本發(fā)明涉及一種含喹唑啉類配體的Pt配合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：順鉑是臨床常使用的抗腫瘤化學(xué)藥物，是一種非特異性的細(xì)胞毒性藥物。其在抑制和殺傷異常增殖的腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)其它增殖較快的正常細(xì)胞也同樣產(chǎn)生抑制和殺傷作用，由此產(chǎn)生的毒副作用以及腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物先天或獲得性的抗藥性等問題一直是制約細(xì)胞毒性化療藥物臨床應(yīng)用的瓶頸。近十年來(lái)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異的增殖、分化和凋亡機(jī)制，高選擇性的分子靶向治療藥物得到迅速發(fā)展。但是，許多對(duì)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的蛋白激酶有很好抑制活性的小分子化合物，由于水溶性差或毒副作用大，以及易產(chǎn)生抗藥性而不能被臨床應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服腫瘤藥物順鉑存在的毒副作用大的缺陷，提供一種能夠特異性靶向腫瘤或癌癥細(xì)胞的含喹唑啉類配體的Pt配合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，具有很好的受體EGFR靶向性，該含喹唑啉類配體的Pt配合物能夠靶向性地作用于受體EGFR高表達(dá)的腫瘤或癌癥細(xì)胞，從而降低Pt配合物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。并且， 特別令人感到驚喜的是，本發(fā)明提供的含喹唑啉類配體的Pt配合物除了具有較好的EGFR受體靶向性以外，還具有很高的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性，例如式(3-1)和式(3-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物，表現(xiàn)出的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性與順鉑的一樣甚至還要高，具有很好的藥用價(jià)值和市場(chǎng)前景。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含喹唑啉類配體的Pt配合物，該P(yáng)t配合物由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示，其中，XYZ是由下式(1a)或(1b)提供的三齒配位基：C是由下式(2)提供的單齒配位基；其中，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各自獨(dú)立地選自氫、C1-C3的烷基、羥基或鹵素；B-為Cl-、PF6-、[B(C6H5)4]-(四苯硼酸根)或BF4-；n為1-4的整數(shù)。本發(fā)明還提供了一種含喹唑啉類配體的Pt配合物的制備方法，該方法包括：(1)將式(1a)或(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物與K2PtCl4進(jìn)行第一配位反應(yīng)，得到通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體，(2)將通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體與式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行第二配位反應(yīng)，得到通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，其中，XYZ是由上式(1a)或(1b)提供的三齒配位基：C是由上式(2)提供的單齒配位基；R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各自獨(dú)立地選自氫、C1-C3的烷基、羥基或鹵素；n為1-4的整數(shù)。本發(fā)明還提供了上述含喹唑啉類配體的Pt配合物或者上述制備方法所制得的含喹唑啉類配體的Pt配合物在制備作為EGFR抑制劑的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述含喹唑啉類配體的Pt配合物或者上述制備方法所制得的含喹唑啉類配體的Pt配合物在制備腫瘤或癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，具有很好的受體EGFR靶向性，該含喹唑啉類配體的Pt配合物能夠靶向性地作用于受體EGFR高表達(dá)的腫瘤或癌癥細(xì)胞，從而降低Pt配合物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。同時(shí)，本發(fā)明所提供的由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示的含 喹唑啉類配體的Pt配合物還具有優(yōu)良的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。附圖說明附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：圖1為測(cè)試?yán)?中吉非替尼在外加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖2為測(cè)試?yán)?中順鉑在外加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖3為測(cè)試?yán)?中順鉑和吉非替尼的等濃度混合物在外加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖4為測(cè)試?yán)?中式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物在外加EGF下的數(shù)據(jù)流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖5為測(cè)試?yán)?中吉非替尼在不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖6為測(cè)試?yán)?中順鉑在不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖7為測(cè)試?yán)?中順鉑和吉非替尼的等濃度混合物在不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖8為測(cè)試?yán)?中式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物在不加EGF下的數(shù)據(jù)流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果圖。圖9為測(cè)試?yán)?中吉非替尼的激光共聚焦熒光成像圖。圖10為測(cè)試?yán)?中順鉑的激光共聚焦熒光成像圖。圖11為測(cè)試?yán)?中順鉑和吉非替尼的等濃度混合物的激光共聚焦熒光成像圖。圖12為測(cè)試?yán)?中式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物的激光共聚焦熒光成像圖。具體實(shí)施方式以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。在本發(fā)明中，如等類似的結(jié)構(gòu)上的取代基R可以在環(huán)上的任意位點(diǎn)進(jìn)行取代，還可以在環(huán)上的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行取代，且在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行取代時(shí)，各個(gè)位點(diǎn)的取代基R可以相同或者不同。在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在原子上延伸而出的虛線，例如下式(1a)中，N上和苯環(huán)上延伸而出的虛線，表示的是金屬Pt的配位點(diǎn)，以式(1a)為例，表示金屬Pt與式(1a)配位時(shí)，將與虛線一端的氮原子和苯環(huán)進(jìn)行配位。本發(fā)明提供一種含喹唑啉類配體的Pt配合物，該P(yáng)t配合物由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示，其中，XYZ是由下式(1a)或(1b)提供的三齒配位基：C是由下式(2)提供的單齒配位基；其中，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各自獨(dú)立地選自氫、C1-C3的烷基、羥基或鹵素；B-為Cl-、PF6-、[B(C6H5)4]-或BF4-；n為1-4的整數(shù)。其中，C1-C3的烷基為甲基、乙基、丙基或異丙基；鹵素可以為氟、氯、溴、碘等。優(yōu)選地，環(huán)上的R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'為單取代的。更優(yōu)選地，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基、丙基或異丙基。最優(yōu)選地，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'為氫。在本發(fā)明中，n為1、2、3或4，優(yōu)選地，n為2、3或4。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各自獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基、丙基或異丙基，B-為PF6-，n為2、3或4。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'為氫，B-為PF6-，n為2、3或4。當(dāng)R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'為氫時(shí)，所表示的化合物如下式所示：以式(2-1)表示n為2時(shí)的上述式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物；以式(2-2)表示n為3時(shí)的上述式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物；以式(2-3)表示n為4時(shí)的上述式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物。更優(yōu)選地，所述通式[Pt(XYZ)C]+B-為下式中的一種：特別是從獲得高EGFR受體靶向性和高腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性上考慮，所述含喹唑啉類配體的Pt配合物最為優(yōu)選為上述式(3-1)～式(3-3)所示的配合物。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述含喹唑啉類配體的Pt配 合物為式(3-1)～式(3-2)所示的配合物，這樣可以獲得與順鉑差不多的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性，甚至獲得比順鉑還要好的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性。本發(fā)明提供了一種含喹唑啉類配體的Pt配合物的制備方法，該方法包括：(1)將式(1a)或(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物與K2PtCl4進(jìn)行第一配位反應(yīng)，得到通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體，(2)將通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體與式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行第二配位反應(yīng)，得到通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，其中，XYZ是由上式(1a)或(1b)提供的三齒配位基：C是由上式(2)提供的單齒配位基；R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'各自獨(dú)立地選自氫、C1-C3的烷基、羥基或鹵素；n為1-4的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，式(1a)和(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物可以采用市售品，也可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法優(yōu)化后合成得到，合成獲得時(shí)，例如可以采用參 考文獻(xiàn)(1)Constable,E.C.；Lewis,J.；Liptrot,M.C.；Raithby,P.R.InorganicaChimicaActa1990,178,47；(2)Kui,S.C.F.；Sham,I.H.T.；Cheung,C.C.C.；Ma,C.W.；Yan,B.P.；Zhu,N.Y.；Che,C.M.；Fu,W.F.Chemistry-aEuropeanJournal,2007,13,417.中記載的方法。以式(1a-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備為例來(lái)說明式(1a)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，式(1a-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法優(yōu)選采用下述反應(yīng)路線進(jìn)行：以式(1b-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備為例來(lái)說明式(1a)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，式(1b-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法優(yōu)選采用下述反應(yīng)路線進(jìn)行：其中C5H5N表示的是吡啶；(HCHO)m表示多聚甲醛，m例如可以為3以上的整數(shù)，reflux表示回流。根據(jù)本發(fā)明，式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行制備，例如CN102452988A中所記載的方法。優(yōu)選地，式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法采用下述反應(yīng)路線進(jìn)行：根據(jù)本發(fā)明，所述含喹唑啉類配體的Pt配合物的制備方法的步驟(1) 將使得式(1a)或(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物與Pt進(jìn)行配位，以得到通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體。上述式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體為下述式中的一種：其中，當(dāng)R1、R2、R3、R1'、R2'和R3'為氫時(shí)，式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體為下式中的一種：其中，優(yōu)選地，式(1a)或(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物與K2PtCl4的摩爾用量比為1：0.8-1.3。所述第一配位反應(yīng)可以采用Pt配位反應(yīng)中常規(guī)采用的溶劑，例如為乙腈、水和冰醋酸中的一種或多種，優(yōu)選采用的溶劑為冰醋酸或乙腈和水的混合液(體積比為2-1:1)。對(duì)所述式(1a)或(1b)所示結(jié)構(gòu)的化合物在溶劑中的濃度并沒有特別的限定，只要可以得到所述Pt配合前 體即可，例如可以為0.01-0.02mmol/mL。優(yōu)選情況下，所述第一配位反應(yīng)的條件包括：溫度為80-130℃(更優(yōu)選為90-130℃)，時(shí)間為20-48h(更優(yōu)選為24-48h)。根據(jù)本發(fā)明，所述含喹唑啉類配體的Pt配合物的制備方法的步驟(2)將使得通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體與式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行配位，即可得到本發(fā)明所需要的通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物。其中，在步驟(2)中，本發(fā)明對(duì)所述Pt配合前體與式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物的摩爾用量比沒有特別的限定，只要能夠獲得上述通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物即可，例如所述Pt配合前體與式(2)所示結(jié)構(gòu)的化合物的摩爾用量比為1：0.8-1.3。所述第二配位反應(yīng)可以采用的溶劑例如為甲醇。對(duì)所述Pt配合前體在該溶劑中的濃度并沒有特別的限定，只要可以得到所述通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物即可，例如可以為0.001-0.002mmol/mL(更優(yōu)選為0.0015-0.002mmol/mL)。優(yōu)選情況下，所述第二配位反應(yīng)的條件包括：溫度為70-90℃(更優(yōu)選為75-80℃)，時(shí)間為3-6h(更優(yōu)選為4-6h)。根據(jù)本發(fā)明，為了獲得通式[Pt(XYZ)C]+PF6-、[Pt(XYZ)C]+[B(C6H5)4]-或[Pt(XYZ)C]+BF4-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，優(yōu)選地，該方法還包括在步驟(2)所述第二配位反應(yīng)后，在所述第二配位反應(yīng)的產(chǎn)物中加入含PF6-、[B(C6H5)4]-或BF4-的鹽進(jìn)行接觸反應(yīng)。所述含PF6-、[B(C6H5)4]-或BF4-的鹽的摩爾用量與通式Pt(XYZ)Cl表示的Pt配合前體的摩爾用量比優(yōu)選為3-6：1(更優(yōu)選為4-6:1)。這樣的接觸反應(yīng)可以是向上述第二配位反應(yīng)的反應(yīng)體系中直接加入含PF6-、[B(C6H5)4]-或BF4-的鹽，而不需要將通式[Pt(XYZ)C]+Cl-表示的含喹唑 啉類配體的Pt配合物提取出來(lái)，這樣可以節(jié)約步驟和成本。優(yōu)選地，所述接觸反應(yīng)的條件包括：溫度為20-30℃，時(shí)間為20-40min。所述含PF6-、[B(C6H5)4]-或BF4-的鹽例如可以為六氟磷酸銨、六氟磷酸鈉、六氟磷酸鉀、四苯硼酸銨、四苯硼酸鈉、四苯硼酸鉀、四氟硼酸銨、四氟硼酸鈉和四氟硼酸鉀中的一種或多種，優(yōu)選為六氟磷酸銨。為了獲得更為純的產(chǎn)物，本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物的制備方法還可以包括采用乙腈對(duì)所得Pt配合物進(jìn)行重結(jié)晶。本發(fā)明還提供了上述含喹唑啉類配體的Pt配合物或者上述制備方法所制得的含喹唑啉類配體的Pt配合物在制備作為EGFR抑制劑的藥物中的應(yīng)用。特別是上述式(3-1)～式(3-4)所示的配合物可以作為較好的EGFR抑制劑。本發(fā)明還提供了上述含喹唑啉類配體的Pt配合物或者上述制備方法所制得的含喹唑啉類配體的Pt配合物在制備腫瘤或癌癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)上述腫瘤或癌癥的類型并沒有特別的限定，通常能夠采用順鉑的地方，就可以采用本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物，但是本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物特別適用于EGFR受體含量較高的一些腫瘤或者癌癥細(xì)胞。優(yōu)選地，所述腫瘤或癌癥為肺癌、宮頸癌、表皮鱗癌、乳腺癌或前列腺癌。本發(fā)明所提供的由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物，具有很好的受體EGFR靶向性，能夠使得所述含喹唑啉類配體的Pt配合物靶向性地作用于受體EGFR高表達(dá)的腫瘤或癌癥細(xì)胞，從而降低Pt配合物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。同時(shí)，本發(fā)明所提供的由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示的含喹唑啉類配體的Pt配合物還具有優(yōu)良的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性。特別令人意外的是，本發(fā)明所提供的某些由通式[Pt(XYZ)C]+B-表示 的含喹唑啉類配體的Pt配合物，例如式(3-1)、式(3-2)所示結(jié)構(gòu)的配合物能夠達(dá)到與順鉑差不多的腫瘤或癌癥細(xì)胞的增殖抑制活性，甚至比順鉑的活性還要高，表現(xiàn)出非常優(yōu)越的藥用價(jià)值。以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。制備例1本制備例用于說明式(1a-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備。將苯乙酮(3mL,25.5mmol)、苯甲醛(2.6mL,25.5mmol)和氫氧化鈉(1.2g,30mmol)加入到50mL的水中室溫(約25℃)下攪拌反應(yīng)12h。向反應(yīng)混合物中加入2-乙酰基吡啶(3mL,26.7mmol)和氫氧化鈉(9g,225mmol)，在80℃下繼續(xù)反應(yīng)12h。反應(yīng)停止后冷卻，置于-20℃過夜后倒出黃色油狀物，向殘留物中加入200mL乙醇和醋酸銨(18g，233.5mmol)，在80℃下回流8h后所得反應(yīng)液為橘紅色澄清溶液。真空旋蒸除去乙醇，反應(yīng)粗產(chǎn)物用硅膠柱層析分離(乙酸乙酯：石油醚體積比＝1:30)得到2.8g白色固體(產(chǎn)率：36％)，即為式(1a-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.160-164℃。ESI-MS(m/z):309.2([M+H]+,C22H17N2requires309.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):8.75(d,J＝4.4Hz,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,2H),8.37(d,J＝7.2Hz,2H),8.30(d,J＝1.2Hz,1H),8.05-7.98(m,3H),7.61-7.49(m,7H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):157.0,156.2,155.7,150.0,149.8,139.0,138.1,137.8,130.0,129.8,129.7,129.6,129.3,129.2,127.7,127.6,127.5,127.4,124.9,121.3,118.5,117.0.元素分析:calculatedforC22H16N2:C,85.69；H,5.23；N,9.08；Found:C,85.69；H,5.20；N,8.88.制備例2本制備例用于說明式(1b-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備。(1)在氬氣保護(hù)下，將碘單質(zhì)(8.4g,33.1mmol)溶于50mL吡啶中，將其滴加至12.6mL的2-乙?；拎ぶ?約30min加完)，然后在80℃下反應(yīng)4h。冷卻過濾，濾餅用冷的吡啶洗滌，乙醇重結(jié)晶得到黃綠色的(2-吡啶基)吡啶碘鹽固體7g(產(chǎn)率65％)。ESI-MS(m/z):199.0(M+,[C12H11N2O]+,requires199.1).(2)將2-乙?；?6g,35.3mmol)、二甲胺鹽酸鹽(3.0g,36.8mmol)、多聚甲醛(1.0g，11.1mmol，購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，AR)和1mL濃鹽酸(濃度約36-38體積％)加到30mL乙醇中，并在90℃下回流反應(yīng)5h。旋蒸除去乙醇，硅膠柱層析分離(二氯甲烷：甲醇體積比＝50:1)得到白色固體產(chǎn)物8.1g(產(chǎn)率：87％)，即3-二甲基胺-1-(2'-萘基)-丙酮鹽酸鹽。ESI-MS:m/z：228.1(M+,[C15H18NO]+requires228.1).(3)將步驟(1)所得的(2-吡啶基)吡啶碘鹽(1.8g,5.5mmol)、步驟(2)所得的3-二甲基胺-1-(2'-萘基)-丙酮鹽酸鹽(1.4g,5.3mmol)和過量的醋酸銨(10.2g,132.3mmol)加入到150mL的甲醇中，在80℃下回流12h。冷卻過濾，濾餅用水和冷的甲醇洗滌，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯：石油醚體積比＝1:20)得到白色固體0.4g(產(chǎn)率28％)，即式(1b-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.115-119℃.ESI-MS(m/z):283.2([M+H]+,C20H15N2requires283.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):8.80(s,1H),8.74(d,J＝4.0Hz,1H),8.68(d,J＝8.0Hz,1H),8.44(dd,J1＝J2＝1.6Hz,1H),8.39(d,J＝8.0 Hz,1H),8.22(d,J＝7.6Hz,1H),8.11-7.98(m,2H),7.52-7.49(m,1H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):155.8,155.8,155.6,149.8,138.9,137.8,136.3,133.8,133.6,129.2,128.8,128.1,127.3,127.0,126.5,124.9,124.8,121.3,121.2,119.7.元素分析:calculatedforC20H14N2:C,85.08；H,5.00；N,9.92；Found:C,85.19；H,5.14；N,9.75.制備例3本制備例用于說明式(2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備。(1)將4-(3'-氯-4'-氟苯氨基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉(6g,18.8mmol)、無(wú)水碳酸鉀(12g,86.8mmol)和1,2-二溴乙烷(6mL,69.3mmol)加入到250mL的DMF中，在80℃下攪拌反應(yīng)8h。然后冷卻到室溫(約25℃)，過濾，收集濾液，真空旋蒸除去溶劑，殘余物用乙醇重結(jié)晶，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯：石油醚體積比＝5:2)得到白色固體3.6g(產(chǎn)率45％)。(2)然后將咪唑(266mg,3.9mmol)、4-叔丁基溴化銨(TBAB)(31mg,0.1mmol)和NaOH(468mg,11.7mmol)加入到50mL乙腈中，并加熱到90℃回流1h，然后加入步驟(1)所制得的白色固體(1g,2.34mmol)并繼續(xù)在90℃回流5h。冷卻到室溫(約25℃)，過濾，收集濾液，旋蒸得到黃色油狀物。向其中加入40mL的水和40mL的乙酸乙酯，超聲，靜置1h。在兩層之間出現(xiàn)淡黃色固體。過濾，濾餅分別用水和乙酸乙酯洗滌，真空干燥，得到式(2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物：淡黃色粉末(0.6g，收率62％)。m.p.259-261℃.ESI-MS(m/z):414.2([M+H]+,C20H18ClFN5O2requires414.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.53(s,1H),8.47(s,1H),8.06(dd,J1＝4.0Hz,J2＝2.4Hz,1H),7.77(s,1H),7.74-7.71(m, 2H),7.41(t,J1＝J2＝9.2Hz,1H),7.29(s,1H),7.19(s,1H),6.91(s,1H),4.48(t,J1＝J2＝5.2Hz,2H),4.38(t,J1＝4.8Hz,J2＝5.6Hz,2H),3.93(s,3H).元素分析:calculatedforC20H17ClFN5O2:C,58.05；H,4.14；N,16.9；Found:C,58.04；H,4.20；N,16.32.制備例4本制備例用于說明式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備。(1)將4-(3'-氯-4'-氟苯氨基)-6-羥基-7-甲氧基喹唑啉(6g,18.8mmol)和無(wú)水碳酸鉀(12g,86.8mmol)加入到300mL的丙酮中，在72℃下回流0.5h。然后加入1,3-二溴丙烷(7.6mL,74.6mmol)繼續(xù)在72℃下回流10h。冷卻至室溫(約25℃)，減壓過濾，收集濾液，真空旋蒸除去丙酮，殘留物用乙醇重結(jié)晶，硅膠柱層析分離(乙酸乙酯：石油醚體積比＝5:2)得到白色固體3g(產(chǎn)率36％)。(2)然后將咪唑(258mg,3.8mmol)、4-叔丁基溴化銨(TBAB)(30mg,0.1mmol)和NaOH(454mg,11.3mmol)加入到50mL乙腈中，加熱到90℃回流1h，然后加入步驟(1)所制得的白色固體(1.0g,2.27mmol)并繼續(xù)在90℃回流5h。冷卻到室溫(約25℃)，過濾，收集濾液，旋蒸得到黃色油狀物。向其中加入40mL的水和40mL的乙酸乙酯，超聲，靜置1h。在兩層之間會(huì)出現(xiàn)淡黃色固體。過濾，濾餅分別用水和乙酸乙酯洗滌，真空干燥得到式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物：淡黃色粉末(0.7g，收率72％)。m.p.201-203℃.ESI-MS(m/z):428.2([M+H]+,C21H20ClFN5O2requires428.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.51(s,1H),8.50(s,1H),8.10(dd,J1＝2.4Hz,J2＝2.8Hz,1H),7.79-7.75(m,2H),7.64(s,1H),7.43 (t,J1＝J2＝9.2Hz,1H),7.22(s,2H),6.91(s,1H),4.20(t,J1＝J2＝6.8Hz,2H),4.08(t,J1＝J2＝6.0Hz,2H),3.97(s,3H),2.33-2.27(m,2H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):156.5,155.0,153.2,148.5,147.6,137.8,129.1,123.9,122.7,119.8,119.3,119.2,117.0,116.8,109.2,107.9,103.5,66.2,56.4,43.4,30.6.元素分析:calculatedforC21H19ClFN5O2·H2O:C,56.57；H,4.75；N,15.71；Found:C,56.51；H,4.61；N,15.46.實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物及其制備方法。(1)將式(1a-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物(75mg,0.24mmol)和K2PtCl4(100mg,0.24mmol)加入到乙腈和水的混合物中(15ml體積比1:1)，在90℃下回流24h。冷卻過濾，濾餅用乙腈和水的混合物洗滌，二氯甲烷重結(jié)晶得到橘紅色晶體(81mg，收率為62％)，即式(5-1-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.356-360℃.ESI-MS(m/z):502.3([M-Cl]+,C22H15N2Ptrequires502.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):8.87(d,J＝4.4Hz,1H),8.71(d,J＝8.0Hz,1H),8.47(d,J＝0.4Hz,1H),8.34(t,J1＝0.8Hz,J2＝J3＝1.2Hz,1H),8.29(s,1H),8.11-8.09(m,2H),7.88(t,J1＝6.0Hz,J2＝6.8Hz,1H),7.78(d,J＝6.8Hz,1H),7.60-7.59(m,3H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.14-7.05(m,2H).元素分析:calculatedforC22H15ClN2Pt·H2O:C,47.53；H,3.08；N,5.04；Found:C,47.66；H,2.80；N,5.33.(2)將式(2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物(0.11mmol)和步驟(1)所得的式(5-1-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物(0.1mmol)加入并溶于60mL甲醇中，在80℃下回流直到溶液變澄清(約4h)。冷卻，用0.22μm濾頭過濾，向所得濾液中加入0.4mmol六氟磷酸銨，室溫(約25℃)攪拌30min。過濾，濾餅用甲醇洗滌，乙腈重結(jié)晶，真空干燥得到黃色固體(94mg，收率為89％)，即為式(3-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.192-196℃.ESI-MS(m/z):916.3(M+,C42H32ClFN7O2Ptrequires916.2).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.46(s,1H),8.77(s,2H),8.54(s,1H),8.47(s,1H),8.35(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H),8.10(d,J＝8.0Hz,2H),8.07(d,J＝4.0Hz,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,2H),7.78-7.76(m,2H),7.61(m,4H),7.47(s,1H),7.33(t,J1＝12.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),7.21(s,1H),7.10(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),6.96(t,J1＝8.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),6.51(d,J＝8.0Hz,1H),4.77(s,2H),4.64(s,2H),3.85(s,3H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):165.7,162.8,157.0,156.4,155.3,154.9,153.4,152.8,152.3,148.9,147.9,147.7,141.4,141.1,141.0,137.2,137.2,136.2,133.0,131.2,131.0,129.6,128.8,128.2,126.4,125.2,123.4,123.2,122.3,122.2,119.3,119.1,117.7,117.2,117.0,116.8,109.1,108.2,104.1,68.2,56.5,48.0.元素分析:calculatedforC42H32ClF7N7O2PPt·H2O:C,46.74；H,3.18；N,9.08；Found:C,46.45；H,3.54；N,8.83.實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物及其制備方法。根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，所不同的是，步驟(2)中采用的是式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物(0.11mmol)代替式(2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到黃色固體(56mg，收率為52％)，即為式(3-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.186-189℃.ESI-MS(m/z):929.2(M+,C43H34ClFN7O2Ptrequires929.2).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.46(s,1H),8.72(d,J＝4.0Hz,1H),8.69(s,1H),8.53(s,1H),8.48(s,1H),8.30-8.27(m,2H),8.09-8.05(m,4H),7.84(d,J＝4.0Hz,3H),7.61(s,1H),7.51(s,1H),7.40-7.36(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.17(s,1H),7.01(d,J＝4.0Hz,1H),6.94(d,J＝4.0Hz,1H),6.49(d,J＝8.0Hz,1H),4.47(s,2H),4.19(s,2H),3.91(s,3H),2.52-2.49(m,2H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):165.7,162.8,156.8,156.4,155.2,155.0,153.2,152.6,148.4,147.8,147.6,141.2,141.1,140.7,137.2, 137.1,136.1,133.0,131.2,131.0,130.0,129.5,128.8,128.1,126.3,125.1,125.0,123.6,122.5,122.4,119.3,119.1,117.6,117.1,117.0,116.8,109.2,108.0,104.1,66.7,56.4,45.6,29.7.元素分析:calculatedforC43H34ClF7N7O2PPt·H2O:C,47.24；H,3.32；N,8.83；Found:C,46.99；H,3.33；N,8.58.實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物及其制備方法。根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，所不同的是步驟(1)的制備過程如下：將K2PtCl4(100mg,0.24mmol)和式(1b-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物(68mg,0.24mmol)加入到35mL冰醋酸中，在130℃下回流24h至K2PtCl4基本溶解，反應(yīng)液由無(wú)色溶液變?yōu)殚冱S色渾濁。冷卻過濾，濾餅依次用水和丙酮洗滌，二氯甲烷重結(jié)晶得到黃色晶體(89mg,72％yield)，即式(5-2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.358-362℃.ESI-MS(m/z):476.5([M-Cl]+,C20H13N2Ptrequires476.1).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):8.96(d,J＝4.0Hz,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.33(t,J1＝J3＝1.2Hz,J2＝0.8Hz,1H),8.23-8.15(m,4H),7.91(t,J1＝J2＝6.4Hz,1H),7.81(t,J1＝7.2Hz,J2＝8.4Hz,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.44(t,J1＝6.8Hz,J2＝7.2Hz,1H),7.37(t,J1＝7.6Hz,J2＝6.8Hz,1H).元素分析:calculatedforC20H13ClN2Pt:C,46.93；H,2.56；N,5.47；Found:C,46.68；H,2.52；N,5.45.步驟(2)則是采用步驟(1)所得的式(5-2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物代替式(5-1-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到黃色固體(82mg，收率為79％)，即為式(3-3)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.190-194℃.ESI-MS(m/z):889.3(M+,C40H30ClFN7O2Ptrequires889.2).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.50(s,1H),8.83(s,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.47(s,1H),8.37-8.32(m,1H),8.28(s,1H),8.24 -8.21(t,J1＝8.0Hz,J2＝4.0Hz,2H),8.07(d,J＝4.0Hz,1H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.92(s,1H),7.86(s,1H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),7.64(t,J1＝J2＝8.0Hz,1H),7.57(s,1H),7.37-7.30(m,2H),7.23(t,J1＝J2＝8.0Hz,2H),7.16(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),4.83(s,2H),4.68(s,2H),3.77(s,3H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):164.3,162.8,156.6,156.4,154.9,254.4,253.4,148.7,148.0,147.7,146.8,141.1,137.1,137.1,135.0,134.7,131.4,129.6,129.2,128.8,127.8,127.0,126.0,125.5,124.8,123.4,123.3,122.3,122.2,121.0,119.3,119.1,117.0,116.8,109.1,108.2,104.0,68.4,56.4,48.0.元素分析:calculatedforC40H30ClF7N7O2PPt:C,46.41；H,2.92；N,9.47；Found:C,46.44；H,3.32；N,9.58.實(shí)施例4根據(jù)實(shí)施例3所述的方法，所不同的是，步驟(2)中采用的是式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物(0.11mmol)代替式(2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到黃色固體(79mg，收率為72％)，即為式(3-4)所示結(jié)構(gòu)的化合物。m.p.184-187℃.ESI-MS(m/z):904.2(M+,C41H32ClFN7O2Ptrequires904.2).1HNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δH(ppm):9.41(s,1H),8.79(s,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.46(s,1H),8.27-8.25(m,3H),8.22-8.20(d,J＝8.0Hz,1H),8.09(d,J＝4.0Hz,1H),8.02(dd,J1＝J2＝4.0Hz,1H),7.89(d,J＝12.0Hz,2H),7.75-7.72(m,2H),7.67(t,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,1H),7.60(s,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.32-7.29(m,2H),7.18-7.13(m,2H),6.80(s,1H),4.53(t,J1＝J2＝4.0Hz,2H),4.23(t,J1＝J2＝4.0Hz,2H),3.88(s,3H),2.56-2.53(m,2H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6,Me4Si)δC(ppm):164.3,162.8,156.5,156.3,155.0,154.3,153.2,148.8,148.4,147.6,146.7,141.0,140.8,137.1,137.1,135.1,134.7,131.4,130.0,129.2,128.6,127.8,127.0,125.4,124.7,123.5,122.6,122.4,122.3,121.0,119.3,119.1,117.0,116.7,109.2,108.0,104.1,66.7,56.3,45.6,29.7.元素分析:calculatedforC41H32ClF7N7O2PPt:C,46.93；H,3.07；N, 9.34；Found:C,46.78；H,3.30；N,9.53.測(cè)試?yán)?：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EnzymeImmunosorbentAssay,ELISA)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EnzymeImmunosorbentAssay,ELISA)分別測(cè)定式(3-1)-式(3-4)、式(2-1)、式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物和Gefitinib(吉非替尼)的激酶抑制活性(濃度分別為40μM(微摩爾/升)、4μM、400nM(納摩爾/升)、40nM、4nM、400pM(皮摩爾/升)、40pM、4pM)。使用CST公司的蛋白激酶檢測(cè)試劑盒：PTP1B(Tyr66)BiotinylatedPeptide作為激酶EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)的底物。分別加入由式(3-1)～式(3-4)、式(2-1)、式(2-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物和Gefitinib(吉非替尼)，使用SpectramaxM5(USA,MolecularDevices)型酶標(biāo)儀，采用分光光度法，測(cè)定特定波長(zhǎng)450nm處的光吸收OD值，根據(jù)下式計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)率，通過OriginPro8.0數(shù)據(jù)處理軟件由上述抑制生長(zhǎng)率的數(shù)值得到δ曲線，考察本發(fā)明所合成的化合物的激酶抑制劑對(duì)激酶底物的磷酸化反應(yīng)的抑制程度，從而得到IC50值(即對(duì)激酶底物的磷酸化抑制程度達(dá)到50％時(shí)的激酶抑制劑的濃度值)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)的平均值，變動(dòng)一般為±15％。各化合物的物化性質(zhì)和酶活性抑制測(cè)試結(jié)果IC50值如下表1所示。表1化合物3-13-23-33-42-12-2GefitinibIC50(nM)103.386.2101.885.457.469.694.0注：在ATP的濃度為200μM下測(cè)定的IC50值(n＝3)；在臨床上目前使用的分子靶向抗癌藥物Gefitinib(吉非替尼)，在ATP濃度為5μM測(cè)試條件下，體外EGFR抑制活性IC50為33nM(參見文獻(xiàn)A.E.Wakeling,S.P.Guy,J.R.Woodburn,S.E.Ashton,B.J.Curry,A.J.Barkerand K.H.Gibson,CancerRes.,2002,62,5749-5754.)；在本發(fā)明中，以吉非替尼做陽(yáng)性對(duì)照，在ATP濃度為200μM的條件下，測(cè)試了目標(biāo)化合物的對(duì)EGFR抑制活性。從表1測(cè)試結(jié)果中，可以看出目標(biāo)化合物IC50均具有很強(qiáng)的EGFR抑制活性，與吉非替尼的活性相當(dāng)甚至更強(qiáng)?；钚宰詈玫氖?2-1)所示的化合物其IC50為57.4nM。式(3-1)-式(3-4)所示結(jié)構(gòu)的含鉑配合物與相應(yīng)的配體式(2-1)和式(2-2)相比，可以看出鉑及其引入其他配位基團(tuán)對(duì)喹唑啉類的配體的EGFR抑制活性影響較小。當(dāng)結(jié)構(gòu)中連接喹唑啉類的配體和鉑基之間的連接碳鏈較長(zhǎng)時(shí)，化合物的EGFR抑制活性相對(duì)較高。測(cè)試?yán)?：對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)1、外加EGF條件下細(xì)胞增殖抑制活性實(shí)驗(yàn)分別將細(xì)胞株A549(人肺腺癌細(xì)胞株)、HeLa(人子宮頸癌細(xì)胞株)、A431(人皮膚鱗癌細(xì)胞株)和MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞株株)培養(yǎng)于含10體積％fetalbovineserum(FBS,Hyclone,USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA)中。2-3天后收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板(A549：2000細(xì)胞/孔/100μL；HeLa：4000細(xì)胞/孔/100μL；A431：8000細(xì)胞/孔/100μL；MCF-7：4000細(xì)胞/孔/100μL；HEK293：4000細(xì)胞/孔/100μL，含100ng/mLEGF的DMEM)培養(yǎng)24h，然后分別加入梯度濃度的化合物(200、100、50、25、12.5、6.25、1μM/L)。相同體積的含有100ng/mLEGF的1體積％二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)的DMEM設(shè)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；空白組為只有培養(yǎng)液但不加細(xì)胞。各濃度組分別設(shè)4個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。結(jié)果如表2(+EGF列)所示。2、無(wú)外加EGF條件下的細(xì)胞增值抑制活性實(shí)驗(yàn)分別將細(xì)胞株A549、HeLa、A431和MCF-7培養(yǎng)于含10體積％fetalbovineserum(FBS,Hyclone,USA)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA)，上述細(xì) 胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3-5天后用于實(shí)驗(yàn)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板(A549：2000細(xì)胞/孔/100μL；HeLa：4000細(xì)胞/孔/100μL；A431：8000細(xì)胞/孔/100μL；MCF-7：4000細(xì)胞/孔/100μL；HEK293：4000細(xì)胞/孔/100μL)培養(yǎng)24h，相同體積的含1體積％二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)的DMEM設(shè)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；結(jié)果如表2(-EGF列)所示。其中，MTT法檢測(cè)化合物細(xì)胞增值抑制活性實(shí)驗(yàn)：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸浮液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞個(gè)數(shù)：A549：2×104個(gè)/mL；HeLa：4×104個(gè)/mL；A431：8×104個(gè)/mL；MCF-7：4×104個(gè)/mL；HEK293：4×104個(gè)/mL)，每孔100μL，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，分別加入梯度濃度的待測(cè)化合物(200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、1μM、0.1μM、0.01μM)，每孔200μL。所測(cè)的化合物如表2中所示，其中，還測(cè)試了吉非替尼(Gefitinib)和順鉑(Cisplatin)混合物(摩爾比為1:1)對(duì)MCF-7的抑制數(shù)據(jù)。除了順鉑外，其他所有化合物的每個(gè)濃度都含有1％DMSO。相同體積的含有1％DMSO的培養(yǎng)基或含有100ng/mLEGF的1％DMSO的培養(yǎng)基設(shè)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，只有培養(yǎng)液但不加細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組，每個(gè)濃度做四組平行實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸棄含藥物的培養(yǎng)基，用200μL/孔的PBS(除了HEK293細(xì)胞)洗一遍，每孔加入100μL含0.5mg/mLMTT的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。在顯微鏡下觀察細(xì)胞板底部有晶體生成)，吸棄含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入100μL的DMSO。將細(xì)胞培養(yǎng)板移至酶標(biāo)儀，振蕩后在570nm測(cè)吸光度值。生長(zhǎng)抑制率(IR)計(jì)算公式如下所示：IR％＝[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100％。并采用Origin8.0軟件用抑制率和濃度做曲線擬合計(jì)算化合物的IC50值。表2注：a.表示未測(cè)定.在表2中，EGFR在A549、HeLa、A431和MCF-7細(xì)胞中都是過表達(dá)的，式(3-1)-式(3-3)所示結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)四種細(xì)胞增殖的抑制活性是非常好的，均高于它們不含EGFR抑制單元的前體化合物即式(5-1-1)、式(5-2-1)所示結(jié)構(gòu)的化合物，這說明金屬鉑與EGFR抑制單元配位能夠增加它們對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。特別值得說明的是式(3-1)和式(3-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物的活性甚至比順鉑的要高。其中，在沒有EGF存在時(shí)，本發(fā)明的式(3-1)和式(3-2)所示結(jié)構(gòu)的化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性是順鉑的約2倍以上，在有EGF的存在下，它對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制活性是順鉑和吉非替尼等濃度混合后活性的約6倍以上，這也說明本發(fā)明 的這種多靶點(diǎn)的組合分子優(yōu)于單靶點(diǎn)的兩個(gè)分子的物理混合。推測(cè)其理由為，本發(fā)明所得到的含喹唑啉類配體的Pt配合物除了能夠通過阻斷EGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)外，還可以通過其他的途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如通過作用于DNA，干擾DNA的合成以及復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等。測(cè)試?yán)?：對(duì)正常細(xì)胞的毒性試驗(yàn)1、外加EGF條件下細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)試?yán)?的方法，所不同的是，采用的細(xì)胞株為HEK293(正常的人胚腎細(xì)胞293)，結(jié)果如表3(+EGF列)所示。2、無(wú)外加EGF條件下的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)測(cè)試?yán)?的方法，所不同的是，采用的細(xì)胞株為HEK293(正常的人胚腎細(xì)胞293)，結(jié)果如表3(+EGF列)所示。表3通過表2和3的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性是對(duì)正常細(xì)胞HEK293的四倍甚至更多，這也進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物能夠通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的高選擇性，來(lái)降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性。測(cè)試?yán)?：細(xì)胞凋亡活性測(cè)試(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)將式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物在DMSO中溶解至濃度為4mM，用0.22μm有機(jī)系濾頭過濾，備用。在6孔板中，接種1毫升/孔含100ng/mLEGF(或者不加EGF)的MCF-7細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，在37℃ 培養(yǎng)24h。然后加入濃度為20μM(DMSO的含量為0.5重量％)的式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物至細(xì)胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)在37℃孵育24h。將20μM(0.5％DMSO)的吉非替尼、順鉑以及二者的混合物(20μM順鉑和20μM吉非替尼等濃度混合)作陽(yáng)性對(duì)照。以上化合物和對(duì)照組均同時(shí)做加100ng/mlEGF和不加EGF的兩個(gè)組別。孵育停止后，移除含藥物的培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，胰蛋白酶消化細(xì)胞。棄去胰酶，每孔用1mL冷的PBS將細(xì)胞沖下來(lái)轉(zhuǎn)移至離心管中，離心30秒，移除上清，再次用500μL/管冷PBS洗滌后離心。每管加入500μL的結(jié)合緩沖液洗滌離心。采用AnnexinV-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，測(cè)試樣品經(jīng)過AnnexinV-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)試樣品分為兩組：一組為加100ng/mlEGF；另一組不加EGF。每組測(cè)試樣經(jīng)不同化合物處理，即吉非替尼、順鉑、吉非替尼和順鉑等濃度混合物以及式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物。各測(cè)試樣加入試劑盒染料孵育10min后，用400目細(xì)胞過濾網(wǎng)濾除非單個(gè)細(xì)胞，然后移至流式細(xì)胞儀上進(jìn)行熒光輔助細(xì)胞篩選分析，收集數(shù)據(jù)，最后用FlowJo軟件對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，加100ng/mlEGF的結(jié)果見圖1-4所示，不加EGF的結(jié)果見圖5-8。(2)激光共聚焦熒光成像分析在共聚焦皿中接種1毫升含100ng/mLEGF的MCF-7細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為3×104個(gè)/mL，在37℃培養(yǎng)24h。然后加入20μM(0.5重量％DMSO)含100ng/mLEGF的化合物3-1，繼續(xù)在37℃孵育24h。20μM(0.5％DMSO)含100ng/mLEGF的吉非替尼和順鉑以及二者的混合物(20μM順鉑和20μM吉非替尼混合)。在37℃下孵育24h后，除去含藥物的培養(yǎng)基，PBS溶液洗滌三次。然后在避光的條件下，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1mL含25μg·mL-1的Hoechst33342培養(yǎng)基，在37℃孵育10min，再次用PBS溶液洗滌三次， 加入無(wú)色的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM。將共聚焦皿移至激光掃描共聚焦顯微鏡的樣品臺(tái)上成像。激光掃描共聚焦顯微成像的激發(fā)波長(zhǎng)選定為405nm，發(fā)射波長(zhǎng)425-500nm。用FV10-ASW3.1Viewer軟件打開并處理所得到的圖像，如圖9-12所示。流式細(xì)胞術(shù)的定量分析結(jié)果如圖1-8所示，圖1和圖5分別為吉非替尼在外加EGF和不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果，圖2和圖6分別為順鉑在外加EGF和不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果，圖3和圖7分別為順鉑和吉非替尼的等濃度混合物在外加EGF和不加EGF下的流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果，圖4和圖8分別為式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物在外加EGF和不加EGF下的數(shù)據(jù)流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果。通過對(duì)比圖1-8中的左下角表示的活細(xì)胞百分比、右下角表示的早期凋亡細(xì)胞百分比、右上角表示的晚期凋亡細(xì)胞百分比以及左上角表示的壞死細(xì)胞百分比可以看出，式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物相比于吉非替尼、順鉑及其混合物都更能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而更進(jìn)一步證明了本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物可以表現(xiàn)出更為優(yōu)越的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。激光共聚焦熒光成像的結(jié)果如圖9-12所示的，其中，圖9為吉非替尼的激光共聚焦熒光成像圖，圖10為順鉑的激光共聚焦熒光成像圖，圖11為順鉑和吉非替尼的等濃度混合物的激光共聚焦熒光成像圖，圖12為式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物的激光共聚焦熒光成像圖。通過圖9-12的對(duì)比，也可以非常鮮明的看出，圖12相對(duì)于圖9-11來(lái)說，其細(xì)胞核邊緣更加不規(guī)則，染色體濃集，著色較重，細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加，表明式(3-1)結(jié)構(gòu)所示的化合物相比于吉非替尼、順鉑及其混合物具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力，從而更進(jìn)一步證明了本發(fā)明的含喹唑啉類配體的Pt配合物可以表現(xiàn)出更為優(yōu)越的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí) 施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3