本發(fā)明涉及組合生物合成領(lǐng)域，具體涉及一種雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物及其制備方法。

背景技術(shù)：

雷帕霉素是一種31元環(huán)的含氮三烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，是臨床上應(yīng)用的重要免疫抑制劑和抗腫瘤藥物研發(fā)的中間體。temsirolimus,everolimus和zotarolimus都是半合成的雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物，已分別于2004，2005，2007年被FDA批準(zhǔn)作為抗腫瘤藥物和心血管支架涂層藥物上市銷售。

在天然產(chǎn)物中，除一部分化合物自身可以成藥，大部分是作為先導(dǎo)化合物通過基團(tuán)修飾，改造其成藥性質(zhì)，成為半合成藥物應(yīng)用于臨床。對于大部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然化合物進(jìn)行化學(xué)合成或者基團(tuán)結(jié)構(gòu)修飾，面臨著立體異構(gòu)和選擇性等諸多技術(shù)難點。而改造合成化合物的微生物宿主基因組，利用其自身生物合成的能力生產(chǎn)結(jié)構(gòu)修飾的類似物，從某種程度上突破了化學(xué)合成的技術(shù)瓶頸。使之以低成本，環(huán)境友好方式實現(xiàn)化學(xué)合成技術(shù)無法實現(xiàn)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)化合物的生物合成成為可能。

雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物合成研究方式主要也以突變合成，前體指導(dǎo)的生物合成及化學(xué)成為主。

突變合成(mutasynthesis)：L-proline和結(jié)構(gòu)類似物能夠代替雷帕霉素合成所需的天然前體L-pipecolate摻入聚酮鏈，產(chǎn)生prolylrapamycin等新結(jié)構(gòu)化合物。含硫的L-pipecolate的類似物也可以作為前體被非核糖體肽合成酶rapP利用從而產(chǎn)生雷帕霉素衍生物

前體指導(dǎo)的生物合成(Precursor directed biosynthesis)：雷帕霉素的聚酮合酶A的加載模塊具有較高的底物寬泛性，可以將不同的DHCHC的類似物加入到分子中產(chǎn)生雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物。雷帕霉素loading molecular的42 位碳原子是一個有價值的修飾位點，迄今為止FDA批準(zhǔn)上市的雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物無一例外均是該位點的不同修飾產(chǎn)物。

化學(xué)合成：雷帕霉素與mTOR結(jié)合部位也是進(jìn)行修飾的靶點。通過化學(xué)合成方法在雷帕霉素三烯位置的修飾得到的化合物WYE-592與ILS-920，由于破壞了和mTOR的結(jié)合結(jié)構(gòu)，因此這兩種化合物的免疫抑制功能明顯降低，而與FKBP52的結(jié)合能力增強，表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)(neuroprotective activities)的活性。

而通過敲除吸水鏈霉菌的雷帕霉素合成的后修飾酶，也得到了一系列不完全甲基化的化合物。

目前對雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行化學(xué)合成或者基團(tuán)結(jié)構(gòu)修飾都面臨著立體異構(gòu)和選擇性等諸多技術(shù)難點的問題，因此亟需一種工藝簡單，低成本，環(huán)境友好的合成方法來合成雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服對雷帕霉素類似物進(jìn)行化學(xué)合成或者基團(tuán)結(jié)構(gòu)修飾面臨著立體異構(gòu)和選擇性等諸多技術(shù)難點的問題，提供了一種利用能夠生產(chǎn)雷帕霉素的微生物游動放線菌(Actinoplanes sp.N902-109)自身生物合成能力來生產(chǎn)雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物的方法，并通過該方法制備得到了一種雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明提供的制備方法與現(xiàn)有的化學(xué)合成法相比操作更簡單，成本更低，對環(huán)境污染較小，且通過該制備方法所制得的雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物具有很好的抗真菌效果。

本發(fā)明技術(shù)方案之一：結(jié)構(gòu)如式1所示35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素：

本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種前述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素的制備方法，其包括下述步驟：發(fā)酵培養(yǎng)含有聚酮合酶rapA突變基因的游動放線菌N902-109，從發(fā)酵液中獲得；所述聚酮合酶rapA突變基因如序列表SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明中，所述聚酮合酶rapA突變基因可以來自任何來源，包括從體內(nèi)分離獲取和合成得到。所述聚酮合酶rapA突變基因的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為PCR分別擴增所述突變基因的突變位點的上游和下游的片段后用核酸酶切割再連接即得。所述核酸酶為本領(lǐng)域常規(guī)核酸酶，較佳地為限制性內(nèi)切核酸酶，如Nhe I。所述連接酶為本領(lǐng)域常規(guī)連接酶，更佳地為T4 DNA連接酶。所述含有聚酮合酶rapA突變基因的游動放線菌的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作，較佳地可以包括下述步驟：(1)將含有所述聚酮合酶rapA突變基因突變位點的基因片段連接到載體上，制得含有所述聚酮合酶rapA突變基因片段的重組載體；所述含有聚酮合酶rapA突變基因突變位點的基因片段的序列為SEQ ID No.1序列中的第5736位～第10693位；(2)將步驟(1)所述重組載體轉(zhuǎn)化到供體菌，得轉(zhuǎn)化供體菌；(3)將步驟(2)所述轉(zhuǎn)化供體菌與所述游動放線菌N902-109的菌絲接合，挑選接合子；(4)將含有歸巢內(nèi)切酶基因表達(dá)載體的供體菌與步驟(3)所述接合 子混合，挑選具有步驟(1)所述突變位點的雙交換接合子。

步驟(1)所述載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)載體，包括各類原核載體與真核載體，較佳地為原核載體，更佳地為pLYZL102載體。所述重組載體可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制得，較佳地可以將含有所述聚酮合酶rapA突變基因突變位點的基因片段連接到本領(lǐng)域各類常規(guī)載體上得到。

步驟(2)中，所述供體菌可以為本領(lǐng)域常規(guī)供體菌，較佳地為大腸桿菌，更佳地為大腸桿菌ET12567(pUZ8002)菌株。所述轉(zhuǎn)化可以為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，較佳地為電轉(zhuǎn)化法。

步驟(3)中，所述接合后較佳地還可以用接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，較佳地包括下述組分：0.5％豆餅粉，0.5％甘露醇，0.5％可溶性淀粉，0.2％胰蛋白胨，0.1％酵母提取物，0.1％NaCl，0.2％(NH4)₂SO₄，0.1％K₂HPO₃，0.2％CaCO₃，0.2％MgCl₂，2％瓊脂粉，0.0001％ZnSO₄，0.0001％FeSO₄，0.0001％MnSO₄和補至100％的水，所述百分比為各組分質(zhì)量占所述接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基體積的質(zhì)量體積百分比。

步驟(4)中，所述歸巢內(nèi)切酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)的酶，較佳地為I-SceI。所述供體菌可以為本領(lǐng)域常規(guī)菌種，較佳地為大腸桿菌，更佳地為大腸桿菌ET12567(pUZ8002)菌株。所述挑選雙交換接合子可以為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，較佳地為利用抗生素壓力進(jìn)行挑選。更佳地為利用安普霉素壓力來挑選，如將含有安普霉素啟動子驅(qū)動的I-SceI基因的表達(dá)載體的大腸桿菌與步驟(3)所述接合子混合，培養(yǎng)傳2代后挑選安普霉素抗性丟失的雙交換接合子。

本發(fā)明中，所述發(fā)酵包括下述步驟：將含有前述含有聚酮合酶rapA突變基因的游動放線菌N902-109的種子培養(yǎng)基接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃220轉(zhuǎn)/分恒溫培養(yǎng)9天。所述含有聚酮合酶rapA突變基因的游動放線菌N902-109的種子培養(yǎng)基的接種量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的接種量，較佳地為5-15％，所述百分比為占所述發(fā)酵培養(yǎng)基體積的體積百分比。所述含有聚酮合酶rapA突變基因的游動放線菌N902-109的種子培養(yǎng)基可以通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制得，較佳地可以通過下述步驟制得：(1)接種所述含有聚酮合酶rapA 突變基因的游動放線菌至游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基，涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)7-9天；(2)刮取斜面菌絲體接入一級種子培養(yǎng)基中，28℃，220轉(zhuǎn)恒溫培養(yǎng)4-5天；(3)取步驟(2)所述一級種子培養(yǎng)基接種到二級種子培養(yǎng)基中，28℃220轉(zhuǎn)/分恒溫培養(yǎng)3-4天即得。所述游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地包括下述組分：葡萄糖2％、可溶性淀粉4％、酵母提取物0.1-0.2％、酶水解干酪素0.5％、CaCO₃0.1％和瓊脂1.6％和補至100％的水，所述百分比為各組分質(zhì)量占所述游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基總體積的質(zhì)量體積百分比。所述游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地包括下述步驟：將所述原料組分混合、調(diào)pH至7.0～7.2，滅菌。所述滅菌可以為本領(lǐng)域常規(guī)滅菌方法，較佳地為115℃～121℃滅菌15min～20min，更佳地為115℃滅菌15min。所述一級種子培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基，較佳地包括下述組分：可溶性淀粉3％、葡萄糖2％、干酵母0.5％、玉米漿干粉0.5％、花生粕0.5％、CaCO₃0.2％和補至100％的水，所述百分比為所述各組分的質(zhì)量占所述一級種子培養(yǎng)基總體積的質(zhì)量體積百分比。所述一級種子培養(yǎng)基的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地包括下述步驟：將所述各組分混合、調(diào)pH至7.0，滅菌。所述滅菌可以為本領(lǐng)域常規(guī)滅菌方法，較佳地為115℃～121℃滅菌15min～20min，更佳地為115℃滅菌15min。所述二級種子培養(yǎng)基可以為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基，較佳地包括下述組分：可溶性淀粉3％、葡萄糖4％、玉米漿干粉0.8％、棉子蛋白粉0.8％、CaCO₃0.3％、泡敵0.2％、MgSO₄.7H₂O 0.00025％、CoCl₂.6H₂O 0.0001％、VB₁0.02％、VB₁₂0.00002％、葉酸0.0025％和補至100％的水，所述百分比為所述各組分的質(zhì)量占所述二級種子培養(yǎng)基總體積的質(zhì)量體積百分比。所述二級種子培養(yǎng)基的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地包括下述步驟：將所述各組分混合、調(diào)pH至6.9，滅菌。所述滅菌為本領(lǐng)域常規(guī)滅菌方法，較佳地為115℃～121℃滅菌15min～20min，更佳地為115℃滅菌15min。步驟(3)中，所述一級種子培養(yǎng)基的接種量可以為常規(guī)的接種量，較佳地為5-10％，所述百分比為占所述二級種子培養(yǎng)基體積的體積百分比。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可 以為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，較佳地為步驟(3)所述二級種子培養(yǎng)基。

本發(fā)明中，所述從發(fā)酵液中獲得所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素包括下述步驟：用丙酮從所述發(fā)酵液中提取得到所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素，上大孔樹脂后洗脫、減壓濃縮后得濃縮洗脫產(chǎn)物，萃取得所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素粗提物。所述減壓濃縮可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作，所述減壓濃縮的溫度較佳地為35℃。所述萃取可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作，所述萃取使用的萃取劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)萃取劑，較佳地為乙酸乙酯。所述萃取的次數(shù)可以為常規(guī)的次數(shù)，較佳地為2次。所述萃取劑與所述濃縮洗脫產(chǎn)物的體積比可以為常規(guī)的比例，較佳地為1∶1。

本發(fā)明較佳地還可以包括下述步驟：所述萃取后加入5％的無水硫酸鈉脫水，35℃減壓濃縮。35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素粗提物。

本發(fā)明較佳地還可以包括用硅膠分離純化所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素粗提物，其包括下述步驟：溶解所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素粗提物，上樣于硅膠，洗脫得純化后的35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素。所述硅膠可以為本領(lǐng)域常規(guī)硅膠，較佳地為300-400目硅膠。所述溶解所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素粗提物的溶劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溶劑，較佳地為體積比為1∶1的二氯甲烷和環(huán)己烷。所述洗脫使用的溶劑可以為本領(lǐng)域常規(guī)的溶劑，較佳地為體積比為10∶1～20∶1的環(huán)己烷和丙酮。

本發(fā)明技術(shù)方案之三：如前所述35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素在制備抗真菌組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述抗真菌藥物組合物可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指的試劑，較佳地為可以抑制黑曲霉所引起的黑霉的組合物或可以治療白色念珠菌所引起的疾病的組合物，所述可以治療白色念珠菌所引起的疾病的組合物較佳地為可以治療由白色念珠菌引起的皮膚念珠菌病、粘膜念珠菌病、內(nèi)臟念珠菌病、念珠菌疹和免疫缺陷疾病的組合物。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā) 明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供了一種組合生物合成方法合成雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物的途徑，該方法工藝簡單，以低成本，環(huán)境友好的方式實現(xiàn)了化學(xué)合成技術(shù)無法實現(xiàn)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)化合物的生物合成，并且所合成的雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物具有很好的抗真菌效果。

附圖說明

圖1：游動放線菌rapA基因功能域排列和突變位點設(shè)計示意圖。

圖2：游動放線菌N902-109單交換重組克隆PCR示意圖。SC1和SC2分別代表兩個單交換克??；AC：游動放線菌N902-109。

圖3為：游動放線菌N902-109雙交換重組克隆PCR及PCR產(chǎn)物酶切圖。A1-A7：雙交換菌株；AC：游動放線菌N902-109。

圖4：雷帕霉素及其結(jié)構(gòu)類似物發(fā)酵液HPLC分離圖譜。

圖5：雷帕霉素和及其結(jié)構(gòu)類似物的紫外吸收峰圖。

圖6：游動放線菌rapA基因ER功能域點突變質(zhì)粒pLYERIA示意圖。

圖7：質(zhì)粒pLYERIA的構(gòu)建流程示意圖。

圖8：質(zhì)粒pSETSI的構(gòu)建流程示意圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

本發(fā)明所用到的試劑和主要儀器：

限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific.連接酶ligation solution I、T4 DNApolymerase、限制性內(nèi)切酶pshAI、10mM dNTP購自TaKaRa公司。pACK4aPCR片段克隆載體購自蘇州盤古基因有限公司。高保真DNA聚合酶Neo KOD-plus購自Toyobo公司。安普霉素購自DUCHEFA公司。萘啶酮酸，壯觀霉素購自于生工生物工程公司。質(zhì)粒抽提和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。Easytaq購自全式金生物公司。PCR儀為Biometra Tprofessional TRIO，離心機為Eppendorf 5424和5415R，HPLC色譜儀為Agilent Technologies 1200series型高效液相色譜儀，質(zhì)譜儀為Waters公司W(wǎng)aters Q-TOF Micromass質(zhì)譜儀，核磁共振儀為Inova-400核磁共振儀，色譜柱：Waters NaVa-PaK C8柱，規(guī)格：(3.9mm×150mm，5μm)；HF254高效硅膠板購自煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)。引物合成委托南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司，基因測序服務(wù)由上海杰李生物科技公司提供。

本發(fā)明所用到的游動放線菌N902-109見下述專利文獻(xiàn)：美國專利(US5674732)，所用到的白色念珠菌(Candida albicans)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和青霉菌(Penicillium Sp.)均購自美國ATCC，黑曲霉(Aspergillus niger)購自CGMCC，白色念珠菌的保藏號為ATCC11651，釀酒酵母的保藏號為ATCC204508，青霉菌的保藏號為ATCC32029，黑曲霉的保藏號為CGMCC3.3928。所用到的大腸桿菌ET12567(pUZ8002)菌株見下述文獻(xiàn)：Macneil DJ,Gewain KM,Ruby CL,Dezeny G,Gibbons PH,Macneil T.Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for Avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.Gene.1992,111(1):61-68；所用到的質(zhì)粒來源如下：pSET152見下述參考文獻(xiàn)：Bierman M,Logan R,Obrien K,Seno ET,Rao RN,Schoner BE:Plasmid Cloning Vectors for the Conjugal Transfer of DNA from Escherichia.coli to Streptomyces Spp.Gene 1992,116(1):43-49；pSETspc由pSET152改造得到，見圖8；pSETSI由pSET152改造得到，見圖8；pLYZL102見下述參考文獻(xiàn)：Shen Y,Huang H,Zhu L,Luo M,Chen D.Type II thioesterase gene(ECO-orf27)from Amycolatopsis orientalis influences production of the polyketide antibiotic,ECO-0501(LW01).Biotechnology Letters.2012,34(11):2087-2091.；pLYERIA由pLYZL102改造 得到，見圖7；pLU101見下述參考文獻(xiàn)：Lu Z,Xie P,Qin Z:Promotion of markerless deletion of the actinorhodin biosynthetic gene cluster in Streptomyces coelicolor(dagger).Acta Biochimica Et Biophysica Sinica 2010,42(10):717-721；pIJ773和pIJ778見下述參考文獻(xiàn)：Gust B,Challis GL,Fowler K,Kieser T,Chater KF:PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America2003,100(4):1541-1546；pACK4aBS購自盤古基因(蘇州)科技有限公司。

實施例1

游動放線菌聚酮合酶rapA的功能域結(jié)構(gòu)分析。

利用http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/_進(jìn)行聚酮合酶rapA功能域的預(yù)測，結(jié)果如表1所示：

表1

rapA基因包含了一個加載模塊和四個鏈延伸模塊，每個模塊的排布示意圖如圖1所示。Act_rapA指游動放線菌rapA基因，CL為羧酸連接酶，AT為?；D(zhuǎn)移酶功能域，KS為酮基合成酶功能域，DH為脫氫酶功能域，ER為烯酰還原酶功能域，KR為酮基還原酶功能域，ACP為?；d體蛋白功能域。

實施例2

游動放線菌rapA ER功能域點突變同源雙交換菌株的獲得。

游動放線菌rapA ER功能域點突變的示意圖見圖1。通過兩對引物ERIAUs-ERIAUas與ERIADAs-ERIADAas分別擴增游動放線菌rapA基因ER功能域突變位點上游和下游的兩個片段，再通過引入的突變位點中包含的限制性內(nèi)切酶NheI將兩個片段連接起來。

A)游動放線菌N902-109基因組的提?。?/p>

取少量游動放線菌N902-109菌絲體接種于含5mL YEME培養(yǎng)基的試管中，于30℃振蕩培養(yǎng)約72小時。3500rpm離心收集菌絲體，用TES(10mM Tris-HCl pH7.5，EDTA 1mM，NaCl 50mM)洗兩次。向收集的菌絲體中加入1mL TES(含溶菌酶終濃度5mg/mL)，渦旋至均一，37℃水浴60分鐘，加入蛋白酶K(終濃度達(dá)到0.1mg/mL)，0.1mL 10％SDS，混勻后迅速放入55℃水浴60分鐘，待溶液澄清。置于冰上冷卻，加入0.25mL 5M KAc，冰上冷卻15分鐘。加入0.5mL酚：氯仿(Tris飽和酚pH7.5：氯仿：異戊醇為體積比25：24：1)，輕柔顛倒混勻，于4℃12000rpm離心10分鐘。用剪口的1mL槍頭將水相吸出轉(zhuǎn)移至新離心管，加等量氯仿抽提，12000rpm，4℃離心10分鐘，用剪口的1mL槍頭將水相吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入0.1體積的3M NaAc，兩倍體積的無水乙醇，混勻，出現(xiàn)絮狀DNA。將其勾出至于新離心管中，加入0.5mL 70％的乙醇洗滌，用槍吸凈液體，稍干后加入300μl TE溶解，加入RNA酶(終濃度為50μg/mL)，37℃水浴30分鐘。

B)烯酰還原酶功能域定點突變質(zhì)粒pLYERIA的構(gòu)建：

以游動放線菌N902-109基因組為模板，以引物ERIADAas(HindIII)和ERIADAs(NheI)，ERIAUAs(XbaI)和ERIAUAas(NheI)，分別進(jìn)行高可性度擴增得到長度為2846bp，2142bp的ER功能域下同源臂和上同源臂片段。反應(yīng)體系(50μl)包括：5μl 10×KOD NEO plus緩沖液，3μl 25mM MgCl₂，1.5μl 2.5mmol/L dNTP溶液，2.5μl DMSO，30pmol P1，30pmol P2，1U KOD NEO plus DNA聚合酶，50ng基因組DNA，加雙蒸水至50μl。PCR反應(yīng)程序為：95℃5min，30個循環(huán)(94℃30s，56℃30s，72℃120s)，72℃10min。 PCR產(chǎn)物純化后，分別取2μl與0.5μl pACK4aBS載體混合，37℃放置15min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a獲得pACK4a-ERIADA，pACK4a-ERIAUA質(zhì)粒。以NheI，HindIII酶切pACK4a-ERIADA得到ERIADA片段，以NheI，XbaI酶切pACK4a-ERIAUA得到ERIAUA片段，以HindIII，XbaI酶切pLYZL102得到載體片段，三者片段連接得到pLYERIA質(zhì)粒，流程圖見圖7，pLYERIA質(zhì)粒圖譜見圖6。

C)游動放線菌N902-109與大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移:

i)游動放線菌rapA基因ER功能域同源單交換菌株的獲得

制備游動放線菌菌絲體懸液：取3μl游動放線菌甘油保藏液涂布I-Isp2固體培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)120小時左右。用無菌刮棒刮取表面菌體，用15-20mL無菌水分兩次洗下并通過玻璃珠在旋渦振蕩器上震蕩6-8次，每次10秒鐘，將懸液通過置有棉花塞的無菌注射器針筒，濾出液經(jīng)過7000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄去上清，用適量0.4-1.0mL無菌水重懸得到菌絲體懸液。

從LB平板(50μg/mL卡那霉素，50μg/mL安普霉素，25μg/mL氯霉素)上挑取ET12567(pUZ8002)單菌落，接種含有同上抗生素的3mL LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。次日以0.5％(v/v)接種量接入含有同上濃度的三種抗生素的10mL LB三角瓶中，37℃培養(yǎng)至OD 0.4-0.6，4500rpm 5min，4℃離心收集菌體，棄上清，用同體積無菌10％甘油洗滌兩次，重懸在約500μL 10％甘油中并分裝成50ul每管即為ET12567/pUZ8002電轉(zhuǎn)化感受態(tài)待用。將100ng pLYERIA質(zhì)粒加入到ET12567/pUZ8002細(xì)胞中，電壓2.5kv，電阻200歐姆，電擊轉(zhuǎn)化，加入1.0ml無菌冷LB重懸并37℃培養(yǎng)1hr，涂LB平板(50μg/mL卡那霉素，50μg/mL安普霉素，25μg/mL氯霉素)，篩選ET12567(pUZ8002)的pLYERIA轉(zhuǎn)化子。將含有pLYERIA質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，于接合轉(zhuǎn)移前一天接種單菌落到3mL LB試管中，加入50μg/mL卡那霉素，50μg/mL安普霉素，25μg/mL氯霉素培養(yǎng)過夜，次日以1％(v/v)接種量接入含有同濃度的三種抗生素的10mL LB三角瓶中，37℃培養(yǎng)至OD 0.4-0.6，4500rpm，5min，4℃離心收集菌體，棄上清，用同體積 無菌LB洗滌兩次，重懸在約200μL LB中待用。

將大腸桿菌菌液與制備好的游動放線菌N902-109菌絲懸液100μl充分混合，涂布2塊含有終濃度20mM MgCl₂的M-Isp4平板上，30℃培養(yǎng)24小時后，每板均勻平鋪混合了0.7ml無菌水、15μl 50mg/ml溶解于0.1N的NaOH中的萘啶酮酸和15μl 50mg/ml安普霉素的溶液。30℃繼續(xù)培養(yǎng)6天，至單克隆長出。挑選單克隆用引物apr-V-R和ERIAVAS進(jìn)行PCR檢驗，得游動放線菌rapA基因ER功能域同源單交換菌株N902ERSC。

ii)游動放線菌rapA基因ER功能域同源雙交換菌株的獲得

a)基于限制性內(nèi)切酶I-SceI的基因點突變

I-SceI表達(dá)質(zhì)粒pSETSI的構(gòu)建流程見圖8，具體流程如下：pSET152用pshAI酶切，用Fast AP酶去磷酸基團(tuán)。pIJ778用XbaI切出1.3kb壯觀霉素抗性基因片段，用T4 DNA聚合酶補平末端。與pSET152pshAI載體連接獲得pSETspc質(zhì)粒。paacs，paacas引物以pIJ773為模板，使用KOD NEO plus進(jìn)行高可信度PCR擴增，獲得的片段以BamHI，NdeI酶切即為安普霉素啟動子插入片段，pLU101用NdeI，EcoRI切下I-SceI插入片段。安普霉素啟動子片段和I-SceI片段與BamHI，EcoRI酶切的pSETspc載體相連，獲得pSETSI。

b)制備大腸桿菌ET12567(pUZ8002)的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化pSETSI質(zhì)粒，感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的方法同前述。

c)在單交換菌株N902ERSC胞內(nèi)表達(dá)I-SceI酶篩選雙交換菌株

將含有pSETSI質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567(pUZ8002)，于接合轉(zhuǎn)移前一天接種單菌落到3mL LB試管中，加入50μg/mL卡那霉素，50μg/mL安普霉素，25μg/mL氯霉素37℃培養(yǎng)過夜，次日以1％(v/v)接種量接入含有同濃度的三種抗生素的10mL LB三角瓶中，37℃培養(yǎng)至OD 0.4-0.6，4500rpm，5min，4℃離心收集菌體，棄上清，用同體積無菌LB洗滌兩次，重懸在約200μL LB中待用。

將大腸桿菌菌液與制備好的游動放線菌N902-109菌絲懸液100ul充分 混合，涂布2塊含有終濃度20mM MgCl₂的M-Isp4平板上，30℃培養(yǎng)24小時后，每板均勻平鋪混合了0.7ml無菌水、15μl 50mg/ml溶解于0.1N的NaOH中的萘啶酮酸和15μl 50mg/ml壯觀霉素的溶液。30℃繼續(xù)培養(yǎng)6天，至單克隆長出，得到正確整合的同源雙交換菌株N902ERSCI克隆。挑選克隆在液體培養(yǎng)基M-Isp2中培養(yǎng)N902ERSCI并連續(xù)傳代2次，稀釋培養(yǎng)物，涂布M-Isp2平板至長出單克隆。將單克隆分別劃線無安普霉素M-Isp2和含有30μg/ml安普霉素M-Isp2平板，挑出對安普霉素敏感的克隆，以ERIAvs、ERIAvas PCR擴增安普霉素敏感克隆，回收PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行NheI酶切反應(yīng)，挑選出游動放線菌rapA基因ER功能域突變菌株N902ERIA。

pLYERIA通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化游動放線菌N902-109得到了兩個單克隆。抽提基因組，用引物apr-V-R和ERIAVas進(jìn)行PCR驗證，見圖2。PCR結(jié)果說明，pLYERIA質(zhì)粒在游動放線菌rapA基因的正確的ER功能域位置插入基因組，單交換菌株N902ERSC基因型正確。

pSETSI通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化單交換菌株N902ERSC獲得整合有I-SceI基因的菌株N902ERSCI。通過不加瓊脂的液體M-Isp 2兩次培養(yǎng)傳代，誘導(dǎo)雙交換環(huán)出，挑選雙交換突變株。對挑到的七株安普霉素抗性丟失的雙交換菌株，以基因組為模板，以ERIAVs和ERIAVas作為引物進(jìn)行PCR擴增驗證。PCR片段以NheI酶切，結(jié)果如圖3所示。野生型游動放線菌的ER功能域位點不存在NheI位點，而設(shè)計的突變位點引入了NheI位點。突變ER功能域的NheI特征酶切圖譜為2.9kb和1.9kb。根據(jù)圖3，可以說明：A3為雙交換菌株恢復(fù)野生型，其余六株均為ER功能域突變的雙交換菌株。測序結(jié)果明確顯示即游動放線菌rapA基因ER功能域的活性位點氨基酸A-G-G突變成為氨基酸A-S-P。

表2所用到的和構(gòu)建的質(zhì)粒

表3所用到的引物名稱及序列

表4使用到的和構(gòu)建的菌株

所用到的培養(yǎng)基成分如下：

LB：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水至1L，滅菌。

YEME：蔗糖170g，酵母提取物3g，細(xì)菌蛋白胨(Bactopeptone)5g，麥芽糖提取物3g，葡萄糖10g，調(diào)pH至7.0，加水至1L，滅菌后加入MgCl₂至終濃度5mM。

YM培養(yǎng)基：0.3％酵母膏(w/v)，0.5％胰蛋白胨(w/v)，0.5％麥芽糖(w/v)，補水至100％，調(diào)pH至9.0。

M-Isp2：麥芽糖提取物10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，瓊脂20g，加水至1L，pH7.0，滅菌。

M-Isp4：豆餅粉5g，甘露醇5g，可溶性淀粉5g，胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 1g，(NH₄)₂SO₄2g,K₂HPO₃1g,CaCO₃2g,瓊脂粉20g，無機鹽微量元素溶液1ml，加水至1L，pH7.0，滅菌。無機鹽微量元素溶液：ZnSO₄1g，F(xiàn)eSO₄1g，MnSO₄1g，加水至1L。

游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20g、可溶性淀粉40g、酵母提取物5g、酶水解干酪素5g、CaCO₃1g和瓊脂16g，加水至1L，pH7.0-7.2。

一級種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉30g、葡萄糖20g、干酵母5g、玉米漿干粉5g、花生粕5g和CaCO₃2g，加水至1L，pH7.0。

二級種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉30g、葡萄糖40g、玉米漿干粉8g、棉子蛋白粉8g、CaCO₃3g、泡敵2g、MgSO₄.7H₂O 0.0025g、CoCl₂.6H₂O 0.001g、VB₁0.2g、VB₁₂0.0002g和葉酸0.025g，加水至1L，pH6.9。

實施例3

雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物的發(fā)酵制備與鑒定

A)游動放線菌N902-109ERIA的發(fā)酵

將甘油管保藏的游動放線菌N902-109ERIA菌液滴接入游動放線菌發(fā)酵斜面培養(yǎng)基的斜面，用接種棒涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)7-9天。用接種鏟刮取斜面菌絲體接入30ml一級種子培養(yǎng)基中，28℃，220轉(zhuǎn)恒溫培養(yǎng)4-5天后按接種量10％接到二級種子培養(yǎng)基，所述百分比為占所述二級種子培養(yǎng)基體積的體積百分比，28℃220轉(zhuǎn)/分恒溫培養(yǎng)3-4天,再按接種量7.5％-10％接到裝有二級種子培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，所述百分比為占所述發(fā)酵瓶中二級種子培養(yǎng)基體積的體積百分比，搖床轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分28℃恒溫培養(yǎng)9天。

B)35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素的提取

發(fā)酵液中按照比例加入2.5％硅藻土助濾劑攪拌5分鐘，所述百分比為所述硅藻土質(zhì)量占所述發(fā)酵液體積的質(zhì)量體積百分比，真空抽濾；收集濾餅，在濾餅中加入等體積的60％(v/v)丙酮攪拌，浸泡2h；抽濾，收集濾液。再使用60％(v/v)丙酮同樣提取一次，合并兩次濾液。

丙酮提取液中加入兩倍體積的水稀釋丙酮濃度，混合均勻后上X-5(4cm×40cm)大孔樹脂柱；上樣完畢后，依次用水、30％(v/v)丙酮、40％(v/v)丙酮、50％(v/v)丙酮、60％(v/v)丙酮各2L梯度洗脫，TLC分析，合并含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，35℃減壓濃縮，獲得去除丙酮的乳濁液，所述百分比為丙酮體積占丙酮水溶液總體積的體積百分比。

向乳濁液中加入等體積的乙酸乙酯攪拌萃取2次，合并兩次乙酸乙酯的萃取液，加入5％的無水硫酸鈉脫水，所述百分比為所述無水硫酸鈉質(zhì)量占水體積的體積百分比，35℃減壓濃縮至漿狀物，獲得含有目標(biāo)產(chǎn)物的粗提物。

分離純化：稱取300-400目硅膠適量，加入環(huán)己烷濕法裝柱(3cm×32cm)。向樣品中加入1.5mL二氯甲烷和1.5mL環(huán)己烷溶解粗提物后，上樣于硅膠柱。洗脫溶劑為環(huán)己烷和丙酮，比例分別為20:1、18:1、15:1、12:1、10:1，每個比例各250ml，至梯度10：1時等度洗脫，收集洗脫液，用薄層色譜TLC法檢測收集液，將含有目標(biāo)產(chǎn)物的較純收集液合并，35℃減壓濃縮至漿狀物。將濃縮物用二氯甲烷溶解，用HPLC半制備，收集高純度的目標(biāo)產(chǎn)物，濃縮、 真空干燥。取部分樣品用二氯甲烷溶解，進(jìn)行正相HPLC分析。

分析方法

TLC分析：

用毛細(xì)管吸取待測樣品，于HF254高效硅膠板上點樣，后于展開劑中展開，當(dāng)展開劑前沿跑至距離硅膠板上端0.5cm處時，取出硅膠板，冷風(fēng)吹干。將風(fēng)干后的硅膠板放入含有純碘的密閉容器中片刻，直至斑點顯色。展開劑系統(tǒng)：環(huán)己烷：丙酮＝1:1。

表5 35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素的物化性質(zhì)及薄層層析遷移率

HPLC正相分析：

儀器:Waters 515型高效液相色譜儀，包括帶PDA的s996型紫外檢測器；色譜柱：Welch Ultimate XB-CN柱(4.6mm×250mm，5μm)；進(jìn)樣量：20μl；檢測檢測波長：278nm；流動相：環(huán)己烷：異丙醇＝95:5；流速：1ml/min；柱溫：室溫。

游動放線菌N902-109的發(fā)酵液中檢測到雷帕霉素和去甲基雷帕霉素，游動放線菌N902-109ERIA菌株則合成少量的雷帕霉素，而出現(xiàn)了一個新未知產(chǎn)物的峰，結(jié)果如圖4所示。該化合物被命名為SIPI-Rapxin。該新化合物的紫外吸收光譜與雷帕霉素十分接近，如圖5所示，推測其應(yīng)該是雷帕霉素的結(jié)構(gòu)類似物。

質(zhì)譜與NMR數(shù)據(jù)測定：

分離純化獲得新的雷帕霉素結(jié)構(gòu)類似物SIPI-Rapxin的樣品測定MS和NMR圖譜數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示，檢測到SIPI-Rapxin(化合物3)與27-去甲基雷帕霉素(化合物1)的紫外光譜基本一致，表明兩個化合物結(jié)構(gòu)類似。根據(jù)化合物3的ESI-MS圖譜，MS圖譜中出現(xiàn)920(M+Na⁺)峰，因此推斷其分子量為897，比雷帕霉素分子量913少16，推測可能缺少一個-CH₂-亞甲基基團(tuán)和2個氫質(zhì)子，化合物3可能的分子式為C₄₉H₇₃NO₁₃。

分析化合物3的¹H NMR和¹³C NMR圖譜，結(jié)果見表6發(fā)現(xiàn)其僅有兩個甲氧基3H峰(3.13和3.17ppm)和兩個甲氧基的碳原子峰(55.8和56.4ppm)，而27-O-去甲基雷帕霉素分子結(jié)構(gòu)中含有二個甲氧基(分別連接于16,39位碳原子上，化學(xué)位移分別為：55.9、56.8ppm)?；衔?與27-O-去甲基雷帕霉素的甲氧基完全一致。因此，推測化合物2可能為27-O-去甲基雷帕霉素類似物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)化合物3比化合物1多一個雙鍵，存在于35和36位碳原子，與工程菌構(gòu)建一致。因此，3化合物結(jié)構(gòu)為35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素。

表6 27-O-去甲基雷帕霉素(化合物1)和SIPI-Rapxin(化合物3)的¹³C-NMR數(shù)據(jù)對比

注：1為文獻(xiàn)報導(dǎo)的27-去甲基雷帕霉素NMR數(shù)據(jù)；3為SIPI-Rapxin的NMR數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)。

效果實施例1

35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素的抗真菌活性測定

(1)200ul的YM液體酵母培養(yǎng)物(30℃培養(yǎng)20h)加入100ml溫?zé)岬腨M培養(yǎng)基，0.8％瓊脂，倒板，每板約15-20ml。

(2)霉菌YM液體培養(yǎng)物(30℃培養(yǎng)36hr)630ul加入100ml溫?zé)岬腨M培養(yǎng)基，0.8％瓊脂，倒板，每板約15-20ml。

(3)將雷帕霉素溶于甲醇，梯度稀釋至20、10、5、2.5和1.25μg/mL，將35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素溶于甲醇，稀釋至20與10μg/mL。將以上各個濃度的樣品各取100ul加在直徑1cm的濾紙圓片上，室溫放置10分鐘將甲醇揮發(fā)，將濾紙片輕蓋貼合在平板的四個象限中，室溫放置30分鐘使藥品擴散在培養(yǎng)基中。接著放30℃培養(yǎng)2-3天直至抑菌圈產(chǎn)生。

(4)測量抑菌圈的直徑：以藥品濃度的對數(shù)和抑菌圈直徑作圖，將一定濃度的35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素產(chǎn)生的抑菌圈直徑根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得同直徑抑菌圈的雷帕霉素的濃度，將35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素濃度/雷帕霉素濃度的比值作為相對抑菌活性的表征，結(jié)果見表7。

表7雷帕霉素和35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素的相對抗真菌活性

根據(jù)表7的結(jié)果，35,36-二脫氫-27-O-去甲基雷帕霉素對白色念珠菌、釀酒酵母、黑曲霉和青霉菌的抑制效果明顯強于雷帕霉素。

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