技術(shù)還沒(méi)有達(dá)到臨床應(yīng)用階段。(2)RNA干擾效率高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。小鼠實(shí)驗(yàn)證明，一次給藥后靶基因的表達(dá)被抑制90％以上，RNA干擾效果能夠持續(xù)6-10天；(3)特異性高，不存在耐藥性問(wèn)題。小分子RNA只有與特定的靶mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)進(jìn)行結(jié)合并引起其降解，副作用以及脫靶效應(yīng)(off-target)極小。長(zhǎng)期給藥后沒(méi)有觀察到任何的耐藥性；(4)RNA干擾技術(shù)適合使用在腫瘤，病毒感染(埃博拉病毒、乙肝病毒感染)引起的疾病等。

國(guó)際上對(duì)RNA干擾的臨床應(yīng)用的研究競(jìng)爭(zhēng)激烈。最近，總部在加拿大的Tekmira Pharmaceuticals研發(fā)的針對(duì)埃博拉病毒的RNA干擾類藥TKM-Ebola已經(jīng)被FDA特批作為“同情使用”(compassionate use)來(lái)緩解目前在非洲等國(guó)蔓延的埃博拉病危機(jī)。美國(guó)Alnylam Pharmaceuticals公司推出ALN系列項(xiàng)目，其中與其合作伙伴Tekmira公司的Lipid Nanoparticle(LNP)技術(shù)結(jié)合的項(xiàng)目ALN-TTR(靶基因：轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白transthyretin)已經(jīng)進(jìn)入臨床II期實(shí)驗(yàn)階段；Arrowhead Research Corporation采用Dynamic Polyconjugate技術(shù)來(lái)輸送siRNA，用于肝臟疾病包括肝癌等。就在2014年年初，位于馬薩諸塞州Cambridge的Sanofi/Genzyme公司對(duì)其鄰居Alnylam Pharmaceuticals公司注入7億美元的股權(quán)投資，而Dicerna Pharmaceuticals公司(研發(fā)DCR-M1711，抑制MYC RNA)的首次公 開募股(IPO)籌資到9千多萬(wàn)美元。

開發(fā)安全高效的siRNA輸送載體是關(guān)鍵任何RNAi療法在臨床應(yīng)用之前，必須進(jìn)行如下幾步關(guān)鍵性的研究：①篩選穩(wěn)定高效的前導(dǎo)siRNA；②制備安全高效的siRNA靶向遞送體系；③全面嚴(yán)格的安全性(包括潛在的脫靶副作用)篩查。siRNA是帶負(fù)電荷、對(duì)核酸降解酶敏感、親水性強(qiáng)的一類較小核酸分子，這些特有的物理化學(xué)性質(zhì)，使得siRNA很難作為藥物活性成分，同時(shí)對(duì)siRNA安全有效的載體遞送也極具挑戰(zhàn)性。由于siRNAs是進(jìn)入細(xì)胞后才能對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此高效地將siRNAs轉(zhuǎn)入細(xì)胞、組織和器官，是成功抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一。

對(duì)于siRNA遞送，按載體不同可以分為三個(gè)探究方向。(1)以病毒(viral vector)為載體遞送siRNA的研究，與之相關(guān)的最初報(bào)道是將siRNA序列克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒，使病毒在其所侵染的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)此siRNA序列，從而顯著下調(diào)宿主NDR和p75等基因的表達(dá)。此后，腺病毒和慢病毒等用于siRNA的載體傳送的報(bào)道也相繼出現(xiàn)。病毒載體遞送siRNA的優(yōu)勢(shì)在于能夠保持siRNA序列的穩(wěn)定性和傳遞的高效性，但是病毒載體內(nèi)容易引起機(jī)體的免疫原性，還存在著引起插入型基因突變和癌變等潛在隱患。所以，病毒在siRNA傳送領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用研究極大地受到了限制，這使得以非病毒作為siRNA傳送載體的研究成為必然。(2)非病毒(non-viral vector)載體傳送法，2003年報(bào)道了小鼠體內(nèi)非病毒載體傳送siRNA。時(shí)至今日，已經(jīng)先后嘗試了以脂質(zhì)體，多肽及蛋白質(zhì)，合成的或天然的陽(yáng)離子型高分子等非病毒作為載體，對(duì)siRNA的傳送進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，與病毒傳遞方法相比較，使用非病毒傳送siRNA可以避免免疫刺激和癌變等副作用。非病毒siRNA載體以納米材料(Nanoparticle)為主。納米微球之所以被應(yīng)用于傳遞siRNA，是因?yàn)橐延械难芯勘砻骷{米尺寸的載體，具有獨(dú)特的生物功能：①納米微球組織靶向性和穿透力強(qiáng)，能夠提高 傳送效率，降低免疫刺激和毒副作用；②納米微球能夠有效避開腎臟的過(guò)濾，延長(zhǎng)其在血液中循環(huán)的時(shí)間；③納米微球具有較強(qiáng)的保護(hù)性，能夠有效保護(hù)siRNA避開RNase等的攻擊，延長(zhǎng)其半衰期，提高生物活性及生物利用率。因此，納米材料在siRNA傳送上的應(yīng)用研究日益受到關(guān)注。這些納米微球技術(shù)的開發(fā)，為siRNA的高效傳送及進(jìn)一步在臨床上的應(yīng)用提供了有價(jià)值的研究基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)，其中有的研究成果已進(jìn)入臨床前評(píng)價(jià)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞毒性低、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高、siRNA傳遞效率高的非病毒脂質(zhì)類納米材料載體，其為一種含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物。

本發(fā)明的另一目的是提供所述載體的制備方法與應(yīng)用。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的的具體技術(shù)方案為：

一種含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如通式(I)所示：

式中n為1或2，m為3或4；X為NH、O或S；R₁選自以下基團(tuán)：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃。

優(yōu)選地，所述二肽為L(zhǎng)型或D型堿性氨基酸和酸性氨基酸。

更優(yōu)選地，本發(fā)明的含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物為：

更優(yōu)選地，本發(fā)明的含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物為：

更優(yōu)選地，本發(fā)明的含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物為：

更優(yōu)選地，本發(fā)明的含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物為：

本發(fā)明提供了上述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子化合物的制備方法，包括以下步驟：

上述R1選自：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃；

n為1或2；m為3或4；X為NH、O、S。

具體地，本發(fā)明化合物的制備方法為：

(1)Boc-D-酸性氨基酸-OH或Boc-L-酸性氨基酸-OH與飽和/不飽和脂肪烴胺或醇溶于溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下冷卻至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢?h-24h后，將反應(yīng)混合物溶解在溶劑中，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌，干燥后純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中于0度-室溫?cái)嚢?0min-60min；

(2)將步驟(1)中的終產(chǎn)物、Boc-L-堿性氨基酸-OSu或Boc-D-堿性氨基酸-Osu、三乙胺溶于溶劑中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)8h-24h后加入二氯甲烷，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌，干燥后純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中在0度-室溫?cái)嚢?0min-60min即得。

上述R1選自以下任一基團(tuán)：

-CH₂CH₂CH₂CH₂(CH₂CH＝CH)₃(CH₂)₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、-CH₂(CH₂)₁₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₆CH₂CH＝CHCH₂(CH₂)₆CH₃、

-CH₂(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、-CH₂(CH₂)₁₄CH₃、

-CH₂(CH₂)₁₂CH₃、-CH₂(CH₂)₁₂CH₃；

n為1或2；m為3或4；X為NH、O、S。

本發(fā)明的制備方法中，步驟(1)Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH可以選自Boc-D-谷氨酸-OH、Boc-D-天冬氨酸-OH、Boc-L-谷氨酸-OH或Boc-L-天冬氨酸-OH；步驟(2)中Boc-L(或D)-堿性氨基酸-OSu中的堿性氨基酸選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸。并且，步驟(1)Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH和步驟(2)中Boc-L(或D)-堿性氨基酸-Osu的鏡像相同，即同為D型或同為L(zhǎng)型。

本發(fā)明的制備方法中，步驟(1)和步驟(2)所述的溶劑為本領(lǐng)域已知的能夠溶解所選化合物的溶劑，如二氯甲烷。

本發(fā)明化合物的制備方法中，步驟(1)中Boc-D(或L)-酸性氨基酸-OH與油胺的摩爾比為1:2；步驟(2)中步驟(1)的終產(chǎn)物與Boc-L(或D)-堿性氨基酸-OSu和三乙胺的摩爾比為1:1:1。

本發(fā)明化合物的制備方法中，步驟(1)和步驟(2)中所述的干燥均采用無(wú)水硫酸鈉干燥，并采用硅膠柱層析方法純化目的物，步驟(1)中硅膠柱層析方法的洗脫液為二氯甲烷和甲醇，二者的體積比為20:1；步驟(2)中硅膠柱層析方法的洗脫液為乙酸乙酯和正己烷，二者的體積比為4:1。步驟(1)和步驟(2)中所述的三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為1:1。

本發(fā)明提供了上述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物在制備基因載體中的應(yīng)用。

具體地，是將本發(fā)明的化合物與膽固醇、DSPE-PEG按60％、39％、1％的摩爾比溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去溶劑后真空干燥過(guò)夜。加入278mM的蔗糖溶液，超聲波處理5分鐘-30分鐘后，用Avanti Mini-Extruder脂質(zhì)體擠出器(膜孔徑為50納米-100納米)制備得到載體，采用激光粒度分析，得到直徑約100-150nm的脂質(zhì)體，在4℃冰箱內(nèi)保存。

將本發(fā)明的化合物制備脂質(zhì)體載體，該載體粒徑均勻，分散性良好，與siRNA結(jié)合能力強(qiáng)，具有高效的體外、體內(nèi)siRNA傳送效率。

本發(fā)明提供了上述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

含有本發(fā)明所述的化合物的核酸載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。

本發(fā)明提供了含有上述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物的核酸載體在遞送siRNA中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了含有上述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物的核酸 載體制備基因治療藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述核酸載體優(yōu)選為siRNA載體。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述含有二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的組合物具有(1)能夠在體內(nèi)有效傳送未做任何化學(xué)修飾或保護(hù)的siRNA序列，效率高達(dá)90％，解決了野生型siRNA序列難以在體內(nèi)有效傳送的難題；(2)此二肽類脂質(zhì)陽(yáng)離子的化合物完全由天然氨基酸組成，細(xì)胞和體內(nèi)毒性低，生物相容性高，適合多次給藥；(3)器官靶向性高，所傳送的siRNA主要分布在小鼠的肝臟、肺和胰臟內(nèi)等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為脂質(zhì)分子與siRNA結(jié)合后的凝膠電泳圖。脂質(zhì)分子I、脂質(zhì)分子II、脂質(zhì)分子III和脂質(zhì)分子IV制得的脂質(zhì)體分別與siRNA以不同的氨基：磷酸基團(tuán)(N/P)的比例混合，在室溫培育30分鐘后用1％的瓊脂凝膠電泳分析。圖中0、1、2、3分別代表脂質(zhì)體上的氨基數(shù)(N)與siRNA分子上的磷酸基數(shù)(P)的摩爾比例。

圖2為激光粒度分析由脂質(zhì)分子I形成的脂質(zhì)體的粒度分布結(jié)果。

圖3為細(xì)胞存活率分析結(jié)果。HeLa細(xì)胞用脂質(zhì)分子I、脂質(zhì)分子II、脂質(zhì)分子III、脂質(zhì)分子IV制得的脂質(zhì)體處理24小時(shí)，采用MTT方法分析結(jié)果顯示，脂質(zhì)分子I、II、III、IV制得的脂質(zhì)體為明顯低的細(xì)胞毒性。

圖4為體外siRNA轉(zhuǎn)染效果。用脂質(zhì)分子I、脂質(zhì)分子II、脂質(zhì)分子III、脂質(zhì)分子IV形成的脂質(zhì)體分別與磷酸甘油醛脫氫酶siRNA結(jié)合并將其帶入HeLa細(xì)胞，引起90％的信使RNA的降解。

圖5為體內(nèi)siRNA輸送效果圖。由脂質(zhì)分子I、脂質(zhì)分子II、脂質(zhì)分子III、脂質(zhì)分子IV形成的脂質(zhì)體與載脂蛋白B siRNA結(jié)合，經(jīng)尾靜脈注射給小鼠，24小時(shí)后提取肝臟細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR方法測(cè)定肝內(nèi)載脂蛋白B mRNA的含量的結(jié)果顯示，80％到90％的載脂蛋白B mRNA被降解。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

除非另有說(shuō)明，上下文中百分比為重量百分比，所有的溫度以攝氏度給出。

實(shí)施例1脂質(zhì)分子I的合成

第一步：將試劑Boc-L-谷氨酸-OH(1.0g,4.1mmol),油胺(2.6mL,8.1mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰浴冷卻至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(1.7g,8.9mmol)，在25℃攪拌24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝15/1，v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物2.13g產(chǎn)物，產(chǎn)率82％。

第二步：將第一步中得到的產(chǎn)物(0.500g，0.774mmol)、Boc-L-鳥氨酸(Boc)-OSu(0.332g，0.774mmol)、三乙胺(0.108ml，0.774mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝10/1，v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的 混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物0.488g產(chǎn)物，產(chǎn)率83％。

產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.838-0.852(t,6H,-CH₃),1.232-1.371(m,48H,-CH₂-),1.581-1.594(m,2H,NH₂-CH₂-CH₂-),1.692-1.719(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.786-2.062(m,4H,-NHCOCH₂-,-NHCOCH₂CH₂-),2.076-2.183(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.797(t,2H,NH₂-CH₂-),2.994-3.133(m,4H,NHCOCH₂-),3.849(m,1H,-NHCOC(NH₂)H-),4.202-4.257(m,1H,OCCH(NH-)CH₂-),5.319-5.350(m,4H,-CH＝CH-),7.795-8.596(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 760.23(M)⁺。表征數(shù)據(jù)顯示結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例2脂質(zhì)分子II的合成

第一步：將試劑Boc-D-谷氨酸-OH(1.0g,4.05mmol),油胺(2.16mL,8.09mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰浴冷卻至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(1.71g，8.91mmol)，在25℃攪拌24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝20/1，v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物1.92g產(chǎn)物，產(chǎn)率74％。第二步：將第一步中達(dá)到的產(chǎn)物(1.22g，1.890mmol)、Boc-D-鳥氨酸(Boc)-OSu(0.812g，1.890mmol)、三乙胺(0.26ml，1.890mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉 干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：乙酸乙酯/正己烷＝4/1v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物0.82g產(chǎn)物，產(chǎn)率57％。

產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)：¹H NMR(DMSO-d6,ppm):0.838-0.852(t,6H,-CH₃),1.232-1.371(m,48H,-CH₂-),1.581-1.594(m,2H,NH₂-CH₂-CH₂-),1.692-1.719(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.786-2.062(m,4H,-NHCOCH₂-,-NHCOCH₂CH₂-),2.076-2.183(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.797(t,2H,NH₂-CH₂-),2.994-3.133(m,4H,NHCOCH₂-),3.849(m,1H,-NHCOC(NH₂)H-),4.202-4.257(m,1H,OCCH(NH-)CH₂-),5.319-5.350(m,4H,-CH＝CH-),7.795-8.596(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 760.23(M)⁺。表征數(shù)據(jù)顯示結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例3脂質(zhì)分子III

第一步：將試劑Boc-L-天冬氨酸-OH(1.0g,4.1mmol),油胺(2.6mL,8.1mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰浴冷卻至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(1.7g,8.9mmol)，在25℃攪拌24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝15/1v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物2.13g產(chǎn)物，產(chǎn)率82％。

第二步：將第一步中達(dá)到的產(chǎn)物(1.9g，2.986mmol)、Boc-L-鳥氨酸(Boc)-OSu(1.283g，2.968mmol)、三乙胺(0.416ml，2.986mmol) 溶解在二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝10/1v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物2.37g產(chǎn)物，產(chǎn)率84％。

產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)：¹HNMR(DMSO-d6,ppm):0.876-0.890(t,6H,-CH₃),1.355(m,44H,-CH₂-),1.597-1.627(m,6H,NH₂CH₂CH₂-,-CONHCH₂CH₂-),1.693-1.740(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.938-1.994(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.425-2.474(m,4H,NH₂-CH₂,-NHCOCH₂-),2.790-2.802(m,2H,-CH₂CONHCH₂-),2.899-2.956(m,2H,-CH(NH)CONHCH₂-),3.068(m,1H,-NHCOCH(NH₂)-),4.572-4.586(m,1H,-NHCOCH(NH)-),5.311-5.359(m,4H,-CH＝CH-),7.861-8.622(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 746.83(M)⁺。表征數(shù)據(jù)顯示結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例4脂質(zhì)分子IV

第一步：將試劑Boc-D-天冬氨酸-OH(1.0g,4.3mmol),油胺(2.3mL,8.58mmol)溶解在10ml二氯甲烷，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰浴冷卻至0℃后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(1.8g,9.44mmol)，在25℃攪拌24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溶解在二氯甲烷中，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：二氯甲烷/甲醇＝20/1，v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物1.91g產(chǎn)物， 產(chǎn)率71％。

第二步：將第一步中達(dá)到的產(chǎn)物(1.91g，3.02mmol)、Boc-D-鳥氨酸(Boc)-OSu(1.298g，3.02mmol)、三乙胺(0.421ml，3.02mmol)溶解在二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24h后加入200ml二氯甲烷，依次用5％檸檬酸溶液、水、飽和鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥后用硅膠柱層析方法(洗脫液：乙酸乙酯/正己烷＝4/1，v/v)純化目的物，將收集物溶解在三氟乙酸和二氯甲烷(1：1)的混合液中在室溫?cái)嚢?0分鐘，得到目的物1.89g產(chǎn)物，產(chǎn)率84％。

產(chǎn)物的表征數(shù)據(jù)：¹HNMR(DMSO-d6,ppm):0.876-0.890(t,6H,-CH₃),1.355(m,44H,-CH₂-),1.597-1.627(m,6H,NH₂CH₂CH₂-,-CONHCH₂CH₂-),1.693-1.740(m,2H,NH₂-C(CO)H-CH₂-),1.938-1.994(m,8H,-CH₂CH＝CHCH₂-),2.425-2.474(m,4H,NH₂-CH₂,-NHCOCH₂-),2.790-2.802(m,2H,-CH₂CONHCH₂-),2.899-2.956(m,2H,-CH(NH)CONHCH₂-),3.068(m,1H,-NHCOCH(NH₂)-),4.572-4.586(m,1H,-NHCOCH(NH)-),5.311-5.359(m,4H,-CH＝CH-),7.861-8.622(m,7H,-CONH-,-NH₂).MS(ESI)m/z 746.83(M)⁺。表征數(shù)據(jù)顯示結(jié)構(gòu)正確。

實(shí)施例5脂質(zhì)體的制備

將上述實(shí)施例制得的脂質(zhì)分子I，或II，或III，或IV與膽固醇、DSPE-PEG按60％、39％、1％的摩爾比例溶解在氯仿中混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移去溶劑后真空干燥過(guò)夜。加入278mM的蔗糖溶液，超聲波處理5分鐘后，用Avanti Mini-Extruder脂質(zhì)體擠出器制備得到載體，采用激光粒度分析，得到直徑約100nm-150nm的脂質(zhì)體(見圖2)，在4℃冰箱內(nèi)保存。脂質(zhì)分子II，III，IV制得的脂質(zhì)體激光粒度分析結(jié)果顯示，直徑均為100nm-150nm的脂質(zhì)體。

實(shí)施例6脂質(zhì)體的載體siRNA輸送效果驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57/BL6小鼠，雄性，6周齡，體重約20g；

所采用的陽(yáng)性載脂蛋白siRNA(pm siRNA)的堿基序列為：反義鏈序列:5’-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3’，有義鏈序列為：5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’；陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA)序列為：反義鏈：5’-AUUCGUAUUGAGUCUGAUCACAC-3’；有義鏈：5’-GUGAUCAGACUCAAUACGAAU-3’

分組及處理方法(mm，mismatch，即序列不匹配的陰性對(duì)照siRNA；pm,perfect match，序列完全匹配的陽(yáng)性siRNA)：

陰性對(duì)照組1：6只小鼠，尾靜脈注射5％的蔗糖溶液；

陰性對(duì)照組2：6只小鼠，尾靜脈注射由脂質(zhì)分子I制備的脂質(zhì)體+陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子II制備的脂質(zhì)體+陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子III制備的脂質(zhì)體+陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子IV制備的脂質(zhì)體+陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA)

實(shí)驗(yàn)組：6只小鼠，尾靜脈注射由脂質(zhì)分子I制備的脂質(zhì)體+陽(yáng)性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子II制備的脂質(zhì)體+陽(yáng)性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子III制備的脂質(zhì)體+陽(yáng)性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)、尾靜脈注射由脂質(zhì)分子IV制備的脂質(zhì)體+陽(yáng)性siRNA(pm siRNA，在5％的蔗糖溶液)；根據(jù)動(dòng)物體重，以2.0-5.0mg siRNA/kg體重的劑量，尾靜脈注射，24小時(shí)后，取肝臟，提取總RNA，采用熒光定量PCR方法，檢測(cè)RNA干擾的效率。所使用的引物序列如下：小鼠載脂蛋白apoB引物對(duì):5’-ttccagccatgggcaactttacct-3’；5’-tactgcagggcgtcagtgacaaat-3’.內(nèi)參引物對(duì)(小鼠肌動(dòng)蛋白b)：5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’；5’-accagaggcatacagggaca-3’。

對(duì)實(shí)施例5制備得到的、基于脂質(zhì)分子I、脂質(zhì)分子II、脂質(zhì)分子III、脂質(zhì)分子IV的脂質(zhì)體siRNA傳送載體，對(duì)其進(jìn)行下述幾個(gè)方 面的檢測(cè)：

(1)利用激光粒度儀檢測(cè)載體的大小、粒徑分布情況，圖2顯示結(jié)果，由實(shí)施例5所得脂質(zhì)體載體粒徑在100nm到150nm之間，大小均一，分散性良好。

(2)采用凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脂質(zhì)體siRNA載體與siRNA的結(jié)合能力，結(jié)果顯示，當(dāng)N/P比例大于或等于1時(shí)，載體能夠有效的阻滯質(zhì)粒的電泳，包裹能力強(qiáng)。

(3)細(xì)胞存活率檢測(cè)：

轉(zhuǎn)染前一天，按每孔1.0×10⁴細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，在5％CO₂、溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)到70％左右；更換含有10％小牛血清的新鮮培養(yǎng)液(100μl/孔)；分別取脂質(zhì)體(由實(shí)施例5所得)0.2～5.0μl，加入到細(xì)胞上面，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，采用MTT方法，測(cè)定細(xì)胞存活率，其計(jì)算公式為：[細(xì)胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100，其中，Asample是被處理細(xì)胞孔的吸收，Acontrol是沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞孔的吸收，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，由實(shí)施例5制備所得脂質(zhì)體處理的細(xì)胞，其細(xì)胞存活率達(dá)到95％以上，說(shuō)明本發(fā)明制備的脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性極低，適合作為核酸載體使用。

結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的、基于脂質(zhì)分子I～I(xiàn)V制備得到的脂質(zhì)體siRNA載體具有很低的細(xì)胞毒性。

(4)體外(細(xì)胞)siRNA輸送效率的測(cè)定：

HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)：在含有10％的胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)染前一天，按每孔2.5×10⁵細(xì)胞密度接種于12孔培養(yǎng)板，在5％CO₂、溫度為37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞密度達(dá)到70％左右；更換含有10％小牛血清的新鮮培養(yǎng)液(1.0ml/孔)；將磷酸甘油醛脫氫酶siRNA(siGAPDH，美國(guó)Dharmacon公司的siGenome Human GAPDH siRNA，在500μl Opti-MEM培養(yǎng)液中加siRNA溶液，最終濃度為100nM)和由實(shí)施例5所得脂質(zhì)體(在500μl Opti-MEM培養(yǎng)液中加5～7μl脂質(zhì)體)，以1：1體積比混合兩種溶液，得到1000ul混合液，在室溫放置30分鐘后，加入到細(xì)胞上面，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；

效果測(cè)定：提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，采用熒光定量PCR方法測(cè)定GAPDH mRNA的含量，結(jié)果見圖4。圖4顯示，由實(shí)施例5制備的脂質(zhì)體，高效的將siRNA傳送到細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)的RNA干擾活動(dòng)，并干擾了細(xì)胞內(nèi)源性基因的表達(dá)，效率達(dá)到95％以上。

(5)動(dòng)物體內(nèi)siRNA輸送：

將由實(shí)施例5制備的脂質(zhì)體與siRNA(靶標(biāo)為肝臟內(nèi)apoB基因)混合，方法是：

取7.14ul載脂蛋白siRNA(siApoB，劑量為5mg/kg)母液(14mg/ml)，加入到0.2ml經(jīng)過(guò)滅菌的蔗糖溶液(278mM)，混勻；取0.2ml脂質(zhì)體母液(4.6mg/ml)，加入到0.2ml siRNA溶液里，混勻，室溫放置30分鐘后，經(jīng)尾靜脈注射C57/BL6小鼠，24小時(shí)候提取肝臟內(nèi)總RNA，采用熒光定量PCR法測(cè)定apoB mRNA的表達(dá)量。

所采用的陽(yáng)性載脂蛋白siRNA(pm siRNA)的堿基序列為：反義鏈序列:5’-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC-3’，有義鏈序列為：5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’；陰性對(duì)照siRNA(mm siRNA)序列為：反義鏈：5’-AUUCGUAUUGAGUCUGAUCACAC-3’；有義鏈：5’-GUGAUCAGACUCAAUACGAAU-3’。所使用的引物序列如下：小鼠載脂蛋白apoB引物對(duì):5’-ttccagccatgggcaactttacct-3’；5’-tactgcagggcgtcagtgacaaat-3’.內(nèi)參引物對(duì)：小鼠肌動(dòng)蛋白b引物對(duì),5’-ctaaggccaaccgtgaaaag-3’,；5’-accagaggcatacagggaca-3’。

結(jié)果單次注射后apoB mRNA下降了70-90％。單次尾靜脈注射劑量4mg/kg體重，由D-型氨基酸組成的脂質(zhì)分子，其基因干擾效率最 高達(dá)到90％，可見本發(fā)明的基因載體具有高效載體siRNA傳送效率(見圖5)。

以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。