本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及AtCIPK23基因在提高植物耐低鐵能力中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵(Fe)是人類必需的礦物質(zhì)，對人體健康具有重要意義。我國是世界上鐵缺乏和缺鐵性貧血發(fā)生較嚴重的國家(胡繁榮，2004)。因此從人類賴以生存的食物著手，提高植物的鐵吸收能力將為改善人類鐵營養(yǎng)提供有效途徑。鐵是植物生長必需的微量元素，參與植物光合、呼吸等多種代謝過程。雖然土壤中鐵元素的含量較高，但是土壤中的鐵經(jīng)常以氧化物的形式存在，不能被植物吸收利用(Guerinot and Yi,1994)。因此，土壤中有效鐵的含量較低，限制植物的生長和體內(nèi)鐵的累積。植物鐵吸收的下降不僅直接影響植物體內(nèi)鐵含量，還通過降低葉綠素含量，抑制碳的同化，導(dǎo)致產(chǎn)量下降(Marschner 1995)。

植物為適應(yīng)土壤缺鐵環(huán)境，形成一系列的適應(yīng)策略來提高鐵的吸收利用。根據(jù)植物對鐵吸收利用策略的不同，可以將不同植物劃分為機理Ⅰ植物和機理Ⅱ植物(Marschner 1995)。機理Ⅰ植物主要包括雙子葉和非禾本科單子葉植物，如大豆、花生、黃瓜、向日葵等(Marschner 1995)。在缺鐵的條件下，這類植物首先通過激活根部皮層細胞質(zhì)膜上特異的H⁺-ATPase，酸化根際空間，提高土壤中鐵的可溶性。然后，可溶性的Fe(Ⅲ)-鰲合物被還原酶FRO還原成Fe(Ⅱ)，經(jīng)Fe(Ⅱ)載體IRT1轉(zhuǎn)運吸收。機理II植物主要包括禾本科植物，在土壤鐵缺乏時，這類植物向根際空間分泌大量的植物鐵載體(phytosiderophore，PS)。鐵載體實際上是一種對Fe(Ⅲ)具有高親合力的鰲合劑，由麥根酸類(Mugineicacids，MAs)家族成員組成(and.Marschner 1986)。由于機理I植物的根系將Fe³⁺還原成Fe²⁺是鐵吸收的限速步驟，所以與機理II植物相比，機理I植物的鐵吸收能力較差。例如，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，花生、大豆等往往比小麥、玉米等表現(xiàn)明顯的缺鐵癥狀。因此，提高機理I植物的鐵吸收能力，增加其體內(nèi)鐵元素的含量是一項極其重要和有意義的工作。

為揭示植物的鐵吸收調(diào)控機理，采用多種方式探尋植物鐵高效利用關(guān)鍵基因。其中對已知其它功能的基因進行缺鐵響應(yīng)研究就是其中一種篩選方式。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtCIPK23基因通過作用根系鉀通道蛋白和硝酸根轉(zhuǎn)運蛋白參與調(diào)節(jié)鉀離子(Xu et al.,2006)和硝態(tài)氮吸收(Ho et al.,2009)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供如下1)-4)任一一種生物材料的用途。

本發(fā)明提供的如下1)-4)任一一種生物材料在調(diào)控植物抗低鐵脅迫能力中的應(yīng)用；

1)AtCIPK23蛋白；

2)AtCIPK23蛋白編碼基因；

3)含有AtCIPK23蛋白編碼基因的重組載體；

4)含有AtCIPK23蛋白編碼基因的表達盒、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞；

所述AtCIPK23蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗低鐵脅迫為提高植物抗低鐵脅迫能力。

上述應(yīng)用中，所述低鐵為體系中的三價鐵離子濃度低于0.5μM。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物。

本發(fā)明另一個目的是提供如下1)-4)任一一種生物材料另一個用途。

本發(fā)明提供的如下1)-4)任一一種生物材料在培育抗低鐵脅迫轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；

1)AtCIPK23蛋白；

2)AtCIPK23蛋白編碼基因；

3)含有AtCIPK23蛋白編碼基因的重組載體；

4)含有AtCIPK23蛋白編碼基因的表達盒、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞；

所述AtCIPK23蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；

所述低鐵為體系中的三價鐵離子濃度低于0.5μM。

本發(fā)明第三個目的是提供一種培育抗低鐵脅迫轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將AtCIPK23蛋白編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗低鐵脅迫能力大于所述目的植物；

所述AtCIPK23蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。

上述方法中，所述植物為雙子葉植物；

所述AtCIPK23蛋白編碼基因通過重組載體導(dǎo)入目的植物；

所述重組載體為將所述AtCIPK23蛋白編碼基因插入表達載體得到的載體；

上述AtCIPK23蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1或序列1第19-1467位核苷酸。

上述轉(zhuǎn)基因植物的抗低鐵脅迫能力大于所述目的植物體現(xiàn)在如下1)-4)中至少一種：

1)在低鐵脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量高于所述目的植物；

2)在低鐵脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因植物的地上鮮重高于所述目的植物；

3)在低鐵脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因植物的鐵吸收能力高于所述目的植物；

4)在低鐵脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因植物的根系三價鐵還原酶活性高于所述目的植物。

所述低鐵為體系中的三價鐵離子濃度低于0.5μM。

抑制AtCIPK23蛋白編碼基因表達的物質(zhì)在降低植物抗低鐵脅迫能力中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。

上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物；

所述低鐵為體系中的三價鐵離子濃度低于0.5μM。

上述三價鐵離子均為Fe³⁺-EDTA的形態(tài)存在在體系中。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過對AtCIPK23基因突變體lks與其野生型擬南芥(WT)進行比較研究，發(fā)現(xiàn)AtCIPK23基因突變體lks對鐵缺乏表現(xiàn)敏感，即在低鐵環(huán)境下lks表現(xiàn)明顯的葉片黃化，lks葉片和籽粒鐵含量比野生型低，lks根系較低的三價鐵還原酶(FCR)活性導(dǎo)致其鐵吸收能力低于野生型。將AtCIPK23基因進行表表達，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥，其在低鐵脅迫下，葉片鐵含量比野生型高，三價鐵還原酶(FCR)活性比野生型高，鐵吸收能力比野生型高，證明AtCIPK23基因可提高植物抗低鐵脅迫。

附圖說明

圖1為AtCIPK23基因突變體lks對鐵缺乏的響應(yīng)

圖2為AtCIPK23基因突變體lks葉片和籽粒鐵含量

圖3為AtCIPK23基因突變體lks根系三價鐵還原酶(FCR)活性

圖4為超表達AtCIPK23基因株系A(chǔ)tCIPK23表達量

圖5為超表達AtCIPK23基因植株對低鐵脅迫的耐受力

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中涉及定量檢測的，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

下述實施例中所用的AtCIPK23基因突變體lks記載在如下文獻中：Xu J,Li HD,Chen LQ,Wang Y,Liu LL,He L,Wu WH.A protein kinase,interacting with two calcineurin B-like proteins,regulates K⁺transporter AKT1in Arabidopsis.Cell.2006.125:1347-1360，該論文公布了AtCIPK23基因突變體lks1-2和lks1-3的詳細信息，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。

AtCIPK23基因突變體lks1-2和lks1-3與野生型擬南芥col-0的區(qū)別僅在于基因組中的AtCIPK23基因發(fā)生EMS誘導(dǎo)點突變和t-DNA插入突變，其余基因與野生型一致。

AtCIPK23基因編碼區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1第19-1467位，其編碼的蛋白AtCIPK23的氨基酸序列為序列表中序列2。

供鐵瓊脂糖培養(yǎng)基或鐵充足培養(yǎng)基配方為：3mM MgCl₂,0.25mM(NH₄)₂SO₄,1mM Ca(NO₃)₂,2mM KCl,2.75mM CaCl₂,0.18mM KH₂PO₄,50μM H₃BO₃,50μM MnSO₄,15μM ZnSO₄,0.05μM CuSO₄,0.5μM Na₂MoO₄,0.05μM CoCl₂，0.8％蔗糖，0.7％瓊脂糖，50μM Fe³⁺-EDTA(Fe³⁺-EDTA是50μM FeSO₄、50μM Na₂·EDTA和水混合得到的溶液)和水；其中Fe³⁺-EDTA的濃度為50μM。

供低鐵培養(yǎng)基配方與鐵充足培養(yǎng)基基本一致，唯一不同的是Fe³⁺-EDTA的濃度為0.5μM。

實施例1、AtCIPK23基因敲除對植物表型影響

將AtCIPK23基因突變體lks1-2、lks1-3和野生型擬南芥col-0(WT，購買于Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC stocks,產(chǎn)品目錄號為CS60000)種子消毒，播種到供鐵瓊脂糖培養(yǎng)基(Fe³⁺-EDTA的濃度為50μM)中，4℃黑暗春化3天，移至人工氣候室中生長5天，然后將幼苗分別轉(zhuǎn)移到低鐵培養(yǎng)基(Fe³⁺-EDTA的濃度為0.5μM)和鐵充足培養(yǎng)基(Fe³⁺-EDTA的濃度為50μM)中生長5天，進行缺鐵處理。每個株系120個種子，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1)表型

觀察在低鐵或鐵充足的培養(yǎng)基中生長5天的植株表型，并收獲植株地上部，測定地上部生物量(指地上部分干重)和葉綠素含量。

葉綠素測定方法：葉片剪下稱鮮重，放入5毫升離心管中，加入2毫升80％丙酮，用薄膜封口，以防液體揮發(fā)，提取過夜，浸提液用分光光度計在663nm and 645nm下測定吸光值，葉綠素含量通過公式8.02A663+20.21A645計算。

結(jié)果如圖1所示，a為不同株系在低鐵(-Fe)和鐵充足(+Fe)條件下的生長表型；b為不同株系在低鐵和鐵充足條件下的地上部生物量，c為不同株系在低鐵和鐵充足條件下的葉綠素含量；可以看出，在鐵充足條件下，AtCIPK23基因突變體lks的生長與野生型沒有差異，然而在鐵缺乏條件下，lks葉片出現(xiàn)典型的缺鐵癥狀：葉片黃化，葉綠素降低，生物量下降。與野生型相比，lks突變體對缺鐵表現(xiàn)更敏感，表明AtCIPK23參與植物鐵營養(yǎng)。

2)葉片和籽粒鐵含量檢測

將在低鐵培養(yǎng)基中生長5天的AtCIPK23基因突變體lks1-2、lks1-3和野生型擬南芥col-0(WT)葉片和種子經(jīng)過超純水沖洗干凈，在105℃烘箱中殺青半小時，然后在75℃烘干，粉碎，用1mL HNO₃在130-140℃高壓罐硝化，硝化液經(jīng)過轉(zhuǎn)移、稀釋、定容，過濾；在上機檢測之前，首先利用鐵的標準溶液(購買于國家標準物質(zhì)中 心)，通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測標準溶液中的鐵濃度，制作鐵標準曲線，然后通過ICP-OES測定消化液中的鐵濃度。

結(jié)果如圖2所示，a為葉片中鐵含量，b為籽粒中鐵含量，可以看出，AtCIPK23基因突變體lks1-2、lks1-3葉片和籽粒中的鐵含量顯著低于野生型，表明AtCIPK23有利于植物葉片和籽粒鐵的累積。

3)、根系三價鐵還原酶(FCR)活性檢測

將上述在低鐵和鐵充足培養(yǎng)基中生長5天的AtCIPK23基因突變體lks1-2、lks1-3和野生型擬南芥col-0用蒸餾水沖洗干凈，轉(zhuǎn)移至含有2mL三價鐵還原反應(yīng)液(pH5.0)的離心管中，每管放15-20株幼苗，只將根系浸入反應(yīng)液中，在人工氣候室中反應(yīng)1小時。收獲幼苗根系并稱重。反應(yīng)液離心后，用分光光度計測定562nm波長的吸光值。

反應(yīng)液成分主要包括：營養(yǎng)液中的大量元素，100μM Fe³⁺-EDTA和100μM的啡咯秦，配方為：3mM MgCl₂,0.25mM(NH₄)₂SO₄,1mM Ca(NO₃)₂,2mM KCl,2.75mM CaCl₂,0.18mM KH₂PO₄、100μM Fe³⁺-EDTA和100μM的啡咯嗪。

三價鐵還原酶活性即為單位根鮮重在單位時間內(nèi)將Fe³⁺還原為Fe²⁺的量。

結(jié)果如圖3所示，可以看出，無論在正常供鐵，還是在鐵缺乏條件下，AtCIPK23基因突變體lks1-2、lks1-3根系的FCR活性都顯著低于野生型，表明AtCIPK23有利于調(diào)高根系FCR活性，促進鐵的吸收。

實施例2、AtCIPK23基因過表達提高植物抗低鐵脅迫

一、轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥的構(gòu)建

1、AtCIPK23超表達重組載體的構(gòu)建

根據(jù)AtCIPK23的編碼區(qū)序列設(shè)計5’端引物：5’-CGTAGTTGGAATAGGTTCATGGCTTCTCGAACAACGCC-3’(下劃線為編碼區(qū))，3’端引物：5’-CCAGTATGGAGTTGGGTTCTTATGTCGA CTGTTTTGC-3’(下劃線為編碼區(qū))。

剪取約0.2g野生型擬南芥幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800μL新配制的提取緩沖液(0.1M pH8.0Tris-HCl；50mM EDTA；0.5M NaCl；1％SDS；1％β-巰基乙醇)，劇烈振蕩使其全部懸??；65℃水浴溫育30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次；然后加入250μL預(yù)冷的5M乙酸鉀，立即顛倒混勻，冰上5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4℃12000rpm離心15分鐘,棄去上清；沉淀用70％、100％乙醇各洗一次；干燥后，溶于20μL含100μg/mL RNase的ddH2O中，得到基因組DNA。

取2μL擬南芥基因組DNA溶液作為模板，用5’端引物和3’端引物進行PCR擴增，得到1524bp的PCR擴增產(chǎn)物，其核苷酸序列為序列1。

pPLV27載體記載在如下文獻中：De Rybel et al.Plant Physiology 2011.156:1292-1299，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。

pPLV27載體線性化：2-4μg pPLV27載體加入1μl HpaI酶在37℃酶切2h，線性化的pPLV27載體通過瓊脂糖凝膠純化，利用QIAEXII回收試劑盒回收。線性化的pPLV27載體加入0.5倍體積的醋酸銨(7.5M)和2.5倍體積的100％乙醇在-20℃沉淀過夜，然后12000g離心30min，棄除上清液，沉淀分別用100μl 70％的乙醇和100％乙醇洗一遍，沉淀進一步干燥，然后用50μl ddH2O溶解(50℃溶解5-10分鐘)。

pPLV27載體的T4處理：200-400ng的線性化載體，4μl 10×T4buffer，4μl100mM dCTP，2μl 100mM二硫蘇糖醇，0.4μl牛血清白蛋白，0.8μl T4DNA聚合酶，加ddH2O使體積達到40μl，混勻，12000g離心1分鐘，22℃孵育1小時，在75℃20分鐘，在12000g離心1分鐘，放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

重組載體的獲得：200-400ng的1524bp的PCR擴增產(chǎn)物，2μl 10×T4buffer，2μl 100mM dCTP，1μl 100mM二硫蘇糖醇，0.2μl牛血清白蛋白，0.4μl T4DNA聚合酶，1μl線性化的pPLV27載體，加ddH2O使體積達到20μl，混勻，12000g離心1分鐘，22℃孵育1小時，在75℃20分鐘，在12000g離心1分鐘，得到重組載體。

經(jīng)過測序，重組載體為將序列表中序列1所示的核苷酸插入pPLV27載體得到的載體，命名為pPLV27:AtCIPK23。

2、重組農(nóng)桿菌的制備

將重組載體pPLV27:AtCIPK23電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌C58中，得到重組農(nóng)桿菌，命名為C58/pPLV27:AtCIPK23(用5’端引物和3’端引物進行菌液PCR，得到6274bp產(chǎn)物的為陽性克隆)。

3、轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥的獲得

將上述重組農(nóng)桿菌C58/pPLV27:AtCIPK23接種于5mL YEB培養(yǎng)基(含125μg/mL的Rif，100μg/mL的Kan)中，28℃200rpm培養(yǎng)過夜；取0.5mL菌液轉(zhuǎn)移至50mL含有相同抗生素的YEB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，28℃200rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.2-1.6；5000rpm,離心10分鐘，收集菌體，重懸于相同體積的滲透緩沖液至OD₆₀₀＝0.8；取生長繁茂、花苞飽滿的野生型擬南芥植株，去除已有莢果后，浸染擬南芥的花蕾，將植物覆蓋一層保鮮膜，室溫暗培養(yǎng)24小時(注意保濕)后，揭開薄膜置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)；一周后用相同的方法浸染一次。

收取擬南芥的種子進行陽性苗篩選。收獲的轉(zhuǎn)基因種子表面消毒后均勻地鋪在含20μg/mL潮霉素的1/2MS篩選培養(yǎng)基上，4℃春化2天后，暗培養(yǎng)，25℃，3天后光照；把下胚軸明顯伸長、根系生長正常、且能形成真葉的小苗移栽到土中，轉(zhuǎn)入 溫室中培養(yǎng)；擬南芥生長至1個月大小時，剪取少量葉子提取DNA進行PCR鑒定，剔除不能擴出條帶的假陽性幼苗；成熟后分株收獲T1代種子；收取T1代的種子用同樣方法篩選，選取接近3:1的株系移栽；再收取T2代種子培養(yǎng)，得到T2代轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥。

上述滲透緩沖液組分包括：1/2MS大量，1/2MS微量，5％蔗糖，0.02％Silwet L-77。

4、Real-time PCR鑒定

提取編號為OE1-OE8的T2代轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，以AAGGGTCAGTTGGCAGTT和GTCCCGTGGTAAGGTTCT為引物，進行Real-time PCR擴增。

以AtActin11基因為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的擴增引物為：CCACATGCTATTCTGCGTTTGGACC和CATCCCTTACGATTTCACGCTCTGC。

以野生型擬南芥col-0(wt)為對照。

Real-time PCR反應(yīng)在Mx3000P Sequence Detection System上進行，每個基因每次設(shè)三個重復(fù)，定量PCR分析通過SYBR Green熒光染料與DNA雙鏈(目的片段的PCR產(chǎn)物)結(jié)合，并利用實時定量PCR檢測儀在72℃步驟檢測熒光強度，來判定PCR產(chǎn)物的量。因為每個樣品中RNA含量不同，樣品中的cDNA的量需用同一個樣品所檢測到的Actin cDNA的含量來確定。

上述定量PCR反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件為：95℃10min；[95℃30sec，55℃30sec，72℃30sec]×40個循環(huán)。

結(jié)果如圖4所示，可以看出，與野生型擬南芥(WT)相比，編號為OE1-OE8的T2代轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥植株的AtCIPK23基因相對表達量高于野生型擬南芥，為陽性轉(zhuǎn)基因植物。

采用同樣的方法將空載體pPLV27轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥，播種，培育得到T2代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。

二、轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥對低鐵脅迫耐受力的檢測

將野生型擬南芥和編號為OE6和OE7的T2代轉(zhuǎn)AtCIPK23擬南芥種子消毒，播種到供鐵的瓊脂糖培養(yǎng)基中，4℃黑暗春化3天，移至人工氣候室中預(yù)培養(yǎng)5天，然后將幼苗分別轉(zhuǎn)移到低鐵(-Fe)和鐵充足(+Fe)的培養(yǎng)基中生長5天進行缺鐵處理。

以T2代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對照。

每個株系120個種子，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1)表型

方法與實施例1的1)相同，結(jié)果如圖5a和5b所示，a為不同株系在低鐵和鐵充足條件下的生長表型；b為不同株系在低鐵和鐵充足條件下的葉綠素含量；可以看出，低鐵脅迫下，與對照植株相比，超表達AtCIPK23株系葉片顏色較綠，葉綠素含量較高，表明AtCIPK23超表達提高植物的耐低鐵能力。

T2代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥無顯著差異。

2)葉片鐵含量檢測

方法與實施例1的2)相同，結(jié)果如圖5d所示，為不同株系在低鐵和鐵充足條件下葉片中的鐵含量，可以看出，在低鐵脅迫下，AtCIPK23超表達株系葉片的鐵含量較對照植株高，表明AtCIPK23超表達提高植物的鐵吸收能力。

T2代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥無顯著差異。

3)根系三價鐵還原酶檢測

方法與實施例1的3)相同，結(jié)果如圖5c所示，為不同株系在低鐵條件下根系三價鐵還原酶(FCR)活性，在低鐵條件下，AtCIPK23超表達植株根系FCR活性顯著高于對照植株。

T2代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥無顯著差異。