本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量測定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是哺乳動物體內(nèi)廣泛分布的一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，其主要生理功能是負(fù)責(zé)代謝內(nèi)源性的神經(jīng)遞質(zhì)(如腎上腺素，去甲腎上腺素以及多巴胺等)和外源性的兒茶酚類藥物(如卡比多巴，芐絲肼，阿撲嗎啡，多巴酚丁胺，非諾多泮，α-甲基-L-DOPA，異丙腎上腺素和利米特羅等)。在人體中，COMT酶有兩種存在形式，一種是溶解性的COMT(S-COMT)，另一種是膜結(jié)合型的COMT(MB-COMT)。COMT在人體的多種組織中都有分布，如肝臟，腎臟，肺等，在人體的大腦中，主要存在于突觸后神經(jīng)元。在人體的大多數(shù)組織中，S-COMT的量是MB-COMT的3-4倍左右。在人腦中，COMT酶主要以MB-COMT的形式存在，占總量的70％，S-COMT占30％。

COMT酶的活性在人體中呈基因多態(tài)性，分別表現(xiàn)為低活性(COMT^LL)，中等活性(COMT^LH)和高活性(COMT^HH)。有研究表明，人體中的COMT活性和疼痛，乳腺癌及一些精神類疾病都有相關(guān)性。當(dāng)人腦中的COMT活性偏高時，大腦中前額葉皮質(zhì)中的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺清除增加，認(rèn)知能力削弱，導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生；而大腦中的COMT活性偏低時，則容易造成強(qiáng)迫癥，焦慮癥，恐慌癥以及對疼痛的敏感。當(dāng)人乳腺中COMT活性偏低時，雌二醇等雌激素?zé)o法代謝，其高暴露直接導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。因此，定量測定人體組織及細(xì)胞中的COMT活性對于多種疾病的臨床診斷和治療具有重要指導(dǎo)意義。另外，由于COMT還是帕金森病治療的一個重要靶點(diǎn)，利用COMT定量評價方法并借助體 外代謝孵育體系可高通量的篩選和評價COMT抑制劑，對于帕金森病治療藥物的發(fā)現(xiàn)意義重大。

目前，最常用的COMT酶活性的檢測方法是采用原兒茶酸，左旋多巴，多巴胺或腎上腺素作為底物，利用高效液相色譜或質(zhì)譜對其甲基化產(chǎn)物進(jìn)行定量，從而評估COMT酶的活性。由于色譜或質(zhì)譜方法成本昂貴，樣品分析時間較長，因此難以實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測。此外，以上檢測方法中所用的探針底物包括原兒茶酸在哺乳動物COMT酶的催化下分別生成兩個單甲基化產(chǎn)物，而兩個產(chǎn)物由于結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相近，在液相色譜上通常難以分離，給其定量檢測帶來了不便。因此，急需尋找定量方便，檢測靈敏的COMT酶活性評價方法。

目前，COMT的體外評價體系主要包括哺乳動物的紅細(xì)胞，以及亞細(xì)胞組分等，其中亞細(xì)胞組分主要包括肝臟組織的S9、胞漿以及腦組織勻漿等成分。采用這些標(biāo)準(zhǔn)化的評價體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子(SAM)和孵育條件，可通過檢測探針底物的代謝清除或產(chǎn)物生成速率，對上述各種體系中表達(dá)的COMT酶活性進(jìn)行表征。

本發(fā)明中所用的COMT底物DHMC具有代謝產(chǎn)物單一(8-MHMC)、代謝產(chǎn)物易于檢測且靈敏度高等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種定量測定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用，該方法中所用的探針底物沒有熒光發(fā)射，而甲基化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，熒光量子產(chǎn)率較高易于檢測。利用該方法可對多種生物體系中COMT的分布和功能進(jìn)行定量評價。

一種檢測兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括5種試劑：A液、B液、C液、D液和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；

所述A液為100mM的Tris-HCl，pH＝7.0～9.0；.

所述B液為100mM鎂離子，4mM甲基供體以及40mM二硫蘇糖醇混合物，溶劑為水；

所述C液為0.1～10mM的DHMC溶液，溶劑為甲醇、乙腈、二甲基亞砜中任意一種；

所述D液為乙腈或甲醇；

所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為1mg/ml的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)水溶液。

一種檢測兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒的使用方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)預(yù)孵育：將待測樣品與A液和B液混勻，20～60度下孵育3～5分鐘；

(2)起始反應(yīng)：加入B液混勻，20～60度下孵育10～120分鐘；

(3)終止反應(yīng)：加入C液，劇烈震蕩10秒；

(4)檢測：離心后取上清于酶標(biāo)儀或生化儀檢測熒光值，檢測條件為：激發(fā)波長335nm，發(fā)射波長520nm。

所述待測樣品為：包括重組表達(dá)COMT單酶、動物或人源細(xì)胞、動物或人源組織制備物。

一種檢測兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒用于COMT活性的快速定量檢測，以及該酶抑制劑的快速篩選與評估。

該試劑盒用于COMT活性的快速定量檢測的方法為：按照試劑盒的使用方法，通過定量檢測單位時間內(nèi)甲基化產(chǎn)物的生成量來測定不同樣本中COMT的活性。

該試劑盒用于COMT抑制劑的快速篩選與評估方法為：按照試劑盒的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物的生成量評 估該生物體系中COMT的殘余活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)COMT抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

所述生物體系為含有兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶或其突變體的各類體外生物樣品；包括重組表達(dá)COMT單酶、人或動物組織制備液、各類組織細(xì)胞等生物體系。

該試劑盒用于兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的快速定量檢測的方法采用DHMC所示為探針底物，該底物可被COMT酶特異性催化生成8-MHMC并在520nm處顯示熒光信號，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化可定量測定COMT的活性。

該試劑盒用于兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的快速篩選與評估方法以熒光底物DHMC甲基化反應(yīng)作為COMT的特異性探針反應(yīng)，按照試劑盒的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單位時間內(nèi)甲基化產(chǎn)物的生成量評估該生物體系中COMT的殘余活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)COMT抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

該試劑盒檢測原理是利用兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶能甲基化兒茶酚結(jié)構(gòu)的特性，設(shè)計(jì)一種探針其底物不具有熒光屬性，而其8-O-甲基化產(chǎn)物具有熒光屬性，可采用熒光檢測器實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的快速、靈敏檢測；8-O-甲基化產(chǎn)物熒光檢測條件為：激發(fā)波長335nm，最大發(fā)射波長為520nm(如圖2所示)，其檢測原理如圖1所示。

所述定量測定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性方法的應(yīng)用，該方法可用于各類體外生物樣品中COMT酶真實(shí)活力的定量評估，以及在誘導(dǎo)劑或激活劑存在條件下COMT酶殘余活性的定量測定，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

所述定量測定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性方法的應(yīng)用，該探針底物還可用于 評價不同種屬COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突變體的催化活性，進(jìn)而評估其代謝兒茶酚類藥物的能力。

該方法中的特異性探針底物為off-on型熒光探針，其在COMT活性檢測過程不易受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各種重組COMT、人及動物組織制備液及各類組織細(xì)胞中COMT酶活的定量測定；同時也可作為在體及動物整體COMT的探針底物，評估代謝酶COMT的個體及種屬差異。該方法中所用的8-O-甲基化代謝產(chǎn)物的熒光檢測方法還可用于COMT抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。

采用重組COMT單酶抑制實(shí)驗(yàn)(如圖6所示)，重組單酶代謝反應(yīng)，以及酶反應(yīng)動力學(xué)幾方面的證據(jù)，證明DHMC可特異性的經(jīng)COMT代謝，生成MDCHM。進(jìn)一步采用各種哺乳動物的新鮮提取的肝細(xì)胞﹑原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝切片﹑肝灌流等代謝評價體系進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)該檢測方法具有非常良好的靈敏性。

作為高靈敏性的COMT酶活性的定量檢測方法，該方法可以用來檢測COMT酶的活性，尤其適合用于對細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生產(chǎn)的COMT的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器官來源的S-9、胞漿等制備物中COMT的活性標(biāo)定。

選用本發(fā)明所述定量測定兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法檢測COMT酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢：靈敏度高、準(zhǔn)確度高、抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)、易于高通量檢測與抑制劑篩選等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1.COMT試劑盒原理；

圖2.加入COMT前后的熒光發(fā)射光譜圖(335激發(fā))；

圖3.COMT檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4.COMT時間標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果；

圖5.COMT酶促動力學(xué)測定結(jié)果；

圖6.COMT單酶中的化學(xué)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。

本發(fā)明所采用的設(shè)備及其型號為：熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由SynergyH1全功能微孔板檢測儀檢測完成。

COMT試劑盒原理如圖1所示。

實(shí)施例1

體外COMT的檢測下限測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，COMT單酶5ng/ml～100ng/ml加入A液90μl，分別加入B液10μl和C液100μl，總體積為200μL，37℃下孵育1h后通過酶標(biāo)儀分析，檢測條件：激發(fā)波長335nm，最大發(fā)射波長為520nm。用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心5分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測，每組的平均值與不加COMT的對照組比較，表明20和50ng的COMT有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，確定COMT的檢測下限為20ng(圖3)。

實(shí)施例2.

COMT時間標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，COMT單酶5ng/ml～100ng/ml加入A液90μl，分別加入B液10μl和C液100μl，總體積為200μL，37℃下孵育60min，每隔5分鐘酶標(biāo)儀分析，檢測條件：激發(fā)波長335nm，最大發(fā)射波長為 520nm。用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心5分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測，產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與孵育時間做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的R²＞0.99，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍寬廣，可準(zhǔn)確定量COMT的含量(圖4)。實(shí)施例3.

COMT動力學(xué)測定

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，COMT單酶5ng/ml～100ng/ml加入A液90μl，分別加入B液10μl和C液100μl，總體積為200μL，37℃下孵育30min，檢測條件：激發(fā)波長335nm，最大發(fā)射波長為520nm。用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心5分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測，將所獲熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到COMT對DHMC的Km和Vmax以及Eadie-Hofstee圖(圖5)。

實(shí)施例4.

COMT抑制實(shí)驗(yàn)測定；

實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，COMT單酶5ng/ml～100ng/ml加入A液88μl，分別加入B液10μl和C液100μl，托卡朋250μM與DMSO分別加2μl，總體積為200μL，37℃下孵育30min，檢測條件：激發(fā)波長335nm，最大發(fā)射波長為520nm。用高速冷凍離心機(jī)在4℃，20,000×g的條件下，高速離心5分鐘后，取上清，進(jìn)行熒光檢測，2.5μM托卡朋殘留活性降低(圖6)。