本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種針對(duì)Ion Torrent高通量測(cè)序平臺(tái)的Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物設(shè)計(jì)、建庫(kù)及高通量測(cè)序的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境微生物群落(即微生物多樣性)是指環(huán)境微生物的種類和種間差異，是表征環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的重要參數(shù)之一。由于環(huán)境微生物群落能較早地預(yù)測(cè)環(huán)境質(zhì)量的變化，因而被認(rèn)為是最有潛力的敏感性生物指標(biāo)之一，但由于環(huán)境中微生物數(shù)量巨大、種類繁多，環(huán)境微生物的研究很大程度上依賴于方法和技術(shù)的進(jìn)步。目前通過(guò)16S rRNA測(cè)序以鑒定特定環(huán)境下細(xì)菌和古菌的微生物種類和豐度已成為公識(shí)。因此，一種操作方便、成本低廉并且高通量的16S rRNA檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前環(huán)境微生物檢測(cè)的關(guān)鍵所在。
最近高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得每次獲得的基因序列數(shù)可達(dá)幾百萬(wàn)甚至以億萬(wàn)計(jì)，不僅可以檢測(cè)到環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物及痕量微生物，而且能夠定性定量地反映微生物的原始組成，從而為環(huán)境微生物多樣性的研究開(kāi)啟了新的研究熱潮。目前，應(yīng)用于微生物16S rRNA測(cè)序的常見(jiàn)平臺(tái)有454、Illumina測(cè)序平臺(tái)，但高通量測(cè)序儀及其運(yùn)行一次的高昂測(cè)序成本限制了其在實(shí)驗(yàn)室特別是中、小型實(shí)驗(yàn)室的正常運(yùn)行。
最新出現(xiàn)的Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)（Life Technologies, Guilford, CT)因其快速，特別合適于應(yīng)急測(cè)序項(xiàng)目而越來(lái)越受到眾多科研工作者的關(guān)注。目前提供了三種針對(duì)16S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的建庫(kù)技術(shù)：（１）通過(guò)常規(guī)建庫(kù)的方法，對(duì)每一種待測(cè)樣本都必須一個(gè)建庫(kù)，然后混合帶不同barcode序列的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，該法的缺點(diǎn)是建庫(kù)成本化費(fèi)巨大，操作繁瑣； （２）通過(guò)Amplicon 文庫(kù)構(gòu)建文法，即在每一對(duì)引物的正反向都需加上60bp測(cè)序接頭，然后對(duì)不同PCR產(chǎn)物混合測(cè)序，該法雖然不需建庫(kù)，但引物過(guò)長(zhǎng)，不僅引起引物合成成本昂貴，而且易引起引物擴(kuò)增效率不高；（3）Ion Torrent公司還提供一種16S rRNA PCR 擴(kuò)增建庫(kù)試劑盒，但每一個(gè)樣品需兩次建庫(kù)，成本更為昂貴。
基于這些建庫(kù)方法的不足，需要建立一種針對(duì)Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)的多樣品16S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)建庫(kù)和測(cè)序方法，從而徹底解決目前高通量測(cè)序儀平臺(tái)成本高、周期長(zhǎng)的問(wèn)題，為環(huán)境微生物研究提供低化費(fèi)、高時(shí)效的檢測(cè)平臺(tái)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA測(cè)序方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：
一種適合Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA測(cè)序方法，其包括樣本DNA提取、16S rRNA測(cè)序引物設(shè)計(jì)、16S rRNA PCR 擴(kuò)增、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及定量、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序和序列分析，所述16S rRNA測(cè)序引物設(shè)計(jì)按如下步驟進(jìn)行：
（1）選取16S rRNA通用引物；
（2）選取Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)DNA 1-96 barcode 序列；
（3）在PCR 上游引物5’端加上barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序上游引物，在PCR 下游引物5’端加上同樣的barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序下游引物。
優(yōu)選的，所述步驟（1）中步驟( 1) 中選取的PCR 上、下游引物為16S rRNA通用引物。
優(yōu)選的，述的步驟(2) 中高通量測(cè)序的平臺(tái)為Ion torrent 測(cè)序平臺(tái)。
優(yōu)選的：所述的步驟( 3 ) 中將步驟( 2 ) 中的barcode 插入步驟( 1 ) 中得到的Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物。
優(yōu)選的，適合Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA測(cè)序方法具體步驟為：
(a) 提取基因組DNA：針對(duì)不同的樣本來(lái)源選擇合適的DNA提取試劑盒提取微生物基因組DNA；
(b) Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物PCR 擴(kuò)增：以步驟(a) 中得到的基因組DNA為模板，與權(quán)利要求1 中設(shè)計(jì)得到的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每一種Barcode 特異性引物對(duì)應(yīng)一種待測(cè)樣本；
(c)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及定量：用割膠回收試劑盒或者PCR 純化試劑盒對(duì)步驟(b) 中得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收或純化，以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小分析，以Qubit? 2.0熒光計(jì)定量純化后的PCR 產(chǎn)物；
(d) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)：按定量結(jié)果，將每個(gè)純化后PCR產(chǎn)物等量混勻，按Ion Torrent DNA建庫(kù)試劑盒建庫(kù)。
(d) 文庫(kù)片段大小和濃度檢測(cè)：以安捷倫2100 生物分析儀對(duì)文庫(kù)片段大小和濃度進(jìn)行檢測(cè)。
(e) Ion Torrent高通量測(cè)序：用高通量測(cè)序儀對(duì)步驟(c) 中純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物中的barcode序列將測(cè)序結(jié)果分為不同的樣本組；
(f)序列分析：利用mothur 軟件包對(duì)PGM產(chǎn)生的高通量序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)樣品標(biāo)記簡(jiǎn)單， (2) 建庫(kù)方法簡(jiǎn)單， (3) 極大地降低測(cè)序成本，(4) 位點(diǎn)選擇靈活，(5) 數(shù)據(jù)分析容易，非常適合中等數(shù)量樣本的檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。
實(shí)施例：
一種適合Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA測(cè)序方法，其包括樣本DNA提取、16S rRNA測(cè)序引物設(shè)計(jì)、16S rRNA PCR 擴(kuò)增、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及定量、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序和序列分析，所述16S rRNA測(cè)序引物設(shè)計(jì)按如下步驟進(jìn)行：
（1）選取16S rRNA通用引物；
（2）選取Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)DNA 1-96 barcode 序列；
（3）在PCR 上游引物5’端加上barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序上游引物，在PCR 下游引物5’端加上同樣的barcode 序列，得到Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序下游引物。
優(yōu)選的，所述步驟（1）中步驟( 1) 中選取的PCR 上、下游引物為16S rRNA通用引物。
優(yōu)選的，述的步驟(2) 中高通量測(cè)序的平臺(tái)為Ion torrent 測(cè)序平臺(tái)。
優(yōu)選的：所述的步驟( 3 ) 中將步驟( 2 ) 中的barcode 插入步驟( 1 ) 中得到的Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物。
優(yōu)選的，適合Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA測(cè)序方法具體步驟為：
(a) 提取基因組DNA：針對(duì)不同的樣本來(lái)源選擇合適的DNA提取試劑盒提取微生物基因組DNA；
(b) Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物PCR 擴(kuò)增：以步驟(a) 中得到的基因組DNA為模板，與權(quán)利要求1 中設(shè)計(jì)得到的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每一種Barcode 特異性引物對(duì)應(yīng)一種待測(cè)樣本；
(c)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及定量：用割膠回收試劑盒或者PCR 純化試劑盒對(duì)步驟(b) 中得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收或純化，以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小分析，以Qubit? 2.0熒光計(jì)定量純化后的PCR 產(chǎn)物；
(d) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)：按定量結(jié)果，將每個(gè)純化后PCR產(chǎn)物等量混勻，按Ion Torrent DNA建庫(kù)試劑盒建庫(kù)。
(d) 文庫(kù)片段大小和濃度檢測(cè)：以安捷倫2100 生物分析儀對(duì)文庫(kù)片段大小和濃度進(jìn)行檢測(cè)。
(e) Ion Torrent高通量測(cè)序：用高通量測(cè)序儀對(duì)步驟(c) 中純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)Ion Torrent 16S rRNA測(cè)序引物中的barcode序列將測(cè)序結(jié)果分為不同的樣本組；
(f)序列分析：利用mothur 軟件包對(duì)PGM產(chǎn)生的高通量序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。