本發(fā)明涉及一種適合CHO-S細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基及其配制方法與應(yīng)用，屬于CHO-S細(xì)胞株開發(fā)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗體的靶向特異性及高表達(dá)量在臨床中具有重要意義，因此如何比競爭對(duì)手更快一步尋找到能夠穩(wěn)定并大量分泌正確抗體的細(xì)胞系就顯得尤為重要。對(duì)此，傳統(tǒng)的細(xì)胞篩選采用有限稀釋法或細(xì)胞分選法，工作量大耗時(shí)長，通常篩選1000個(gè)細(xì)胞需要8周，而最終才能獲得一個(gè)好的克隆；且在挑克隆的時(shí)候容易對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械傷害，導(dǎo)致克隆的成活率下降。現(xiàn)在企業(yè)常使用半固體培基法進(jìn)行單克隆篩選。細(xì)胞生長在半固體培養(yǎng)基中，形成單克隆細(xì)胞團(tuán)，同時(shí)將抗體分泌在細(xì)胞團(tuán)周圍，半固體培養(yǎng)基中含有熒光標(biāo)記的二抗，能與抗體Fc片段特異性結(jié)合，當(dāng)用一定波長的光進(jìn)行激發(fā)時(shí)就能發(fā)出熒光。使用圖像分析軟件能夠?qū)慰寺〖?xì)胞團(tuán)的大小、熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，從而篩選出生長旺盛、表達(dá)量高的單克隆細(xì)胞團(tuán)。Molecular Device公司開發(fā)的Clone Pix system篩選方法(參考《CHO細(xì)胞株開發(fā)技術(shù)策略探討》)有效地避免了人工篩選細(xì)胞的弊端，可在短時(shí)間內(nèi)挑選大量克隆，基于熒光檢測技術(shù)但無需表達(dá)載體自身產(chǎn)生熒光，從而有效地避免了假陽性；細(xì)胞處于半固體培養(yǎng)基中，挑選過程柔和，增加了細(xì)胞的存活率，因此效率大大提高。

在CHO細(xì)胞克隆篩選中，以Clone Pix system篩選方法為例，適合CHO細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基是其中最關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Molicular Devices公司開發(fā)了適合各種細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基，其中適合CHO-S細(xì)胞的半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G(Cat：K8740)價(jià)格非常昂貴，90mL售價(jià)4251元，貨期長，物流成本高，且少有此款產(chǎn)品的替代品，因此有關(guān)CHO-S細(xì)胞開發(fā)的研發(fā)成本非常高。除了固定成分外，半固體培養(yǎng)基的配制方法也對(duì)細(xì)胞生長起重要作用。而CloneMedia-CHO-G半固體培養(yǎng)基的配方和配制方法均為Molicular Devices的商業(yè)秘密，不為公眾所知。

因此，有必要開發(fā)新的適合CHO-S細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基及其制備方法，以 降低科研成本，增大實(shí)驗(yàn)材料的選擇自由度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，該半固體培養(yǎng)基適合于CHO-S細(xì)胞生長，可用于細(xì)胞克隆篩選階段，能有效替代Molicular Devices公司開發(fā)的適合CHO-S細(xì)胞的CloneMedia-CHO-G半固體培養(yǎng)基。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種配制適合CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基的方法。

為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一方面，本發(fā)明提供一種CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按重量百分比計(jì)，所述半固體培養(yǎng)基包含如下組分：2.46％～2.48％CD FortiCHO培養(yǎng)基，2％～3％甲基纖維素。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基由2×CDFortiCHO和2×甲基纖維素溶液按照體積比1:1充分混勻后離心除去肉眼不可見顆粒，收集上層離心液得到。

優(yōu)選地，上述CD FortiCHO培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II，這些固體培養(yǎng)基可由gibco公司商購獲得。

優(yōu)選地，按質(zhì)量體積比計(jì)算，所述甲基纖維素在20℃下、2％時(shí)的黏度為25cps～1500cps。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述甲基纖維素的平均分子量為17000～63000。

優(yōu)選地，所述甲基纖維素的含量為2.7％～3.0％。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種配制所述CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基的方法，該方法包括：

a、將體積比為1:1的2×CD FortiCHO培養(yǎng)基和2×甲基纖維素溶液充分混勻；

b、離心除去肉眼不可見顆粒物質(zhì)，收集上層離心液，即得CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基；其中，優(yōu)選地，所述離心條件為4000rpm～10000rpm，離心30min以上。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，所述2×CD FortiCHO培養(yǎng)基是按照以下方法制得的：稱量CD FortiCHO培養(yǎng)基，加入超純水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?.20μM濾膜過濾除菌得到2×CD FortiCHO培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中，所述2×甲基纖維素溶液是按照以下方法制得的：稱量甲基纖維素，加入超純水，充分?jǐn)嚢枞芙?，高壓滅菌得?×甲基纖 維素溶液。高壓滅菌條件可為常規(guī)培養(yǎng)基滅菌條件，例如可為121℃左右高壓滅菌30min。

半固體培養(yǎng)基的配制方法通常通過肉眼觀察培養(yǎng)基澄清透亮且無固體顆粒物即判斷為攪拌均勻、各組分充分溶解。一般通過延長攪拌時(shí)間或加大攪拌力度或通過煮沸等方式保證半固體培養(yǎng)基各組分充分溶解。但通過上述本領(lǐng)域常規(guī)方法配制的半固體培養(yǎng)基在實(shí)際應(yīng)用中效果并非最佳，應(yīng)用效果低于商品化半固體培養(yǎng)基。而在教科書的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常認(rèn)為半固體培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢枞芙?，肉眼觀察澄清即可，更不會(huì)進(jìn)一步探究其微觀形態(tài)對(duì)應(yīng)用效果的影響，也未就此檢索到相關(guān)的科技文獻(xiàn)或?qū)＠墨I(xiàn)報(bào)道。

本案發(fā)明人偶然將上述半固體培養(yǎng)基置于光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，肉眼觀察無固體顆粒的半固體培養(yǎng)基中仍存在大量細(xì)小難溶的固體顆粒物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，離心可除去這些固體顆粒物，并將離心后的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基用于CHO-S細(xì)胞培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明：離心處理的半固體培養(yǎng)基與未做離心處理的半固體培養(yǎng)基相比，CHO-S細(xì)胞生長大，蛋白表達(dá)量高，生長狀態(tài)相對(duì)較好，有益于后續(xù)細(xì)胞篩選工作。離心處理后的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞，獲得了預(yù)料不到的技術(shù)效果，超出了本領(lǐng)域技術(shù)人員的預(yù)期。

所述離心條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)為在光學(xué)顯微鏡下觀察所述半固體培養(yǎng)基無細(xì)小固體顆粒物(即，在光學(xué)顯微鏡下觀察無可見的固體顆粒物)。優(yōu)選地，本發(fā)明推薦離心條件為4000rpm～10000rpm，離心30min以上。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件、離心機(jī)轉(zhuǎn)子大小選擇更具體的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。優(yōu)選地，離心操作最好是在低溫下進(jìn)行，比如4℃低溫離心。特別是含有CD FortiCHO培養(yǎng)基的離心操作盡量4℃低溫操作。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞中的應(yīng)用。具體應(yīng)用時(shí)，培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)條件為：5％CO₂，36.5℃。優(yōu)選地，是靜止培養(yǎng)箱培養(yǎng)或120rpm搖瓶培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞，CHO-S細(xì)胞生長大，蛋白表達(dá)量高，生長狀態(tài)相對(duì)較好，有益于后續(xù)細(xì)胞篩選工作。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基適合CHO-S細(xì)胞生長，能夠用于細(xì)胞克 隆篩選階段，為科研工作者或企業(yè)提供更多選擇；可用于替代Molicular Devices公司的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G，進(jìn)而降低進(jìn)口產(chǎn)品過長的供貨期對(duì)科研工作的影響，降低企業(yè)對(duì)該產(chǎn)品的依賴性；90mL CloneMedia-CHO-G的售價(jià)為4251元人民幣，而配制相同體積的本發(fā)明所述半固體培養(yǎng)基的成本約為130元人民幣，因此，采用本發(fā)明所述的半固體培養(yǎng)基替代Molicular Devices公司的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G可大幅降低研發(fā)生產(chǎn)成本；通過本發(fā)明提供的配制CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基的方法配制的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞生長大，蛋白表達(dá)量高，生長狀態(tài)好，取得了預(yù)料不到的效果，超出了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的預(yù)期；本發(fā)明提供的配制方法操作簡單，可行性強(qiáng)，結(jié)合大容量離心機(jī)，可批量配制半固體培養(yǎng)基以滿足研發(fā)生產(chǎn)需求。

附圖說明

圖1為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基未離心50倍放大圖，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖2為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基離心50倍放大圖，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖3為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基未離心50倍放大圖，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例2。

圖4為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基離心50倍放大圖，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例2。

圖5為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(未離心)克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖6為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(未離心)克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖7為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖8為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1。

圖9為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例2。

圖10為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50 倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例2。

圖11為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例4。

圖12為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例4。

圖13為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例6。

圖14為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心)克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50倍放大，培養(yǎng)基配方見實(shí)施例6。

圖15為商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生長狀態(tài)白光圖，50倍放大。

圖16為商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G克隆第六天生長狀態(tài)熒光圖，50倍放大。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案及其特點(diǎn)和應(yīng)用中所具有的技術(shù)效果，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。

實(shí)施例1、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

材料：

CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A14286EF；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纖維素。

實(shí)施例2、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A14286EF；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。

實(shí)施例3、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A14286EF；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2.7％甲基纖維素。

實(shí)施例4、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO II粉末，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A24363SA；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纖維素。

實(shí)施例5、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO II粉末，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A24363SA；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.48％CD FortiCHO II，2.7％甲基纖維素。

實(shí)施例6、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO II粉末，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A24363SA；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0262-500G，平均分子量41000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為400cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.48％CD FortiCHO II，3％甲基纖維素。

實(shí)施例7、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A14286EF；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為25cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。

實(shí)施例8、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO AGT Medium Prototype，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A14286EF；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為1500cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.46％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，2％甲基纖維素。

實(shí)施例9、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO II粉末，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A24363SA；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M6385-500G，平均分子量17000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為25cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.48％CD FortiCHO AGT Medium Prototype，3％甲基纖維素。

實(shí)施例10、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基配方

CD FortiCHO II粉末，供應(yīng)商Gibco，貨號(hào)A24363SA；

甲基纖維素，供應(yīng)商Sigma，貨號(hào)M0387-500G，平均分子量63000，在20℃下，2％的該甲基纖維素黏度為1500cPs。

按照重量百分比計(jì)：2.48％CD FortiCHO II，2％甲基纖維素。

實(shí)施例11、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基的配制方法

CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基按照如下步驟配制：

(1)2×CD FortiCHO培養(yǎng)基準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱量CD FortiCHO AGT Medium Prototype或CD FortiCHO II固體培養(yǎng)基，加入超純水，400rpm磁力攪拌器攪拌30min使充分溶解，然后用0.20μM濾膜(sartolab-P20plus，cat：18056)過濾除菌得到2×CDFortiCHO培養(yǎng)基，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)2×甲基纖維素溶液準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱量甲基纖維素加入純化水，400rpm磁力攪拌器皿充分?jǐn)嚢?0min使溶解，121.3℃高壓滅菌20分鐘，待降為室溫后，放入4℃冰箱保存30分鐘以上備用。

(3)在生物安全柜中將已經(jīng)配制好的2×CD FortiCHO培養(yǎng)基和2×甲基纖維素溶液按照1:1的體積比混合，4℃600rpm磁力攪拌器攪拌過夜。

(4)將步驟(3)所得半固體培養(yǎng)基分裝在50mL無菌離心管內(nèi)，4000rpm離心30min至上清液在顯微鏡下50倍放大觀察無細(xì)小難溶固體顆粒物，丟棄離心管最底層固體培養(yǎng)基(約5mL)，收集上層半固體培養(yǎng)基，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例12、CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心與未離心)與商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞生長狀態(tài)比對(duì)

試驗(yàn)材料：

(1)實(shí)施例1 CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按照實(shí)施例11所述步驟1-4配制，得到離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基。

(2)實(shí)施例1 CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按照實(shí)施例11所述步驟1-3配制，得到未離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基。

(3)實(shí)施例2 CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按照實(shí)施例11所述步驟1-4配制，得到離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基。

(4)實(shí)施例4 CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按照實(shí)施例11所述步驟1-4配制，得到離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基。

(5)實(shí)施例6 CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基，按照實(shí)施例11所述步驟1-4配制，得到離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基。

(6)商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G，Molicular Devices，Cat：K8740。

(7)CHO-S宿主細(xì)胞，上海津曼特生物科技有限公司，表達(dá)IgG。

試驗(yàn)方法：

將本發(fā)明提供的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(離心與未離心)與Molicular Devices商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基用CHO-S宿主細(xì)胞進(jìn)行鋪板，比較二者的細(xì)胞生長和IgG蛋白表達(dá)量。

配制的半固體培養(yǎng)基和商業(yè)培養(yǎng)基從-20℃冰箱分別取出，放在4℃冰箱過夜，溶解完全。如果鋪一塊6-well plate，細(xì)胞房超凈工作臺(tái)里，在50ml無菌離心管中，加入15ml半固體培養(yǎng)基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接著加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，然后將其充分混合，再加入3000～12000個(gè)細(xì)胞(也就是500～2000個(gè)細(xì)胞每個(gè)孔)，再次混合均勻，取2ml混合物到每個(gè)孔中(避免汽包產(chǎn)生，并且平鋪)。最后放入恒溫培養(yǎng)箱(36.5℃，5％CO₂)培養(yǎng)6天。

試驗(yàn)結(jié)果：見圖1-圖16。

圖1與圖2、圖3與圖4為自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基離心與未離心液體50 倍放大圖。結(jié)果顯示，未離心CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)中仍存有大量細(xì)小難溶固體顆粒物，顆粒物實(shí)際粒徑約10-50μm。

從未離心與離心的CHO-S細(xì)胞自配半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞生長狀態(tài)來看(見圖5～圖14)，未離心的CHO-S細(xì)胞自配半固體培養(yǎng)基背景雜質(zhì)多(圖5、圖6)，細(xì)胞生長相對(duì)較小，IgG蛋白表達(dá)量低，生長狀態(tài)相對(duì)較差；而離心的CHO-S細(xì)胞自配半固體培養(yǎng)基背景較為清澈，細(xì)胞生長較大，IgG蛋白表達(dá)量較高(細(xì)胞克隆表達(dá)的抗體熒光圖直徑約1-2mM)，生長狀態(tài)相對(duì)較好(圖7-圖14)。

離心的自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基(圖7-圖14))與商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞生長狀態(tài)(圖15、圖16)相比較，離心自配半固體培養(yǎng)基CHO-S細(xì)胞克隆生長較為緊湊，熒光強(qiáng)度和大小部分克隆表現(xiàn)較強(qiáng)。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基應(yīng)用效果基本達(dá)到甚至優(yōu)于Molicular Devices商業(yè)半固體培養(yǎng)基；本發(fā)明提供的半固體培養(yǎng)基配制方法有利于提高其應(yīng)用性能。

實(shí)施例13、離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基與商業(yè)CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G Fed-batch培養(yǎng)CHO-S細(xì)胞

試驗(yàn)方法：將實(shí)施例12配制的CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基離心液體(培養(yǎng)基配方見實(shí)施例1)和商業(yè)培養(yǎng)基(同實(shí)施例12)從-20℃冰箱分別取出，4℃冰箱過夜溶解。在細(xì)胞房超凈工作臺(tái)鋪一塊6-well plate：50ml無菌離心管中加入15ml半固體培養(yǎng)基，再加入0.6ml L-Glutamine(Gibco，200mM，cat：25030-081)，接著加入150μl的CloneDetect(Molicular Devices，cat：K8200)，將其充分混合后加入3000～12000個(gè)細(xì)胞(即500～2000個(gè)細(xì)胞/孔)，再次混合均勻，取2ml混合物到每個(gè)孔中(避免汽包產(chǎn)生，并且平鋪)。最后放入恒溫培養(yǎng)箱(36.5℃，5％CO₂)培養(yǎng)6天。挑選克隆到96-well中培養(yǎng)5天，以Elisa titer高低和生長狀態(tài)從96-well中挑選出一定克隆到24-well中培養(yǎng)5天，同樣以Elisa titer高低和生長狀態(tài)從24-well中挑選出一定克隆到6-well中培養(yǎng)5天，最后仍然以Elisa titer高低和生長狀態(tài)從6-well中挑選出較少克隆到搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，5天左右，將克隆一部分安全凍存，剩下進(jìn)行Fed-batch培養(yǎng)。

對(duì)照組為Fed-batch培養(yǎng)母克隆sub 1。試驗(yàn)用所有亞克隆均從母克隆sub 1鋪板挑選克隆篩選得到。

Fed-batch培養(yǎng)條件：250ml搖瓶接種50ml，搖床轉(zhuǎn)速130rpm，36.5℃培養(yǎng)，兩組實(shí)驗(yàn)補(bǔ)料時(shí)間和次數(shù)均相同，第6天進(jìn)行降溫。

Fed-batch培養(yǎng)結(jié)果見表1-表2。

表1 離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基Fed-batch CHO-S細(xì)胞生長曲線

表2 Molicular Devices商業(yè)半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G Fed-batch CHO-S細(xì)胞生長曲線

離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基篩選出十個(gè)克隆，生長最高密度達(dá)27×10⁶cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗體表達(dá)滴度達(dá)3.19g/L。商業(yè)半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G篩選出十個(gè)克隆，生長最高密度達(dá)28×10⁶cells/ml，活率大部分克隆在50％以上(14天)，最高IgG抗體表達(dá)滴度達(dá)3.25g/L。

以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：本發(fā)明提供的離心自配CHO-S細(xì)胞半固體培養(yǎng)基應(yīng)用效果基本達(dá)到Molicular Devices商業(yè)半固體培養(yǎng)基CloneMedia-CHO-G，可以替代其用于日常生產(chǎn)研發(fā)；本發(fā)明提供的半固體培養(yǎng)基配制方法有利于提高其應(yīng)用性能。