本發(fā)明涉及一種體外人工獲得細(xì)菌耐藥菌株的方法，屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，細(xì)菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)。耐藥菌的不斷增加，給人和動物疾病的治療帶來了極大困難。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播，引起了全世界的普遍關(guān)注，被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是21世紀(jì)最大的公共衛(wèi)生安全問題之一。因此，對細(xì)菌耐藥性的檢測監(jiān)測和評價就非常必要且十分迫切。細(xì)菌耐藥性的研究方法包括藥物敏感性實驗、質(zhì)粒消除實驗及質(zhì)粒指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、PCR技術(shù)、RT-PCR、基因芯片技術(shù)等。以上技術(shù)所用研究對象除從臨床分離的耐藥菌株外，還通過體外人工誘導(dǎo)來獲得耐藥菌株，現(xiàn)較通用的是肉湯傳代誘導(dǎo)方法。該法原理主要是讓細(xì)菌在抗生素亞抑菌濃度的環(huán)境下持續(xù)傳代培養(yǎng)，至細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)變?yōu)樵瓉?倍時，誘導(dǎo)結(jié)束。該法具有一定的局限性，主要表現(xiàn)在：①刺激細(xì)菌的亞抑菌濃度為人為設(shè)定，不同的濃度帶來的實驗結(jié)果不同，實驗條件不易控制；②抗生素MIC含量極少，在配制過程中易出現(xiàn)誤差，對實驗結(jié)果影響較大；③每傳代一次均要配制一定濃度的細(xì)菌液，一是繁瑣，二是易出現(xiàn)誤差；④在判斷細(xì)菌誘導(dǎo)后的耐藥程度時需要將細(xì)菌轉(zhuǎn)種到固體平板上觀測抑菌圈或測定MIC，實驗環(huán)節(jié)多；⑤誘導(dǎo)周期較長。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種體外人工獲得細(xì)菌耐藥菌株的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種體外人工獲得細(xì)菌耐藥菌株的方法，該方法包括如下步驟：a、制備載有待測藥物的載體，所述載體可吸收水分；b、檢測所篩選細(xì)菌的培養(yǎng)前最小抑菌濃度值；c、將所篩選細(xì)菌涂布在平板培養(yǎng)基上，并將載有待測藥物的載體放置于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)細(xì)菌，載有待測藥物的載體上形成抑菌圈；d、在c步驟獲得的抑菌圈邊緣0.5～4mm有菌區(qū)域內(nèi)取菌，并重復(fù)c步驟；e、檢測每次培養(yǎng)細(xì)菌的最小抑菌濃度值，當(dāng)檢測培養(yǎng)細(xì)菌最小抑菌濃度值達(dá)到4倍誘導(dǎo)前的培養(yǎng)前最小抑菌濃度值時，得耐藥細(xì)菌模型。進(jìn)一步，步驟a所述載體為紙質(zhì)的，所述藥物均勻分布于載體；更進(jìn)一步，所述載體為市售標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片或按如下方法制備的含藥紙片:將定性濾紙制作成5-10mm的圓形濾紙片，裝入青霉素小瓶內(nèi)，瓶口封嚴(yán)，高壓滅菌，烘干備用；將抗菌藥物配制成藥液，放入裝有濾紙的小瓶內(nèi)，使紙片充分浸透藥液，烘干后密封備用。進(jìn)一步，步驟c培養(yǎng)溫度為30～40℃，相對濕度為50～60％，培養(yǎng)時間為18～24小時；更進(jìn)一步，培養(yǎng)溫度為35℃，相對濕度為50％，培養(yǎng)時間為20小時。進(jìn)一步，步驟d取菌區(qū)域為抑菌圈邊緣0.8～3mm；更進(jìn)一步，為抑菌圈邊緣1～2mm。本發(fā)明所述待測藥物為抗生素或具有抗菌作用的中藥單方、復(fù)方水煎液、提取物或單體成分。本發(fā)明方法適用于大部分需氧菌和厭氧菌及單細(xì)胞真菌，包括腸桿菌科細(xì)菌、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬細(xì)菌、腸球菌屬細(xì)菌、嗜血桿菌屬細(xì)菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌和其他鏈球菌。本發(fā)明的有益效果在于：1、根據(jù)不同細(xì)菌對不同抗生素產(chǎn)生耐藥變異的程度亦各有不同的特性，可以快速檢驗?zāi)骋豢股匦滤帉δ姆N細(xì)菌存在產(chǎn)生耐藥的可能性及耐藥程度，進(jìn)而預(yù)測該藥在臨床上的應(yīng)用前景。2、本發(fā)明方法在0代至N代做到全程監(jiān)控，可以檢測細(xì)菌在不同MIC時的生物學(xué)性狀、生化代謝及結(jié)構(gòu)上的的差異，為更深入探討細(xì)菌耐藥的形成過程提供了方法上的支持。3、本發(fā)明利用紙片誘導(dǎo)法體外獲得細(xì)菌耐藥模型，一方面單純驗證了此方法；另一方面為建立細(xì)菌多重耐藥模型打下實驗基礎(chǔ)，為涉及細(xì)菌耐藥的相關(guān)研究提供一條新的途徑。4、與傳統(tǒng)肉湯傳代誘導(dǎo)法對比，本發(fā)明方法在實驗環(huán)節(jié)、條件控制、結(jié)果判定及人力物力的投入上，均有較大的優(yōu)勢。另外，誘導(dǎo)濃度是細(xì)菌為生存而自我選擇，且隨傳代這一濃度為逐漸變大的變量，有利于細(xì)菌耐藥的快速形成，從而獲得耐藥菌株模型。實施例11材料菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，大腸埃希菌(ATCC25922)，銅綠假單胞菌(ATCC25922)，經(jīng)復(fù)蘇后傳至第二代，4℃保藏備用。培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂，用于培養(yǎng)保存細(xì)菌；MHA(Mueller-HintonAgar)，用于檢測細(xì)菌MIC；MHB(Mueller-HintonBroth)，用于細(xì)菌的傳代誘導(dǎo)。平板直徑為9cm，培養(yǎng)基厚度約4至5mm。抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：檢測細(xì)菌MIC。用無菌PBS稀釋為1mg/ml，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。含藥紙片：市售亞胺培南含藥紙片，頭孢他啶含藥紙片。與抗生素標(biāo)準(zhǔn)品同種類，-20℃保存?zhèn)溆谩?實驗方法含藥紙片誘導(dǎo)某一細(xì)菌之前，用肉湯稀釋法檢測該菌的MIC，此為0代細(xì)菌的MIC；用接種環(huán)取一環(huán)細(xì)菌均勻涂布在MH平板上，放置含抗生素紙片于培養(yǎng)基表面，37℃、50～60％濕度的環(huán)境下培養(yǎng)18～24h(此為誘導(dǎo)第1代)；在距離抑菌圈邊緣1～2mm有菌區(qū)域內(nèi)取一環(huán)菌，重復(fù)1代的操作至N代；在誘導(dǎo)傳代的同時，用肉湯稀釋法檢測每代細(xì)菌的MIC，當(dāng)測試菌的MIC達(dá)到4倍誘導(dǎo)前的MIC時，判定誘導(dǎo)成功；也可參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)中的耐藥范圍，測量抑菌圈直徑。3實驗結(jié)果3.1金黃色葡萄球菌(ATCC25923)耐藥結(jié)果結(jié)果見表1。當(dāng)金黃色葡萄球菌在亞胺培南持續(xù)刺激下傳代至29代時，MIC值由0.5μg/ml提高到8μg/ml，誘導(dǎo)后的MIC值是誘導(dǎo)前的16倍，但誘導(dǎo)過程中MIC值有3次反復(fù)；該菌在頭孢他啶持續(xù)刺激下傳代至21代時，MIC值由7.81μg/ml提高到15.62μg/ml，是誘導(dǎo)前MIC值的2倍，在誘導(dǎo)過程中有1次反復(fù)。誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌耐藥時，頭孢他啶較亞胺培南MIC值反復(fù)次數(shù)少，在抗生素對倍稀釋的濃度梯度下平臺期相對較長；但達(dá)到4倍誘導(dǎo)前MIC值時所需要的傳代次數(shù)，亞胺培南少于頭孢他啶。表1本發(fā)明方法體外誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌耐藥不同代數(shù)的MIC(μg/ml)誘導(dǎo)代數(shù)0代1～2代3～7代8～10代11～14代亞胺培南0.510.512誘導(dǎo)代數(shù)0代1～9代10～11代11～20代21～22代頭孢他啶7.817.813.917.8115.62誘導(dǎo)代數(shù)15代16代17代18～28代29～30代亞胺培南424283.2大腸埃希菌(ATCC25922)耐藥結(jié)果結(jié)果見表2。當(dāng)大腸埃希菌在亞胺培南持續(xù)刺激下傳代至29代時，MIC值由0.5μg/ml提高到8μg/ml，是誘導(dǎo)前MIC值的16倍，但誘導(dǎo)過程中MIC值有2次反復(fù)；該菌在頭孢他啶持續(xù)刺激下傳代至8代時，MIC值由0.031μg/ml提高到0.125μg/ml，是誘導(dǎo)前MIC值的4倍，在誘導(dǎo)過程中有1次反復(fù)。誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥時，頭孢他啶較亞胺培南MIC值反復(fù)次數(shù)少，8代后MIC值無變化；達(dá)到4倍誘導(dǎo)前MIC值時所需要的傳代次數(shù)，頭孢他啶少于亞胺培南。表2本發(fā)明方法體外誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥不同代數(shù)的MIC(μg/ml)誘導(dǎo)代數(shù)0代1～7代8～10代11代12～14代15～28代29～30代亞胺培南0.50.512128誘導(dǎo)代數(shù)0代1～4代5代6～7代8～22代頭孢他啶0.0310.0620.1250.0620.1253.3銅綠假單胞菌(ATCC25922)耐藥結(jié)果結(jié)果見表3。銅綠假單胞菌在亞胺培南持續(xù)刺激下傳代至3代時，MIC值由8μg/ml提高到32μg/ml，是誘導(dǎo)前MIC值的4倍，4代至8代MIC值為誘導(dǎo)前的8倍，且無反復(fù)；該菌在頭孢他啶持續(xù)刺激下，4代之前MIC無變化，傳至5代時MIC值由0.5μg/ml直接躍至7.81μg/ml，是誘導(dǎo)前MIC值的14倍，且繼續(xù)誘導(dǎo)傳代至10代時，MIC值仍在提高。兩種抗生素誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥時，MIC值無反復(fù)現(xiàn)象；亞胺培南達(dá)到4倍誘導(dǎo)前MIC值時所需要的傳代次數(shù)少于頭孢他啶，但頭孢他啶經(jīng)過誘導(dǎo)傳代后，MIC值提高幅度大于亞胺培南。表3本發(fā)明方法體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥不同代數(shù)的MIC(μg/ml)誘導(dǎo)代數(shù)0代1代2代3代4代5代6代7代8代9代10代亞胺培南816163264646464頭孢他啶0.50.50.50.50.57.817.8115.6215.6215.6231.253.4不同誘導(dǎo)代數(shù)細(xì)菌抑菌圈直徑與MIC的關(guān)系(以銅綠假單胞菌為例)結(jié)果見表4。銅綠假單胞菌經(jīng)亞胺培南和頭孢他啶連續(xù)誘導(dǎo)傳代后，抑菌圈直徑隨傳代次數(shù)增加逐漸變小，而MIC為增高趨勢。亞胺培南抑菌圈變小明顯，誘導(dǎo)至7代時抑菌圈直徑為0；而相對應(yīng)的MIC值在4代以后呈較穩(wěn)定的態(tài)勢。頭孢他啶抑菌圈減小的程度較亞胺培南弱，且所需要的傳代次數(shù)多。2種抗生素在抑菌圈和MIC兩者數(shù)據(jù)變化上均表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。見表4。表4銅綠假單胞菌不同代數(shù)抑菌圈直徑mm與MICμg/ml的關(guān)系實施例2本發(fā)明方法與肉湯傳代誘導(dǎo)法的比較肉湯傳代誘導(dǎo)法：實驗方法：接種10μl0.5麥?zhǔn)蠞舛葘嶒灳昃河?/4MIC抗生素濃度營養(yǎng)肉湯內(nèi)，于35℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時為一代，后由該培養(yǎng)基中取第一代菌液稀釋為上述濃度后繼續(xù)傳至下一相同的培養(yǎng)肉湯中……如此重復(fù)傳代，傳代同時用紙片法測量并記錄每代轉(zhuǎn)種菌株的抑菌環(huán)直徑，根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究院(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判斷是否出現(xiàn)耐藥。出現(xiàn)耐藥時，再精確測量該代菌的MIC值，若誘導(dǎo)后MIC值>4倍誘導(dǎo)前MIC，則判定誘導(dǎo)成功。亞胺培南對大腸埃希菌的誘導(dǎo)結(jié)果結(jié)果見表5。大腸埃希菌在1/4MIC抗生素濃度環(huán)境下進(jìn)行連續(xù)傳代，傳至29代后，該菌對亞胺培南的MIC達(dá)到誘導(dǎo)前的4倍。而根據(jù)實施例1表2的結(jié)果，采用本發(fā)明方法傳代至11代時大腸埃希菌對亞胺培南的MIC就達(dá)到誘導(dǎo)前的4倍。表5亞胺培南體外誘導(dǎo)大腸埃希菌耐藥不同代數(shù)的MIC(μg/ml)誘導(dǎo)代數(shù)0代1～5代6～15代15～28代29～35代MIC0.50.5112亞胺培南對銅綠假單胞菌的誘導(dǎo)結(jié)果結(jié)果見表6。銅綠假單胞菌在1/4MIC抗生素濃度環(huán)境下進(jìn)行連續(xù)傳代，傳至11代后，該菌對亞胺培南的MIC達(dá)到誘導(dǎo)前的4倍。而根據(jù)實施例1表3的結(jié)果，采用本發(fā)明方法傳代至3代時銅綠假單胞菌對亞胺培南的MIC就達(dá)到誘導(dǎo)前的4倍。表6亞胺培南體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥不同代數(shù)的MIC(μg/ml)誘導(dǎo)代數(shù)0代1～3代4～10代11～15代MIC881632通過上述實驗可以看出本發(fā)明相對于肉湯傳代誘導(dǎo)法存在明顯優(yōu)勢，詳見表7。表7本發(fā)明方法相對于肉湯法的優(yōu)勢因此，本發(fā)明方法較肉湯傳代誘導(dǎo)法，在實驗環(huán)節(jié)、條件控制、結(jié)果判定及人力物力的投入上，均有較大的優(yōu)勢。另外，誘導(dǎo)濃度是細(xì)菌為生存而自我選擇，且隨傳代這一濃度為逐漸變大的變量，有利于細(xì)菌耐藥的快速形成，從而獲得耐藥菌株模型。實施例3中藥類含藥紙片制備方法本發(fā)明方法選用市售標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片進(jìn)行誘導(dǎo)，也可以采用自制藥敏紙片進(jìn)行誘導(dǎo)，自制藥敏紙片方法如下：用打孔器將新華1號定性濾紙制作成6mm的圓形濾紙片，50片一包裝，裝入青霉素小瓶內(nèi)，用單層牛皮紙封口高壓滅菌(121℃，15～20min)，烘干備用。將中藥(水煎劑、提取物或單體)配制成一定濃度的藥液，將一定量藥液放入裝有50片濾紙的小瓶內(nèi)，使紙片充分浸透藥液，37℃，24～36h，烘干后密封備用。保持干燥或冷凍保藏。根據(jù)50片濾紙吸收藥液總量，計算出每個濾紙片藥物含量。當(dāng)前第1頁1 2 3