本發(fā)明涉及具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的新的黃酮類衍生物及其非毒性的藥學(xué)上可接受的鹽，以及含有這些化合物作為活性成分的藥物組合物，以及該黃酮類衍生物及其非毒性的藥學(xué)上可接受的鹽以及含有這些化合物作為活性成分的藥物組合物在制備降尿酸藥物方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

芹菜素是研究最廣泛的黃酮化合物之一，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用等。體外研究表明，芹菜素還具有黃嘌呤氧化酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。

但是，芹菜素的藥理學(xué)作用的選擇性有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供式I所示的具有選擇性黃嘌呤氧化酶抑制作用的新的芹菜素類衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽類：

其中，R為H，或C₁-C₅的直鏈或支鏈烷基；n為1-10的整數(shù)。

本發(fā)明還提供式I所示的具有選擇性黃嘌呤氧化酶抑制作用的新的芹菜素類衍生物，或其藥學(xué)上可接受的鹽類；所述的藥學(xué)上可接受的鹽為，但不限于鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽。

本發(fā)明還提供式藥物組合物，其含有式I所示的芹菜素類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽類以及一種或多種藥用載體或賦形劑。

最后，本發(fā)明還提供式I所示的芹菜素類衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽類用于制備降尿酸藥物的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

通過下面的實(shí)施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。

本發(fā)明目標(biāo)化合物可通過如下合成路線制備：

芹菜素在碳酸鉀存在下，與氯甲基甲醚反應(yīng)，經(jīng)分離純化得到7-甲氧基亞甲氧基-5，4’-二羥基黃酮(i)。i在碳酸鉀存在下與溴代羧酸酯反應(yīng)，生成7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-O-烷酸酯黃酮(ii)。ii在鹽酸作用下回流反應(yīng)，得到4’-O-烷酸酯取代的芹菜素(iii)。iii在甲醇水的混合溶劑中，經(jīng)碳酸鉀堿水解，得到4’-O-烷羧基取代的目標(biāo)化合物。

實(shí)施例1 5，7-二羥基-4’-(1-羧基甲氧基)黃酮(I-1)的合成

1.1 7-甲氧基亞甲氧基-5，4’-二羥基黃酮(i)的制備

在250mL三口燒瓶中加入50mL無水DMF，冰浴攪拌下，加入芹菜素10g(37mmol)，無水碳酸鉀4.1g(29.6mmol)。氬氣保護(hù)下，向反應(yīng)體系中緩慢滴加2.97g(37mmol)氯甲基甲基醚，滴加完畢后移除冰浴，室溫反應(yīng)12小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去碳酸鉀，加50mL水，用稀鹽酸調(diào)pH至中性。加乙酸乙酯萃取(100mL×3)。乙酸乙酯層依次用飽和氯化鈉溶液洗、水洗，無水硫酸鈉干燥。過濾除去無水硫酸鈉，減壓蒸除溶劑，得黃色固體粗品。粗品用硅膠拌樣，用200-300目硅膠進(jìn)行柱層析分離提純，洗脫劑V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝8∶1，最終得到黃色固體4.5g，即7-甲氧基亞甲氧基-5，4’-二羥基黃酮(i)，產(chǎn)率：39％。熔點(diǎn)：226-228℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝3.41(3H，s)，5.33(2H，s)，6.45(1H，d，J＝1.96Hz)，6.83(1H，d，J＝1.96Hz)，6.88(1H，s)，6.93(2H，d， J＝8.72Hz)，7.97(2H，d，J＝8.72Hz)，10.41(1H，s)，12.96ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M+H]⁺C₁₇H₁₅O₆計(jì)算值：315.0790，測量值：315.0863

1.2 7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黃酮(ii-1)的制備

在250mL三口燒瓶中加入50mL無水DMF，室溫攪拌，加入化合物i 1g(3.18mmol)，無水碳酸鉀0.35g(2.54mmol)。氬氣保護(hù)下，向反應(yīng)體系中緩慢滴加0.67g(3.18mmol)2-溴乙酸乙酯，滴加完畢后60℃反應(yīng)12小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去碳酸鉀，加50mL水，用稀鹽酸調(diào)pH至中性。加乙酸乙酯萃取(100mL×3)。乙酸乙酯層依次用飽和氯化鈉溶液洗、水洗，無水硫酸鈉干燥。過濾除去無水硫酸鈉，減壓蒸除溶劑，得黃色固體粗品。粗品用硅膠拌樣，用200-300目硅膠進(jìn)行柱層析分離提純，洗脫劑V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝6∶1，最終得到黃色固體0.56g，即7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黃酮(ii-1)，產(chǎn)率：44％。

1.3 5，7-二羥基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黃酮(iii-1)的制備

在250mL圓底燒瓶中加入50mL甲醇，加入0.3g(0.75mmol)ii-1，磁力攪拌完全溶解，加入3N稀鹽酸6mL。滴加完畢后，加熱回流3小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加水50mL，靜置，析出黃色絮狀沉淀。過濾，真空干燥，得黃色固體0.23g，即5，7-二羥基-4’-(1-乙氧羰基甲氧基)黃酮(iii-1)，產(chǎn)率86％。

1.4 5，7-二羥基-4’-(1-羧基甲氧基)黃酮(I-1)的制備

在250mL圓底燒瓶中加入50mL甲醇/水(4：1)混合溶劑，加入0.2g(0.61mmol)iii-1，磁力攪拌完全溶解后，加入0.84g(6.1mmol)碳酸鉀，加熱回流2小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫， 加水50mL。用2N的稀鹽酸調(diào)pH至3-4，靜置，析出黃色絮狀沉淀。過濾，真空干燥，得黃色固體0.15g，即5，7-二羥基-4’-(1-羧基甲氧基)黃酮(I-1)，產(chǎn)率75％。熔點(diǎn)：292-294℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝4.82(2H，s)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.89(1H，s)，7.10(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.88(1H，s)，12.92(1H，s)，13.15ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M+H]⁺C₁₇H₁₃O₇計(jì)算值：329.0583，測量值：329.0657.

實(shí)施例2 5，7-二羥基-4’-(3-羧基丙氧基)黃酮(I-2)的合成

參照實(shí)施例1.2，用4-溴丁酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，與化合物i反應(yīng)，得到7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(3-乙氧羰基丙氧基)黃酮(ii-2)，產(chǎn)率：43％。

參照實(shí)施例1.3，將ii-2用3N鹽酸脫去甲氧基亞甲基，得到5，7-二羥基-4’-(3-乙氧羰基丙氧基)黃酮(iii-2)，產(chǎn)率85％。

參照實(shí)施例1.4，iii-2用碳酸鉀堿水解，得到I-2的黃色固體0.18g，即5，7-二羥基-4’-(3-羧基丙氧基)黃酮，產(chǎn)率90％。熔點(diǎn)：232-233℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.95-1.99(2H，m)，2.41(2H，t)，4.10(2H，t)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.88(1H，s)，7.11(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.87(1H，s)，12.19(1H，s)，12.93ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]^-C₁₉H₁₅O₇計(jì)算值：355.0896，測量值：355.0827.

實(shí)施例3 5，7-二羥基-4，-(4-羧基丁氧基)黃酮(I-3)的合成

參照實(shí)施例1.2，用5-溴戊酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，與化合物i反應(yīng)，得到7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(4-乙氧羰基丁氧基)黃酮(ii-3)，產(chǎn)率：46％。

參照實(shí)施例1.3，將ii-3用3N鹽酸脫去甲氧基亞甲基，得到5，7-二羥基-4’-(4-乙氧羰基丁氧基)黃酮(iii-3)，產(chǎn)率95％。

參照實(shí)施例1.4，iii-3用碳酸鉀堿水解，得到I-3的黃色固體0.18g，即5，7-二羥基-4’-(4-羧基丁氧基)黃酮，產(chǎn)率90％。點(diǎn)：202-204℃， ¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.64-1.68(2H，m)，1.74-1.78(2H，m)，2.30(2H，t)，4.09(2H，t)，6.20(1H，d，J＝2.24Hz)，6.51(1H，d，J＝2.24Hz)，6.88(1H，s)，7.11(2H，d，J＝8.96Hz)，8.03(2H，d，J＝8.96Hz)，10.87(1H，s)，12.00(1H，s)，12.94ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]^-C₂₀H₁₇O₇計(jì)算值：369.1053，測量值：369.0973.

實(shí)施例4 5，7-二羥基-4’-(5-羧基戊氧基)黃酮(I-4)的合成

參照實(shí)施例1.2，用6-溴己酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，與化合物i反應(yīng)，得到7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(5-乙氧羰基戊氧基)黃酮(ii-4)，產(chǎn)率：40％。

參照實(shí)施例1.3，將ii-4用3N鹽酸脫去甲氧基亞甲基，得到5，7-二羥基-4’-(5-乙氧羰基戊氧基)黃酮(iii-4)，產(chǎn)率92％。

參照實(shí)施例1.4，iii-4用碳酸鉀堿水解，得到I-4的黃色固體0.19g，即5，7-二羥基-4’-(5-羧基戊氧基)黃酮，產(chǎn)率95％。熔點(diǎn)：211-213℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.37-1.41(2H，m)，1.51-1.55(2H，m)，1.69-1.73(2H，m)，2.20(2H，t)，4.03(2H，t)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.84(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.98(2H，d，J＝8.96Hz)，10.89(1H，s)，11.97(1H，s)，12.90ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]^-C₂₁H₁₉O₇計(jì)算值：383.1209，測量值：383.1138.

實(shí)施例5 5，7-二羥基-4，-(6-羧基己氧基)-黃酮(I-5)的合成

參照實(shí)施例1.2，用7-溴庚酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，與化合物i反應(yīng)，得到7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(6-乙氧羰基己氧基)黃酮(ii-5)，產(chǎn)率：36％。

參照實(shí)施例1.3，將ii-5用3N鹽酸脫去甲氧基亞甲基，得到5，7-二羥基-4’-(6-乙氧羰基己氧基)黃酮(iii-5)，產(chǎn)率77％。

參照實(shí)施例1.4，iii-5用碳酸鉀堿水解，得到I-5的黃色固體0.19g，即5，7-二羥基-4’-(6-羧基己氧基)黃酮，產(chǎn)率95％。熔點(diǎn)：192-193℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.29-1.35(2H，m)，1.36-1.40(2H，m)，1.46-1.50(2H，m)，1.68-1.69(2H，m)，2.18(2H，t)，4.03(2H，t)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.83(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.98(2H，d，J＝8.96Hz)，10.81(1H，s)，11.99(1H，s)，12.90ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]^-C₂₂H₂₁O₇計(jì)算值：397.1366，測量值：397.1295.

實(shí)施例6 5，7-二羥基-4’-(7-羧基庚氧基)黃酮(I-6)的合成

參照實(shí)施例1.2，用8-溴辛酸乙酯代替2-溴乙酸乙酯，與化合物i反應(yīng)，得到7-甲氧基亞甲氧基-5-羥基-4’-(7-乙氧羰基庚氧基)黃酮(ii-6)，產(chǎn)率：42％。

參照實(shí)施例1.3，將ii-6用3N鹽酸脫去甲氧基亞甲基，得到5，7-二羥基-4’-(7-乙氧羰基庚氧基)黃酮(iii-6)，產(chǎn)率84％。

參照實(shí)施例1.4，iii-6用碳酸鉀堿水解，得到I-6的黃色固體0.18g，即5，7-二羥基-4’-(7-羧基庚氧基)黃酮，產(chǎn)率90％。熔點(diǎn)：205-207℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ＝1.25-1.31(4H，m)，1.33-1.38(2H，m)，1.43-1.49(2H，m)，1.66-1.72(2H，m)，2.17(2H，t)，4.03(2H，s)，6.16(1H，d，J＝2.24Hz)，6.47(1H，d，J＝2.24Hz)，6.83(1H，s)，7.06(2H，d，J＝8.96Hz)，7.99(2H，d，J＝8.96Hz)，10.85(1H，s)，11.97(1H，s)，12.91ppm(1H，s)；HRMS-ESI(MeOH)：m/z[M-H]^-C₂₃H₂₅O₇計(jì)算值：413.1522，測量值：413.1598.

實(shí)施例7 對黃嘌呤氧化酶抑制活性的測定

在96孔酶標(biāo)板上依次加入磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4，50mM，35μl)、黃嘌呤氧化酶(溶于上述磷酸鹽緩沖液中，1U/L，30μl)以及被測樣品(溶于含1％DMSO的上述磷酸鹽緩沖液中，濃度0.02-200uM， 50μl)，37℃孵育15分鐘。隨后加入底物黃嘌呤(溶于上述磷酸鹽緩沖溶液中，150mM，60μl)引發(fā)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30分鐘。加入稀鹽酸(3N，25μl)以終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測290nm波長下各孔吸光度。根據(jù)下列公式計(jì)算被測化合物在不同濃度下對酶的抑制率，用軟件Origin 9.0計(jì)算被測化合物對酶的半數(shù)抑制濃度，亦即IC₅₀.

樣品組和空白對照組各分兩小組，該兩小組的區(qū)別在于黃嘌呤氧化酶孵育前加入酶或是終止反應(yīng)后加入酶。每組重復(fù)三次。對照組以相同體積上述磷酸鹽緩沖液替換被測樣品。

式(1)

實(shí)施例8 對α-糖苷酶抑制活性的測定

在96孔酶標(biāo)板上依次加入α-葡萄糖苷酶(溶于0.1M的pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液中，0.1U/mL，50μl)、被測樣品(溶于含0.5％吐溫-80的上述磷酸鹽緩沖液中，50μl)，37℃孵育15分鐘。隨后加入底物4-硝苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷(溶于上述磷酸鹽緩沖液中，5mM，50μl)引發(fā)反應(yīng)，37℃10分鐘。加入碳酸鈉溶液(1.5M，50μl)以終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測405nm波長下各孔吸光度。先測200uM濃度下，各化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，活性較好者進(jìn)一步測IC₅₀。同樣根據(jù)公式3-1計(jì)算被測化合物在不同濃度下對酶的抑制率，以軟件Origin 9.0計(jì)算擬合出被測化合物對酶的半數(shù)抑制濃度，亦即IC₅₀。

樣品組和空白對照組各分兩小組，該兩小組的區(qū)別在于黃嘌呤氧化酶孵育前加入酶或是終止反應(yīng)后加入酶。每組重復(fù)三次。對照組以相同體積上述磷酸鹽緩沖液替換被測樣品。

式(2)

表1化合物對黃嘌呤氧化酶及α-糖苷酶的抑制作用

^a半數(shù)抑制濃度

^b每個值是三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。