本發(fā)明涉及一種CYP78A基因的應(yīng)用，特別是在增加玉米株高和增強(qiáng)植株長勢中的應(yīng)用。(二)
背景技術(shù)：
：隨著人類對糧食的需求不斷增加，高產(chǎn)作物的培育也越來越重要。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來改良農(nóng)作物的性狀，如獲得抗蟲能力、抗除草劑能力、增強(qiáng)抗干旱、抗病能力等。高產(chǎn)也是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物改良的重要內(nèi)容。例如，利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)一種植物的轉(zhuǎn)錄因子(Transcriptionfactor)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量(U.S.Pat.No.7,598,529,4)。農(nóng)作物產(chǎn)量是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，受到很多基因的調(diào)控(XingandZhang,(2010)AnnualReviewofPlantBiology,61:421-442)。因此，研究和發(fā)掘有重大應(yīng)用價(jià)值的新基因或者已知基因的新功能，并利用這些基因提高農(nóng)作物產(chǎn)量仍然十分需要。20世紀(jì)50～60年代，中國的實(shí)踐與株型理論相結(jié)合的第一個(gè)發(fā)展階段是矮化育種，這個(gè)階段的研究中心是作物的株高，通過降低株高使品種的耐肥、抗倒性和密植性顯著增強(qiáng)，進(jìn)而提高葉面積指數(shù)和生物產(chǎn)量，從而提高作物群體的產(chǎn)量。但是，隨著株型理論研究的深入和生產(chǎn)實(shí)踐發(fā)展，對株高有了新的認(rèn)識，矮稈主要是提高了經(jīng)濟(jì)系數(shù)，生物產(chǎn)量并無明顯變化，認(rèn)為產(chǎn)量上要有較大的突破必須在生物產(chǎn)量上有大幅度的提高。適當(dāng)增加一點(diǎn)株高，可以降低葉面積密度，有利于CO2擴(kuò)散和中下部葉片的受光，對生物量和后期籽粒充實(shí)顯然是有利的。同時(shí)也有研究證明，株高與生物量呈顯著的正相關(guān)，尤其是在高產(chǎn)條件下關(guān)系更為密切，而生物量增加又是穗粒數(shù)和千粒重增加的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，發(fā)掘和利用株高調(diào)控基因是提高作物生物量和產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑。細(xì)胞色素P450是植物中最大的酶蛋白家族，在植物體內(nèi)擔(dān)當(dāng)重要的功能。P450的主要特征是在所有結(jié)構(gòu)已知的P450蛋白中都含有一個(gè)保守的血紅素結(jié)合域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域含有保守的FxxGxRxCxG序列。P450具有廣泛的催化活性，其催化的反應(yīng)類型廣泛而復(fù)雜，如烯基的環(huán)氧化反應(yīng)，烷基的烴化作用，氮、硫、氧位的脫烷基作用，烴基的氧化作用，過氧化作用，脫硫作用，氧化性的碳-碳鍵斷裂，氧化性脫氨、脫鹵和脫氫等10多種。植物細(xì)胞色素P450的功能主要可歸為兩大類：1)參與生物合 成途徑，2)參與生物解毒途徑。參與生物合成途徑的植物P450在苯丙烷類、生物堿、萜類、生菁糖苷類、植物激素等的合成中起重要作用(Heetal.,(2008)PharmaceuticalBiotechnology,15:142-147)。CYP78A是P450家族的一個(gè)亞族，具有重要的功能(Baketal.,(2011)TheArabidopsisBook/AmericanSocietyofPlantBiologists,9:e0144)。植物CYP78A基因中，功能研究展開的比較早的是玉米中的CYP78A基因CYP78A1。該基因主要在發(fā)育的花序中表達(dá)，可能參與脂肪酸的代謝，但由于沒有對應(yīng)的突變體，CYP78A1在玉米中的具體功能尚不清楚(Imaishietal.,(2000)BiosciBiotechBioch,64:1696-1701)。擬南芥的cyp78a5/kluh(klu)突變體和水稻中的cyp78a11/plastochron1(pla1)突變體表現(xiàn)出葉片起始加快和器官變小等表型變化(Kawakatsuetal.,(2006)PlantCell,18:612-625；Xiongetal.,(2006)CellResearch,16:267-276)。相反的，在擬南芥中過表達(dá)CYP78A5或者CYP78A9基因后植株的器官變大(Anastasiouetal.,(2007)DevelopmentalCell,13:843-856)。KURATANORI等發(fā)現(xiàn)在水稻中過表達(dá)CYP78A11基因后，谷粒的大小和重量都增加，并對利用CYP78A11基因增加水稻粒重的方法申請了專利(日本專利No.2004-017246)。李云海等發(fā)現(xiàn)擬南芥中的CYP78A6基因和CYP78A9基因具有類似的調(diào)控種子大小的功能，并對利用CYP78A基因調(diào)控種子大小的方法申請了專利(U.S.Pat.No.PCT/GB2013/050072)。盡管已有的研究發(fā)現(xiàn)植物CYP78A基因具有調(diào)控葉片起始(Kawakatsuetal.,(2006)PlantCell,18:612-625；Xiongetal.,(2006)CellResearch,16:267-276)和種子大小的功能(Anastasiouetal.,(2007)DevelopmentalCell,13:843-856；日本專利No.2004-017246；U.S.Pat.No.PCT/GB2013/050072)，但CYP78A在不同植物中的功效并不相同。特別是從水稻CYP78A的功能并不能推測出其對玉米的生長、發(fā)育和產(chǎn)量的影響。例如，以前在水稻上的相關(guān)研究并沒有發(fā)現(xiàn)該基因顯著增加植株高度和增強(qiáng)生長勢方面的功能，而本發(fā)明首次公開了在玉米中提高CYP78A基因的表達(dá)可以增加株高、增強(qiáng)植株生長勢。玉米的Mei2同源基因“terminalear1”(ZmTE1)在植物的芽和根的分生組織中表達(dá)，失去ZmTE1基因功能的突變體玉米的葉片形態(tài)和葉片生長的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，說明其可能參與決定植株葉片在莖干上生長的空間結(jié)構(gòu)(Veitetal.,(1998)Nature,393:166-168)。水稻中的Mei2的同源基因OsTEL的功能和玉米ZmTE1相似。Kawakatsu等發(fā)現(xiàn)失去OsTEL基因(又稱為PLA1)功能的水稻突變體的葉片形成速 度加快，葉片成熟速度加快，說明其具有調(diào)控葉片形成和葉片成熟的功能(Kawakatsu,etal.,(2006)PlantCell,18:612-625)。最近，我們發(fā)現(xiàn)TEL基因具有調(diào)控植株生長勢、種子大小或種子數(shù)量、產(chǎn)量等性狀的功能。在植物中過表達(dá)TEL基因能使作物的生長勢增強(qiáng)、種子變大或數(shù)量變多、產(chǎn)量增加(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069)。本發(fā)明首次公開了同時(shí)利用CYP78A亞族蛋白質(zhì)多肽和TEL多肽獲得株高增加、生長勢增強(qiáng)、棒子變大、生物量提高且產(chǎn)量增加的基因工程玉米的方法。(三)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種CYP78A基因的新應(yīng)用，具體為用于調(diào)控玉米株高和生長勢的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種CYP78A基因在增加玉米株高和增強(qiáng)植株長勢中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的CYP78A蛋白可以是來自任何植物，優(yōu)選自禾本科植物，比如自玉米、水稻、高粱或小麥，特別優(yōu)選來自水稻或玉米。一般可以預(yù)見這些來自不同植物的同源蛋白具有相同或者相似的功能，因此同樣可以利用這些基因改良植物的農(nóng)藝性狀。進(jìn)一步，即使不能預(yù)見這些蛋白的功能，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明提供的方法和現(xiàn)有技術(shù)測定它們是否具有促進(jìn)植物生長和光合作用增強(qiáng)的功能。本發(fā)明最優(yōu)選CYP78A基因?yàn)橄铝衼碓粗坏幕蚧蚱渫葱蛄?核苷酸同源性達(dá)85％以上)：玉米(Zeamaize)CYP78A1(氨基酸序列為SEQIDNO：1所示，核苷酸序列為SEQIDNO:4所示)、水稻(Oryzasativa)的CYP78A11基因(氨基酸序列為SEQIDNO：2所示，核苷酸序列為SEQIDNO:5所示)和高粱(Sorghumbicolor)的CYP78A1L基因(氨基酸序列為SEQIDNO：3所示，核苷酸序列為SEQIDNO:6)。編碼本發(fā)明CYP78A蛋白的多核苷酸序列可以有多種不同的變異，多核苷酸序列的變異包括但不限于：1)由于編碼同一個(gè)氨基酸的密碼子不同而獲得不同的多核苷酸序列，這些序列編碼具有相同活性的蛋白質(zhì)多肽；2)來源于生物的遺傳多態(tài)性(GeneticPolymorphism)，即同一種植物的不同個(gè)體或者群體之間的多樣性；3)通過人工操作導(dǎo)入多核苷酸序列的變異。人工導(dǎo)入的這種變異可以是隨機(jī)的變異，也可以是針對性的定向變異。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員就能通過分子生物學(xué)的方法產(chǎn)生點(diǎn)突變，插入或者缺失變異等。通過人工操作導(dǎo)入多核苷酸序列的變異也包括通過GeneShuffling等方法獲得仍然具有正常功能的雜合基因。例如U.S.Pat.No.2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature, 370:389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.,15:436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509；Cramerietal.(1998)Nature,391:288-291；andU.S.Pat.NOs.5,605,793and5,837,458。本發(fā)明所述CYP78A基因的多核苷酸序列，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通?？梢岳肞CR方法、DNA雜交方法等從一種植物中克隆到相應(yīng)的同源基因。根據(jù)本發(fā)明提供的多核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，可以通過PCR方法獲得同源基因的部分或者全部序列。而一旦獲得該基因的部分序列，就可以通過不同的方法克隆到全長基因。另一方面，利用本發(fā)明提供的多核苷酸制備探針，可以通過DNA雜交方法從一種植物的DNA文庫中克隆獲得其同源基因。本發(fā)明所述CYP78A基因編碼的多肽可以用于調(diào)控玉米的株高、生長勢、葉片面積、棒子大小、生物量和產(chǎn)量，優(yōu)選CYP78A基因編碼的多肽為下列之一或具有75％以上同源性的氨基酸：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3，最優(yōu)選CYP78A基因編碼的多肽為下列之一SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3，所述應(yīng)用方法包括提高玉米中CYP78A基因的表達(dá)或活性，具體方法包括：1)構(gòu)建包含本發(fā)明提供的多核苷酸序列的表達(dá)框；表達(dá)框可以通過一個(gè)或者幾個(gè)控制表達(dá)的多核苷酸序列(比如啟動(dòng)子和終止子)與CYP78A1或其同源基因功能性連接而獲得；本發(fā)明特別提供了利用CYP78A1或其同源基因本身的表達(dá)框，即包含這些基因本身的啟動(dòng)子和終止子的整個(gè)DNA片段；2)將表達(dá)框?qū)氲街参镏校@得表達(dá)；特別是通過利用基因表達(dá)調(diào)控序列，使導(dǎo)入的基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)特點(diǎn)與其內(nèi)生基因相同或者類似，以減少非組織特異性過量表達(dá)CYP78A1或其同源基因可能對植物產(chǎn)生的不利影響。本發(fā)明獲得的CYP78A1或其同源基因過表達(dá)植株鑒定的方法包括：觀察植株表型、噴灑除草劑、分子物學(xué)方法等，當(dāng)然，在實(shí)際應(yīng)用中可以多種方法一起使用。由于本發(fā)明提供的CYP78A1或其同源基因過表達(dá)植株和對照植株有比較明顯的表型差異，可以通過肉眼辨別。CYP78A1或其同源基因表達(dá)的玉米植株表現(xiàn)為株高增加、或生長勢增加、或葉片變寬、或生物量增加、或同時(shí)具備上述兩種或兩種以上的表型變化。如果標(biāo)記基因和目的基因緊密連鎖，可以用噴灑除草劑的方法來鑒定目的基因。例如，將CYP78A1或其同源基因構(gòu)建在以抗草甘膦基因(EPSPS)為篩選標(biāo)記的載體上，抗草甘膦的植株很可能就是CYP78A1或其同源基因過表達(dá)了的植株。鑒定CYP78A1或其同源基因過表達(dá)植株還可以用分子生物學(xué)方法，這些方法主要包括 Southern雜交法和PCR等技術(shù)，檢測目標(biāo)基因的DNA；熒光定量PCR或者定量PCR等技術(shù)，檢測目標(biāo)基因mRNA的水平；Western雜交法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等技術(shù)，檢測目標(biāo)基因的蛋白水平。進(jìn)一步，本發(fā)明所述CYP78A基因在增加玉米株高、增強(qiáng)植株長勢和產(chǎn)量中的應(yīng)用是將CYP78A基因與TEL基因通過雜交或者其它方式轉(zhuǎn)入玉米植株，實(shí)現(xiàn)玉米株高、長勢和產(chǎn)量的增加。本發(fā)明通過提高玉米中CYP78A基因和TEL基因的表達(dá)或活性，能夠使玉米株高增加、生長勢增強(qiáng)、葉片面積變大、棒子變大、種子變大或變多、生物量增加且產(chǎn)量增加，具體方法包括：1)構(gòu)建包含本發(fā)明提供的多核苷酸序列的表達(dá)框，表達(dá)框可以通過一個(gè)或者幾個(gè)控制表達(dá)的多核苷酸序列(比如啟動(dòng)子和終止子)分別與CYP78A或其同源基因以及TEL或其同源基因功能性連接而獲得。本發(fā)明特別提供了利用CYP78A1或其同源基因，以及ZmTE1或其同源基因本身的表達(dá)框，即包含這些基因本身的啟動(dòng)子和終止子的整個(gè)DNA片段；2)將CYP78A1或其同源基因的表達(dá)框和ZmTE1或其同源基因的表達(dá)框構(gòu)建在同一個(gè)載體上導(dǎo)入到植物中，或者將CYP78A1或其同源基因的表達(dá)框和ZmTE1或其同源基因的表達(dá)框分別構(gòu)建在兩個(gè)獨(dú)立的載體上再通過共侵染或者雜交的方法以及其它方法把上述兩種表達(dá)框?qū)氲酵恢仓曛?，最終獲得同時(shí)提高上述兩種基因表達(dá)的植株。特別是通過利用基因表達(dá)調(diào)控序列，使導(dǎo)入的基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)特點(diǎn)與其內(nèi)生基因相同，以減少非組織特異性過量表達(dá)CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因可能對植物產(chǎn)生的不利影響。目前，多基因轉(zhuǎn)化主要有以下幾種方法：雜交法(Cao,j.,et.al.,(2002)Theor.Appl.Genet.,105:258-264)、再轉(zhuǎn)化法(Rosati,C.,2003,Mol.Breed,12:197-208)、共轉(zhuǎn)化法、基因連接法(Halpin,(2005)PlantBiotechnologyJ,3:141-155)和多順反子轉(zhuǎn)基因法(Halpinetal.,(2001)PlantMolBiol,47:295-310)等。本發(fā)明中獲得的同時(shí)提高CYP78A(優(yōu)選CYP78A1)或其同源基因以及TEL(優(yōu)選ZmTE1)或其同源基因表達(dá)的植株進(jìn)行鑒定的方法包括觀察植株表型、噴灑除草劑、分子物學(xué)方法等。當(dāng)然，在實(shí)際應(yīng)用中可以多種方法一起使用。由于CYP78A(優(yōu)選CYP78A1)或其同源基因過表達(dá)植株與TEL(優(yōu)選ZmTE1)或其同源基因過表達(dá)植株在表型上有顯著差異，可以通過肉眼辨別。所以同時(shí)具有提高這兩種基因表達(dá)后的表型的植株很可能同時(shí)提高了這兩種基因的表達(dá)。例如，提高CYP78A(優(yōu)選CYP78A1)或其同源基因表達(dá)的玉米植株表現(xiàn)為株高增加、或葉片變寬、或生長勢增加、或生物量增加、或同時(shí)具備上述兩種或兩種以上的表型變化；提 高TEL(優(yōu)選ZmTE1)或其同源基因表達(dá)的玉米植株最大的表型變化是棒子變大且種子變大或變多。而同時(shí)提高了上述兩類基因表達(dá)的植株則具有株高增加、葉片變寬、生長勢增加或生物量增加、并且棒子變大、種子變大或變多的表型變化。如果CYP78A(優(yōu)選CYP78A1)或其同源基因以及TEL(優(yōu)選ZmTE1)或其同源基因分別構(gòu)建在兩個(gè)以不同的抗除草劑基因作為篩選標(biāo)記的載體上時(shí)，鑒于標(biāo)記基因和目的基因緊密連鎖，可以用噴灑除草劑的方法來鑒定目的基因，噴灑兩種除草劑后仍能成活的轉(zhuǎn)基因植株為兩個(gè)目標(biāo)基因都存在。例如，將CYP78A11或其同源基因構(gòu)建在以抗草甘膦基因(EPSPS)為篩選標(biāo)記的載體上，而把ZmTE1或其同源基因構(gòu)建在以抗草丁膦(Bar)為篩選標(biāo)記的載體上。既抗草甘膦又抗草丁膦的轉(zhuǎn)基因植株則很可能是同時(shí)提高了兩個(gè)基因的表達(dá)。鑒定同時(shí)提高CYP78A(優(yōu)選CYP78A1)或其同源基因以及TEL(優(yōu)選ZmTE1)或其同源基因表達(dá)的植株還可以用分子生物學(xué)方法，這些方法主要包括Southern雜交法和PCR等技術(shù)，分別檢測兩個(gè)目標(biāo)基因的DNA；熒光定量PCR或者定量PCR等技術(shù)，分別檢測兩個(gè)目標(biāo)基因mRNA的水平；Western雜交法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等技術(shù)，分別檢測兩個(gè)目標(biāo)基因的蛋白水平。本發(fā)明提供的多核苷酸可以被克隆到質(zhì)粒載體中，在細(xì)胞中獲得大量復(fù)制。利用這種DNA重組技術(shù)，本發(fā)明獲得的多核苷酸可以和控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子功能性地連接而構(gòu)成表達(dá)框。所謂功能性地連接指啟動(dòng)子和終止子能夠發(fā)揮控制與它連接的多核苷酸的表達(dá)。通常啟動(dòng)子連接在5’端，終止子連接在3’端?？刂苹虮磉_(dá)的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域的技術(shù)人員都已經(jīng)知道的技術(shù)。Potenza等的綜述詳細(xì)介紹和總結(jié)了有關(guān)啟動(dòng)子的研究(Potenzaetal(2004)InVitroCellDevBiol-Plant,40:1-22)。啟動(dòng)子包括組成型表達(dá)的啟動(dòng)子、組織特別表達(dá)啟動(dòng)子、可以誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子等。本發(fā)明特別提供了來源于CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的區(qū)域可以通過試驗(yàn)得到確定。一般啟動(dòng)子可以是編碼蛋白質(zhì)的閱讀框5’端外面至少0.25kb、0.5kb、1.0kb、2.0kb或3.0kb的DNA片段。CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因的天然啟動(dòng)子除了可以用來控制其本身基因的表達(dá)以外，也可以與其他植物的同源基因功能性地連接，在其他植物中控制這些基因的表達(dá)，以獲得改良的轉(zhuǎn)基因植物。例如水稻CYP78A11的啟動(dòng)子用來控制玉米CYP78A1基因在玉米中的表達(dá)，以及水稻OsTEL的啟動(dòng)子用來控制玉米ZmTE1基因在玉米中的表 達(dá)?？刂票景l(fā)明提供的基因的啟動(dòng)子還可以是組織特異的啟動(dòng)子，例如STM特異啟動(dòng)子(U.S.Pat.No.5880330)，ARSK1根特異表達(dá)啟動(dòng)子(UnitedStatesPatentApplication20040067506)，AP1花分生組織啟動(dòng)子(Sasaki,Katsutomo,etal.(2011)Plantbiotechnology,28:181-188)。這些啟動(dòng)子可以導(dǎo)致CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因在一些組織中特異性表達(dá)，從而促進(jìn)這些特異組織的生長?？刂票景l(fā)明提供的基因的啟動(dòng)子還可以是組成型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動(dòng)子(TeradaandShimamoto,(1990)Molecular&GeneralGenetics,220:389-392)，水稻的actin1啟動(dòng)子(Mcelroyetal.,(1990)ThePlantCell,2:163-171)。這些啟動(dòng)子可以導(dǎo)致CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因在植物的大部分組織中特異性表達(dá)，從而促進(jìn)這些組織的生長。控制基因表達(dá)的終止子可以是提供基因的天然終止子，也可以是同種植物的其他基因或者其他植物基因的終止子。常用的終止子包括來源于農(nóng)桿菌的Octopine合成酶終止子和nopaline合成酶終止子等。參考文獻(xiàn)包括：Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot(1991)Cell,64:671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.,5:141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell,2:1261-1272；Munroeetal.(1990)Gene,91:151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.,17:7891-7903；andJoshietal.(1987)NucleicAcidsRes.,15:9627-9639。為了提高基因在目標(biāo)植物中的表達(dá)水平，基因的多核苷酸序列可以進(jìn)一步修飾和改變。這些改變包括刪除內(nèi)含子、清除一些可能影響基因正常表達(dá)的序列，如隱藏的非成熟的PolyA信號序列等。根據(jù)目標(biāo)植物的密碼子使用情況，編碼相同蛋白質(zhì)多肽的多核苷酸序列可以優(yōu)化，以提高其在目標(biāo)植物中的表達(dá)量。本發(fā)明的另外一個(gè)方面是利用本發(fā)明提供的基因，找到這個(gè)基因在基因組中的位置，然后通過DNA定點(diǎn)插入技術(shù)，將基因表達(dá)的調(diào)控序列，如CaMV的35S增強(qiáng)子，插入到可以增強(qiáng)本發(fā)明基因表達(dá)的位點(diǎn)上。一個(gè)增強(qiáng)子往往能夠影響附近基因的表達(dá)，有的增強(qiáng)子可以提高相距20kb或更遠(yuǎn)的基因的表達(dá)。目前植物的DNA定點(diǎn)插入技術(shù)已經(jīng)很成熟(Townsend,JeffreyA.,etal.(2009)Nature,459:442-445；Jiang,W.,etal.(2013).Nat.Biotechnol.,31:233–239；Cong,L.etal.(2013)Science,339:819–823)。因此，利用定點(diǎn)插入的方法，將增強(qiáng)子插入CYP78A基因附近就可能提高這個(gè)基因的表達(dá)。本發(fā)明用于構(gòu)建基因表達(dá)框的載體也可以同時(shí)包含一個(gè)選擇標(biāo)記基因表達(dá)框。這個(gè)選擇標(biāo)記基因可以用來選擇轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycinphosphotransferaseII(NEO)和hygromycinphosphotransferase(HPT)、抗除草劑基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他選擇標(biāo)記基因同樣可以用作本發(fā)明轉(zhuǎn)化的選擇基因。本發(fā)明提供的基因可以導(dǎo)入植物從而獲得轉(zhuǎn)基因的高產(chǎn)植物，這些植物包括但不限于玉米、小麥、大麥、高粱、水稻、甘蔗、大豆、胡蘿卜、馬鈴薯、棉花、向日葵、油菜、橡樹、草坪草、牧草。目前本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員能夠利用現(xiàn)有技術(shù)將本發(fā)明提供的多核苷酸導(dǎo)入到植物中進(jìn)行表達(dá)。比較常用的方法是基因槍方法(Kleinetal,1987,Nature(London),327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法((DeBlaereetal,1987,Meth.Enzymol.,143:277)。但是本發(fā)明不限于這種方法。不同植物的轉(zhuǎn)化方法和步驟有所不同。通常使用較廣的方法是通過農(nóng)桿菌或基因槍導(dǎo)入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體。然后用相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。再進(jìn)行分化而獲得轉(zhuǎn)化芽，通過生根培養(yǎng)基培養(yǎng)就可以獲得可以種植的轉(zhuǎn)基因苗。進(jìn)一步，抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物可以通過噴施除草劑篩選，例如噴施煙嘧磺隆可以殺滅非轉(zhuǎn)基因的水稻。本發(fā)明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、甘蔗、棉花、小麥、大豆、油菜、草坪草或牧草。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供CYP78A基因的一種新應(yīng)用，通過在玉米中過表達(dá)CYP78A基因，提高玉米的株高和生長勢，進(jìn)而提高玉米的生物量，并最終實(shí)現(xiàn)玉米增產(chǎn)；將CYP78A基因與TEL基因聯(lián)合導(dǎo)入玉米植株，實(shí)現(xiàn)植株株高增加、葉片變寬、生長勢增加、生物量增加，并且棒子變大、種子變大或變多的表型變化。(四)附圖說明圖1：植物轉(zhuǎn)化載體pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖，玉米CYP78A1基因，CYP78A1基因的核苷酸序列為SEQIDNO：4，包括編碼區(qū)和終止子的核苷酸序列為SEQIDNO：7所示。圖2：植物轉(zhuǎn)化載體pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖，水稻CYP78A11基因的核苷酸序列為SEQIDNO：5所示，包括編碼區(qū)和終止子的核苷酸序列為SEQIDNO：8所示。圖3：CYP78A基因過表達(dá)的苗期玉米植株，其中CK為對照，T為CYP78A1基因過表達(dá)植株。圖4：CYP78A基因和TEL基因同時(shí)加強(qiáng)表達(dá)的玉米植株，其中CK為對照，T為轉(zhuǎn)基因植株。(五)具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：本發(fā)明的以下實(shí)施例所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology和J.Sambrook等編寫ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說明。實(shí)施例1.玉米CYP78A基因--CYP78A1過量表達(dá)載體的構(gòu)建玉米CYP78A1基因編碼區(qū)域(核苷酸序列如SEQIDNo.4所示)和終止子DNA片段通過人工合成獲得，其核苷酸序列如SEQIDNo.7，該片段可以通過BamHI和KpnI酶切以后獲得。CYP78A1基因的啟動(dòng)子片段pCYP78A1通過PCR獲得。PCR的2個(gè)引物分別是：pCYP78A1-F(5’-AAGCTTCTCAAGACTCCTAATTCTCAGC-3’)和pCYP78A1-R(5’-AGATCTTTCTGGCTAGCTGCTTCTAGTAGC-3’)。引物中分別設(shè)計(jì)了HindIII和BglII酶切位點(diǎn)。以玉米(B73)基因組為模板，PCR獲得的大約1.9kb的DNA片段后克隆到pMD-18-T-Vector載體(TaKaRa)中，測定序列，最終獲得如核苷酸序列為SEQIDNO.9所示的啟動(dòng)子序列，該片段可以利用HindIII和BglII酶切獲得。PCR的反應(yīng)體系為：5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)(購自TaKaRa公司)，10μl；dNTPMixture(各2.5mM)，4μl；引物pCYP78A1-F(10μM)，1μl；引物pCYP78A1-R(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTARTMHSDNAPolymerase(2.5U/μl)，0.5μl；滅菌蒸餾水，加至最終體積為50μl。PCR的條件為：95℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。農(nóng)桿菌T-DNA載體的構(gòu)建：雙元載體pCambia1300-pZmUbi-G10的全部DNA序列如SEQIDNO.11所示，該載體包含一個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)，作為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因；包含HindIII和KpnI 位點(diǎn)，作為目的基因的克隆位點(diǎn)。HindIII和BglII酶切獲得CYP78A1基因的啟動(dòng)子片段以及BamHI和KpnI酶切以后獲得的CYP78A1基因編碼區(qū)域和終止子DNA片段被同時(shí)連接到經(jīng)過HindIII和KpnI酶切的pCambia1300-pZmUbi-G10中，獲得包括耐草甘膦基因和CYP78A1基因的T-DNA載體。這個(gè)載體的T-DNA中包含如下基因結(jié)構(gòu)：“啟動(dòng)子-CYP78A1基因-終止子-啟動(dòng)子-耐草甘膦基因-終止子”。這個(gè)載體命名為：pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1(圖1)。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把這個(gè)T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2.水稻CYP78A基因CYP78A11過量表達(dá)載體的構(gòu)建水稻CYP78A11基因編碼區(qū)域(核苷酸序列為SEQIDNO.5所示)和終止子DNA片段通過PCR獲得。PCR的2個(gè)引物分別是：CYP78A11-F1(5’-GGATCCAACAATGGCAATGGCCACCGCCAC-3’)和CYP78A11-R1(5’-GGTACCCATCTCACAAGCTCACACGGC-3’)。以浙江主栽水稻品種秀水134基因組為模板，PCR獲得的大約2.2kb的DNA片段克隆到pMD-18-T-Vector載體(TaKaRa)中，測定序列，獲得如SEQIDNO.8所示的DNA片段，這個(gè)DNA片段除了編碼水稻CYP78A11氨基酸的DNA序列以外，還包含了一個(gè)內(nèi)含子和終止子。PCR的反應(yīng)體系為：5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)(購自TaKaRa公司)，10μl；dNTPMixture(各2.5mM)，4μl；引物CYP78A11-F1(10μM)，1μl；引物CYP78A11-R1(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTARTMHSDNAPolymerase(2.5U/μl)，0.5μl；滅菌蒸餾水，加至最終體積為50μl。PCR的條件為：95℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸140sec，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。水稻CYP78A11基因的啟動(dòng)子片段pCYP78A11通過PCR獲得。PCR的2個(gè)引物分別是：pCYP78A11-F1(5’-GGTACCGATTAGATAAAGCCACTTCCAC-3’)和pCYP78A11-R1(5’-GGATCCAGGTGTTTGTGGTTTTGCTTGTG-3’)。引物中分別設(shè)計(jì)了KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)。以浙江主栽水稻品種秀水134的基因組CYP78A11基因?yàn)槟０?，PCR獲得的大約1.9kb的DNA片段克隆到pMD-18-T-Vector載體(TaKaRa)中，測定序列，獲得如SEQIDNO.10的所示的啟動(dòng)子序列。PCR的反應(yīng)體系為：5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)(購自TaKaRa公司)，10μl；dNTPMixture(各2.5mM)，4μl；引物pCYP78A11-F1(10μM)，1μl；引物pCYP78A11-R1(10μM)，1μl；模板DNA100ng；PrimeSTARTMHSDNAPolymerase(2.5U/μl)， 0.5μl；滅菌蒸餾水，加至最終體積為50μl。PCR的條件為：95℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸2min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。農(nóng)桿菌T-DNA載體的構(gòu)建：雙元載體pCambia1300-pZmUbi-G10的全部DNA序列如SEQIDNO.11所示，該載體包含一個(gè)耐草甘膦基因(EPSPS)，作為轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因；包含KpnI位點(diǎn)，作為目的基因的克隆位點(diǎn)。pCambia1300-pZmUbi-G10經(jīng)過KpnI酶切以后，去磷酸化，作為克隆的載體與經(jīng)過適當(dāng)酶切的2個(gè)目的基因片段共同連接。目的基因的2個(gè)片段分別是經(jīng)過KpnI和BamHI酶切的啟動(dòng)子(pCYP78A11)以及包括目的基因編碼區(qū)域和終止子的片段。獲得的克隆有2個(gè)不同的可能，通過酶切選擇T-DNA中如下基因結(jié)構(gòu)的克?。骸皢?dòng)子-CYP78A11基因-終止子-啟動(dòng)子-耐草甘膦基因-終止子”。這個(gè)載體命名為：pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11(圖2)。最后，通過電轉(zhuǎn)的方法把這個(gè)T-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LB4404中，通過含有15μg/ml四環(huán)素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基篩選出陽性克隆，并保菌，用于接下來的植物轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3.(1)玉米轉(zhuǎn)化玉米的轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)比較成熟，例如Frame等描述了利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的方法(Frameetal.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)。分別取含載體pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1和pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11的農(nóng)桿菌(即含T-DNA載體的農(nóng)桿菌)劃板，挑單菌落接種，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。取授粉后8－10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0－1.5mm)。將含有T-DNA載體的農(nóng)桿菌與未成熟胚共培養(yǎng)2－3天(22℃)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基中含有200mg/L的Timentin，用于殺滅農(nóng)桿菌，參照(Frameetal.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22))，28℃暗培養(yǎng)10－14天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有終濃度2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上(Frameetal.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)，28℃暗培養(yǎng)2－3周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮含終濃度2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2－3周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上(Frameetal.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)，28℃暗培養(yǎng)10－14天，每皿一個(gè)株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10－14天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上(Frameetal.,(2002)PlantPhysiol,129:13-22)，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全，然后 移植到溫室中單株培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)基因玉米的抗除草劑能力。用稀釋300倍的孟山都的41％的草甘膦水劑噴灑，7天后葉片發(fā)黃，枯死的為陰性；和噴清水對照長勢一樣的為陽性植株。(2)CYP78A基因轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定通過上述方法，分別獲得含轉(zhuǎn)化載體pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1、pCambia1300-G10-pCYP78A11-CYP78A11和只含有篩選標(biāo)記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因玉米植株。將T0代植株移栽到溫室中，對7葉期的含CYP78A基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株和空載體對照植株的生長勢和株高進(jìn)行比較分析。我們獲得的60個(gè)CYP78A1過表達(dá)植株(命名為ZmCYP)中有32個(gè)植株生長勢和對照相比顯著增強(qiáng)，株高和對照相比顯著增加，典型表型見圖(圖3)。其中兩個(gè)典型品系成熟期的株高如表1。表1：品系株高(cm)CK221.5±8.3ZmCYP12246.2±9.4ZmCYP55248.6±8.5*CK為只含有篩選標(biāo)記基因EPSPS的空載體的轉(zhuǎn)基因玉米植株；ZmCYP為載體pCambia1300-G10-pCYP78A1-CYP78A1的T-DNA轉(zhuǎn)化植株，其中ZmCYP后面的編號(12，55)是對不同品系隨機(jī)編號，以便于區(qū)分不同的轉(zhuǎn)化事件。CYP78A11基因過表達(dá)玉米植株的表型變化和ZmCYP類似，55個(gè)CYP78A11過表達(dá)植株中有30個(gè)植株生長勢和對照相比顯著增強(qiáng)，株高和對照相比顯著增加。為了比較增加表達(dá)CYP78A在水稻和玉米中表型上的異同，參考本實(shí)驗(yàn)室已有的水稻轉(zhuǎn)化方法(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069)，我們轉(zhuǎn)化獲得了45個(gè)轉(zhuǎn)CYP78A1基因的獨(dú)立水稻轉(zhuǎn)化體和30個(gè)轉(zhuǎn)CYP78A11基因的獨(dú)立水稻轉(zhuǎn)化體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)化體水稻與空載體對照轉(zhuǎn)化體在植株高度和植株生長勢方面沒有顯著差異。實(shí)施例4.(1)轉(zhuǎn)基因玉米的雜交在轉(zhuǎn)基因玉米試驗(yàn)田中把通過實(shí)施例3的方法轉(zhuǎn)化出來的CYP78A基因過表達(dá)玉米植株和申請人之前已經(jīng)獲得的TEL基因過表達(dá)玉米植株(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069)分別種植在不同的區(qū)塊。在開花前用羊皮紙袋把將要雜交的轉(zhuǎn) 基因玉米植株的雌花和雄花分別套袋。在玉米開花后，把CYP78A基因轉(zhuǎn)基因玉米的花粉授到TEL基因轉(zhuǎn)基因玉米的雌花上或者把TEL基因轉(zhuǎn)基因玉米的花粉授到CYP78A基因轉(zhuǎn)基因玉米雌花上。等到授粉后的玉米棒子灌漿并且成熟后，采下來曬干，用于繁種和進(jìn)一步研究。(2)同時(shí)增強(qiáng)了CYP78A基因和TEL基因表達(dá)的玉米的鑒定分子生物學(xué)方法：從CYP78A基因轉(zhuǎn)基因玉米和TEL基因轉(zhuǎn)基因玉米雜交后代中用分別針對兩個(gè)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的引物采用熒光定量PCR的方法鑒定出ZmTE1基因和CYP78A1基因同時(shí)過表達(dá)的玉米植株。鑒定ZmTE1基因表達(dá)的引物為：ZmTE1-RT-F:TGCATCCAATCCAACGAGTG和ZmTE1-RT-R:GCGATGTCAGGTTGACGAAG；鑒定CYP78A1基因表達(dá)的引物為：ZmCYP-RT-F:TACGACCCAAGCAACGTCAC和ZmCYP-RT-R:ACGTCGACGAAGTCAGCATT。上述2個(gè)基因的過表達(dá)植株中，ZmTE1基因和CYP78A1基因的相對表達(dá)量與空載體對照植株相比分別增加至少3倍。表型觀察法：TEL基因過表達(dá)植株的表型變化為植株變高，棒子變大，種子變大或變多；CYP78A基因過表達(dá)植株的表型變化為植株變高，生長勢增強(qiáng)。同時(shí)增強(qiáng)了ZmTE1基因表達(dá)和CYP78A1基因表達(dá)的玉米和空載體對照植株相比，株高增加，生長勢增強(qiáng)，棒子變大，棒子上的種子變大或者變多，產(chǎn)量增加，典型表型見圖(圖4)。當(dāng)前第1頁1 2 3