本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生絲微菌及其發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法。

背景技術(shù)：

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone)，簡(jiǎn)稱PQQ，是第14種B族維生素。

吡咯喹啉醌的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

日本學(xué)者于2003年證實(shí)吡咯喹啉醌完全符合維生素特征，是一種新型的水溶性維生素，其研究成果發(fā)表于國(guó)際權(quán)威雜志《nature》上，這是55年來(lái)首次發(fā)現(xiàn)的最新的維生素。吡咯喹啉醌是一種新輔基，是繼黃素核苷酸(FMN，F(xiàn)AD)和煙酰胺核苷酸(MAD，NADP)之后，在膜束縛的細(xì)菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基。

吡咯喹啉醌化合物最先是從細(xì)菌中分出來(lái)的，隨后在動(dòng)、植物體內(nèi)也被發(fā)現(xiàn)了。已知能夠產(chǎn)生吡咯喹啉醌的生物包括有乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)、鞭毛甲基菌(Methylobacteriu flagellatum)、扭脫甲基桿菌(Methylobacterium Extorquens)、生絲微菌(Hyphomicrobium sp.)、食甲基菌(Methylovorus sp.)等，本發(fā)明人所獲得的吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌為生絲微菌(Hyphomicrobium sp.)?，F(xiàn)有技術(shù)中使用生絲微菌生產(chǎn)吡咯喹啉醌的發(fā)酵效價(jià)普遍偏低，US5344768(授權(quán)日1993年7月14日)報(bào)道用生絲微菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌，其發(fā)酵效價(jià)僅為7mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的需求。

吡咯喹啉醌具有預(yù)防和治療某些疾病等生物學(xué)功能。在原核生物、植物和哺乳動(dòng)物中， 都廣泛存在著吡咯喹啉醌，它不僅是許多酶的輔基，在酶促反應(yīng)中擔(dān)負(fù)著傳遞電子、質(zhì)子和化學(xué)基團(tuán)的功能，也能刺激微生物的生長(zhǎng)，植物花粉的萌發(fā)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

近年來(lái),對(duì)于吡咯喹啉醌的分布狀況、產(chǎn)生機(jī)理、結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)性質(zhì)研究以及以吡咯喹啉醌作為新藥的研究工作在國(guó)際上非常很活躍。吡咯喹啉醌在食品、輕工、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等方面的應(yīng)用也具有重要實(shí)踐意義。

日本東京農(nóng)工大學(xué)研究人員報(bào)道吡咯喹啉醌能夠抑制帕金森氏癥致病蛋白的凝集。研究人員根據(jù)這個(gè)基本原理利用帕金森氏癥模型動(dòng)物開展深入研究，開發(fā)了改善該疾病癥狀的藥物。

科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)吡咯喹啉醌作為人類發(fā)育的必要因子，刺激人體細(xì)胞生長(zhǎng)，如人體B細(xì)胞、T細(xì)胞，使之產(chǎn)生抗體，從而提高人體免疫功能。

吡咯喹啉醌能顯著降低血清膽紅素，谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，保持肝功能正常，并能有效防治肝損傷，如治療鉛中毒和脂肪肝。

吡咯喹啉醌具有很強(qiáng)的自由基清除能力，其清除O2·和·OH能力較抗壞血酸高50～100倍，能防治自由基過(guò)多造成的機(jī)體損害并引發(fā)各種疾病，如心臟病、癌癥以及各類炎癥。

NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)為微生物育種中常用的烷化劑，有超級(jí)誘變劑之稱。烷化劑帶有活性烷基，此基團(tuán)能夠轉(zhuǎn)移到其它電子密度高的分子上去，使堿基許多位置上增加了烷基，從而在多方面改變氫鍵的能力。依靠NTG誘發(fā)的突變主要是GC—AT轉(zhuǎn)換以及小范圍切除、移碼突變及GC對(duì)的缺失。

通過(guò)對(duì)吡咯喹啉醌菌種的誘變及甲醇耐受篩選，提高了其產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的能力，為該產(chǎn)品的商業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前吡咯喹啉醌生產(chǎn)上發(fā)酵效價(jià)普遍偏低，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)需求的缺陷，提供一種生絲微菌1112-NTG-2318及其發(fā)酵獲得吡咯喹啉醌的方法，所述的生絲微菌1112-NTG-2318在配套的發(fā)酵工藝下產(chǎn)吡咯喹啉醌的能力強(qiáng)，菌種性能穩(wěn)定，具有很好的商業(yè)價(jià)值；所述的方法可以簡(jiǎn)便地獲得大量的吡咯喹啉醌，有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種生絲微菌(Hyphomicrobium sp.)1112-NTG-2318，其保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCC No.10709。

所述的生絲微菌CGMCC No.10709，是以生絲微菌1112-NTG-1953(Hyphomicrobium sp.)為出發(fā)菌株，該出發(fā)菌種為從荷蘭(Netherlands)的土壤樣品中分離獲得的菌種1112-O-36 經(jīng)篩選后得到。對(duì)1112-NTG-1953進(jìn)行NTG誘變，并在高甲醇濃度平板上進(jìn)行篩選，獲得具有高產(chǎn)吡咯喹啉醌特性的菌株CGMCC No.10709，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，為生絲微菌(Hyphomicrobium sp.)，命名為1112-NTG-2318。該菌株已于2015年4月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，并收到保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCC No.10709，其具有以下的微生物學(xué)特性：

1、形態(tài)學(xué)的特性

在顯微鏡下觀察在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時(shí)，細(xì)胞呈桿狀，大小為(0.5-1.0)μm×(1-3)μm，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色呈陰性。

2、培養(yǎng)學(xué)的特性

當(dāng)在14～28℃、pH6.0～7.5下，菌體生長(zhǎng)良好，超過(guò)該范圍會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)差或不生長(zhǎng)的情況。

3、生理特性

可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖；能有效的利用銨鹽類無(wú)機(jī)氮源，無(wú)法利用硝酸鹽類無(wú)機(jī)氮源；能進(jìn)行明膠液化及硝酸鹽還原；無(wú)過(guò)氧化氫酶、氧化酶活性；對(duì)NaCl不耐受；

本發(fā)明的技術(shù)方案之二是：一種制備吡咯喹啉醌的方法，將所述的生絲微菌CGMCC No.10709在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，即從發(fā)酵液中獲得吡咯喹啉醌。

該方法所述的發(fā)酵培養(yǎng)周期為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地，發(fā)酵培養(yǎng)周期為144-240h，更佳地為192-240h。本發(fā)明所述的發(fā)酵溫度為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為26-30℃。

所述發(fā)酵在小試發(fā)酵罐中進(jìn)行，所述小試發(fā)酵罐的體積為本領(lǐng)域常規(guī)的體積。攪拌轉(zhuǎn)速為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)速，較佳地為200～600rpm。溶氧量為本領(lǐng)域常規(guī)的溶氧量，較佳地為大于5％，所述的百分比為發(fā)酵罐中發(fā)酵液的含氧量占該溫度下飽和含氧量的百分比?？諝饬髁繛楸绢I(lǐng)域常規(guī)的空氣流量，較佳地為0.5～1.5vvm。

所述發(fā)酵在中試發(fā)酵罐中進(jìn)行，所述中試發(fā)酵罐的質(zhì)量為本領(lǐng)域常規(guī)的質(zhì)量。攪拌轉(zhuǎn)速為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)速，較佳地為50～180rpm。溶氧量為本領(lǐng)域常規(guī)的溶氧量，較佳地為大于5％，所述的百分比為發(fā)酵罐中發(fā)酵液的含氧量占該溫度下飽和含氧量的百分比。空氣流量為本領(lǐng)域常規(guī)的空氣流量，較佳地為0.3～1.0vvm。

所述發(fā)酵在產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵罐中進(jìn)行，所述產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵罐的質(zhì)量為本領(lǐng)域常規(guī)的質(zhì)量。攪拌轉(zhuǎn)速為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)速，較佳地為30～120rpm。溶氧量為本領(lǐng)域常規(guī)的溶氧量，較佳地為大于5％，所述的百分比為發(fā)酵罐中發(fā)酵液的含氧量占該溫度下飽和含氧量的百分比?？諝饬髁繛楸绢I(lǐng)域常規(guī)的空氣流量，較佳地為0.2～0.8vvm。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子液的移種量為本領(lǐng)域常規(guī)的移種量，較佳地為10～12％，所述的百分比為體積百分比。

其還包括如下的步驟：在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加甲醇的發(fā)酵工藝。

其中，所述甲醇占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的含量為本領(lǐng)域常規(guī)的含量，較佳地為12～35％，更佳地為15～32％，最佳地為20～27％，所述百分比為重量百分比。

本發(fā)明的技術(shù)方案之三是：一種用于發(fā)酵所述的生絲微菌CGMCC No.10709獲得吡咯喹啉醌的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及微量元素；其中，碳源為甲醇、鹽酸甲胺、葡萄糖、甘油、山梨醇中的一種或多種；所述的氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素、蛋白胨、酵母抽提粉中的一種或多種；所述的無(wú)機(jī)鹽及微量元素為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、七水硫酸鎂、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、檸檬酸鐵的一種或多種。和/或，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為本領(lǐng)域常規(guī)的pH，較佳地為6.7～7.6。較佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基還包括消泡劑，較佳地為SAG622。

更佳地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下的組分(g/L)：甲醇2.0-20.0，硫酸銨2.0-10.0，酵母抽提粉2.0-10.0，磷酸二氫鉀1.0-8.0，磷酸氫二鈉1.0-8.0，七水硫酸鎂0.5-1.5，二水氯化鈣0.02-0.10，四水硫酸錳0.02-0.10，七水硫酸鋅0.02-0.10，消泡劑0-0.8，pH6.7-7.6；最佳地，包括如下的組分(g/L)：甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，SAG6220.6，pH7.2。

本發(fā)明的技術(shù)方案之四是：一種獲得所述的生絲微菌CGMCC No.10709的方法，其包括以下的步驟，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的生絲微菌CGMCC No.10709即可。

其中，所述的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)所述的生絲微菌CGMCC No.10709即可，較佳地，所述的培養(yǎng)基為上述的發(fā)酵培養(yǎng)基。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供的NTG誘變的吡咯喹啉醌高產(chǎn)菌株生絲微菌CGMCC No.10709，遺傳性狀穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，放大易于實(shí)現(xiàn)，具有優(yōu)良的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明所述的發(fā)酵制造吡咯喹啉醌的方法，綜合調(diào)整了發(fā)酵配方、發(fā)酵控制工藝，并且針對(duì)甲醇進(jìn)行補(bǔ)加和殘留量控制，在80m³罐上發(fā)酵效價(jià)達(dá)到1783mg/L，在規(guī)模上和技術(shù)水平上高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，有利于吡咯喹啉醌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

生物材料保藏信息

本發(fā)明的生絲微菌CGMCC No.10709，已于2015年4月10日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10709，生物材料(株)為1112-NTG-2318，分類命名是生絲微菌Hyphomicrobium sp.。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1生絲微菌CGMCC No.10709產(chǎn)生的吡咯喹啉醌HPLC圖譜。

圖2為實(shí)施例1生絲微菌CGMCC No.10709產(chǎn)生的吡咯喹啉醌ESI-MS圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

實(shí)施例1、高產(chǎn)菌株生絲微菌CGMCC No.10709(Hyphomicrobium sp.)的制備

取試驗(yàn)菌種1112-NTG-1953，該菌種為從荷蘭(Netherlands)的土壤樣品中分離獲得TK0415^T(賦予編號(hào)1112-O-36)經(jīng)過(guò)自然篩選及UV誘變篩選得到。(菌種TK 0415^T參見(jiàn)Teizi Urakami,Junko Sasaki,Ken-Ichiro Suzuki,etc.,Characterization and Description of Hyphomicrobium denitrificans sp.nov.,International Journal Of Systematic Bacteriology,Vol.45,No.3,p.528-532,July 1995)

吸取甘油管菌懸液涂布于試管斜面上，斜面培養(yǎng)基為(g/L)：硫酸銨1.00、七水硫酸鎂0.20、磷酸二氫鈉0.50、磷酸氫二鉀1.55、甲醇1.20、瓊脂15.00，pH7.2，26-30℃培養(yǎng)4d。刮取斜面菌體，制備試驗(yàn)菌種菌懸液，用于誘變處理。

精確稱取10.0mg的NTG溶于lmL丙酮，加入菌懸液使NTG終濃度達(dá)到1.0mg/L。4℃緩慢震蕩處理15min，離心棄上清，用無(wú)菌生理鹽水打散，重復(fù)洗滌2次，使其終止反應(yīng)。

吸取含有誘變過(guò)的液體培養(yǎng)基至含有15g/L甲醇的培養(yǎng)皿上進(jìn)行涂布培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度26-30℃，培養(yǎng)周期為4d。計(jì)算結(jié)果顯示致死率達(dá)到82％。

從培養(yǎng)皿上挑取單菌落，分別進(jìn)種子瓶，種子培養(yǎng)基為(g/L)，硫酸銨2.0，磷酸二氫鉀1.6，磷酸氫二鈉2.8，七水硫酸鎂0.3，甲醇1.2，pH7.0。培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)2d后；逐一進(jìn)250ml發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)4d，并以前一代的菌株作為對(duì)照同時(shí)培養(yǎng)。

其中，發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，pH6.7。

搖瓶發(fā)酵工藝：發(fā)酵搖瓶裝量20ml/250ml，移種量為10％，培養(yǎng)溫度為26-30℃，培養(yǎng)濕度為40-60％，搖床振幅為5cm，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)周期為120h。發(fā)酵結(jié)束后HPLC檢測(cè)吡咯喹啉醌含量。

從菌株1112-O-36開始計(jì)算，共篩選了2318株菌株，得到一株高產(chǎn)突變株1112-NTG-2318，其搖瓶發(fā)酵效價(jià)為122mg/L，復(fù)篩(即按照相同的條件再進(jìn)行一次搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng))后搖瓶發(fā)酵效價(jià)113mg/L，其HPLC圖譜如圖1所示。將發(fā)酵得到的發(fā)酵液進(jìn)行分離提純(分離提純的步驟參見(jiàn)：Minoru Ameyama,Masaharu Hayashi,etc.,Microbial Production of Pyrroloquinoline Quinone,Agric.Biol Chem.,48(2),561-565,1984)，提純后的吡咯喹啉醌的ESI/MS圖譜如圖2所示。篩選前的菌株1112-O-36的效價(jià)為7mg/L，從發(fā)酵結(jié)果上看，該菌株1112-NTG-2318比篩選前的菌株1112-O-36發(fā)酵單位提高約15倍。

實(shí)施例2：生絲微菌CGMCC No.10709在50L罐上的發(fā)酵小試工藝研究

以250ml搖瓶獲得的工藝參數(shù)為基礎(chǔ)，參考該突變菌株CGMCC No.10709的特性，設(shè)計(jì)50L罐發(fā)酵工藝并進(jìn)行優(yōu)化?？疾焱蛔冎晟L(zhǎng)代謝情況和吡咯喹啉醌的最佳產(chǎn)素能力。

種子培養(yǎng)基(g/L)，即硫酸銨2.0，磷酸二氫鉀1.6，磷酸氫二鈉2.8，七水硫酸鎂0.3，甲醇1.2，pH7.0。

種子罐工藝控制：種子培養(yǎng)基裝量為10/15L，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-500rpm，溶氧大于15％，空氣流量0.5-2.0，培養(yǎng)周期3天。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，SAG6220.6，pH7.2。

發(fā)酵罐工藝控制：發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為30/50L，移種量為12％，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm，溶氧大于5％，空氣流量0.5-1.5vvm，培養(yǎng)周期144h。

發(fā)酵補(bǔ)料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累計(jì)補(bǔ)入甲醇12％，其中百分比是指重量百分比。

發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行溶氨、甲醇、OD、pH及發(fā)酵效價(jià)等的檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)果放罐效價(jià)達(dá)到1351mg/L。

實(shí)施例3：生絲微菌CGMCC No.10709在50L罐上的發(fā)酵小試工藝研究

以實(shí)施例2的工藝參數(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)50L罐發(fā)酵工藝并進(jìn)行優(yōu)化。考察突變株生長(zhǎng)代謝情況和吡咯喹啉醌的最佳產(chǎn)素能力。

種子培養(yǎng)基(g/L)，即硫酸銨2.0，磷酸二氫鉀1.6，磷酸氫二鈉2.8，七水硫酸鎂0.3，甲醇1.2，pH7.0。

種子罐工藝控制：種子培養(yǎng)基裝量為10/15L，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-500rpm，溶氧大于15％，空氣流量0.5-2.0，培養(yǎng)周期3天。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，SAG6220.6，pH7.6。

發(fā)酵罐工藝控制：發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為30/50L，移種量為10％，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-600rpm，溶氧大于5％，空氣流量0.5-1.5vvm，培養(yǎng)周期240h。

發(fā)酵補(bǔ)料控制：流加甲醇及控制pH7.6，累計(jì)補(bǔ)入甲醇15％，其中百分比是指重量百分比。

發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行溶氨、甲醇、OD、pH及發(fā)酵效價(jià)等的檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)果放罐效價(jià)達(dá)到1532mg/L。

實(shí)施例4：菌株CGMCC No.10709的形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)學(xué)特征

參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》、《放線菌的分類與鑒定》、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》及《中國(guó)藥典》(2010版XIH)等書中的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

培養(yǎng)特征：采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號(hào)、蘋果酸鈣、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、YMS和查氏培養(yǎng)基10種培養(yǎng)基(從浙江海正藥業(yè)股份有限公司處獲得)，28℃培養(yǎng)7～10天后，觀察菌絲體的顏色及色素情況(見(jiàn)表1)。

表1 菌株CGMCC No.10709在10種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

表一的結(jié)果說(shuō)明：該菌種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)良好，在ISP3上不生長(zhǎng)，在不同的培養(yǎng)基上，基本上表現(xiàn)相同的外觀、色素。

實(shí)施例5：菌株CGMCC No.10709的生理生化特征

除溫度實(shí)驗(yàn)外，均為28℃培養(yǎng)5～7天。

a)碳源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各種碳源的終濃度均為1.0％，所述的百分比為質(zhì)量百分比，其結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果說(shuō)明：菌種CGMCC No.10709可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖

b)無(wú)機(jī)氮源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％，所述的百分比為質(zhì)量百分比，其結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果說(shuō)明：菌種CGMCC No.10709可以有效的利用銨鹽類無(wú)機(jī)氮源，無(wú)法利用硝酸鹽類無(wú)機(jī)氮源。

c)降解試驗(yàn)和NaCl耐受實(shí)驗(yàn)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為GYEA(pH6.8)，各種降解物的濃度見(jiàn)表3，結(jié)果說(shuō)明：除腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤外，在其他供試降解物上生長(zhǎng)良好；在降解方面，CGMCC No.10709對(duì)供試降解物都無(wú)降解作用。相關(guān)降解物的百分比為質(zhì)量百分比。NaCl耐受的結(jié)果見(jiàn)表7，結(jié)果說(shuō)明：菌種CGMCC No.10709對(duì)NaCl不耐受。

d)氧化酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、pH試驗(yàn)和溫度試驗(yàn)均采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。氧化酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果說(shuō)明：CGMCC No.10709無(wú)過(guò)氧化氫酶、氧化酶活性。pH試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，結(jié)果說(shuō)明：生長(zhǎng)較適pH為6.0-7.5；溫度試驗(yàn)見(jiàn)表6，結(jié)果說(shuō)明：14-28℃生長(zhǎng)良好。

e)M.R、V-P和脲酶實(shí)驗(yàn)采用《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法。M.R、V-P和脲酶實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果說(shuō)明：菌種CGMCC No.10709能進(jìn)行明膠液化及硝酸鹽還原。

表2 菌株CGMCC No.10709的碳源和氮源的利用情況

表3 菌株CGMCC No.10709的降解試驗(yàn)結(jié)果

表4 菌株CGMCC No.10709主要的生理生化特征

表5 菌株CGMCC No.10709生長(zhǎng)的pH試驗(yàn)

表6 菌株CGMCC No.10709生長(zhǎng)的溫度試驗(yàn)

表7 菌株CGMCC No.10709對(duì)NaCl的耐受性

*注：0，無(wú)生長(zhǎng)；1，生長(zhǎng)很弱；2，能生長(zhǎng)，有少量孢子；3，生長(zhǎng)良好，有大量孢子；4，生長(zhǎng)最好，有豐富孢子；+，陽(yáng)性；-，陰性。

由實(shí)施例4～5的數(shù)據(jù)說(shuō)明，所述生絲微菌CGMCC No.10709具有以下的微生物學(xué)特性：

1、形態(tài)學(xué)的特性

在顯微鏡下觀察在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株時(shí)，細(xì)胞呈桿狀，大小為(0.5-1.0)μm×(1.0-3.0)μm，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色呈陰性。

2、培養(yǎng)學(xué)的特性

當(dāng)在14～28℃、pH6.0～7.5下，菌體生長(zhǎng)良好，超過(guò)該范圍會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)差或不生長(zhǎng)的情況。在ISP1、ISP2、ISP4、ISP5、高氏一號(hào)、蘋果酸鈣、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、YMS和查氏培養(yǎng)基等不同的培養(yǎng)基上，基本上表現(xiàn)相同的外觀、色素。

3、生理特性

可以很好的利用D-葡萄糖、D-山梨醇、甘油、D-蔗糖、木聚糖；可以有效的利用D-棉籽糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、D-果糖、D-乳糖、半乳糖、肌醇、甘氨酸和鼠李糖；能有效的利用銨鹽類無(wú)機(jī)氮源，無(wú)法利用硝酸鹽類無(wú)機(jī)氮源；能進(jìn)行明膠液化及硝酸鹽還原；無(wú)過(guò)氧化氫酶、氧化酶活性；對(duì)NaCl不耐受；

實(shí)施例6：菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列分析

16S rDNA序列分析：菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比較的結(jié)果見(jiàn)表8(表中只列出同源性較高的菌株)。

表8 菌株CGMCC No.10709和相關(guān)菌株的同源性

對(duì)菌株CGMCC No.10709進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表SEQ ID No.1所示。將如序列表SEQ ID No.1所示的菌株CGMCC No.10709的16S rDNA序列與生絲微菌屬(Hyphomicrobium sp.)的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株CGMCC No.10709和生絲微菌屬(Hyphomicrobium sp.)有很高同源性，最高的達(dá)99.7％。同時(shí)通過(guò)菌株CGMCC No.10709的表觀特征試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株和生絲微菌屬(Hyphomicrobium sp.)分類相關(guān)參數(shù)非常接近，故將CGMCC No.10709菌株鑒定為生絲微菌屬(Hyphomicrobium sp.)的菌株。

實(shí)施例7：菌株CGMCC No.10709在15m³罐上的發(fā)酵放大

根據(jù)50L發(fā)酵罐獲得的工藝參數(shù)及該突變菌株CGMCC No.10709的特性，設(shè)計(jì)15m³罐發(fā)酵工藝并進(jìn)行優(yōu)化。考察突變株在中試規(guī)模下的生長(zhǎng)代謝情況和吡咯喹啉醌的最佳產(chǎn)素能 力。

種子培養(yǎng)基(g/L)，即硫酸銨2.0，磷酸二氫鉀1.6，磷酸氫二鈉2.8，七水硫酸鎂0.3，甲醇1.2，pH7.0。

種子罐工藝控制：種子培養(yǎng)基裝量為1.3/3.0m³，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速50-200rpm，溶氧大于15％，空氣流量0.2-1.0vvm，培養(yǎng)周期3天。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，SAG6220.6，pH7.2。

發(fā)酵罐工藝控制：發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為10/15m³，移種量為12％，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速50-180rpm，溶氧大于5％，空氣流量0.3-1.0vvm，培養(yǎng)周期192h。

發(fā)酵補(bǔ)料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累計(jì)補(bǔ)入甲醇20％。

發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行溶氨、甲醇、OD、pH及發(fā)酵效價(jià)等的檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)果放罐效價(jià)達(dá)到1625mg/L。

實(shí)施例8：菌株CGMCC No.10709在80m³罐上的發(fā)酵放大

根據(jù)15m³發(fā)酵罐獲得的工藝參數(shù)及該突變菌株CGMCC No.10709的特性，設(shè)計(jì)80m³罐發(fā)酵工藝并進(jìn)行優(yōu)化?？疾焱蛔冎暝诋a(chǎn)業(yè)化規(guī)模下的生長(zhǎng)代謝情況和吡咯喹啉醌的最佳產(chǎn)素能力。

種子培養(yǎng)基(g/L)，即硫酸銨2.0，磷酸二氫鉀1.6，磷酸氫二鈉2.8，七水硫酸鎂0.3，甲醇1.2，pH7.0。

種子罐工藝控制：種子培養(yǎng)基裝量為7/12m³，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速30-150rpm，溶氧大于15％，空氣流量0.2-0.8vvm，培養(yǎng)周期3天。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)，即甲醇12.0，硫酸銨5.0，酵母抽提粉5.0，磷酸二氫鉀2.0，磷酸氫二鈉5.0，七水硫酸鎂0.6，二水氯化鈣0.06，四水硫酸錳0.08，七水硫酸鋅0.1，SAG6220.6，pH7.5。

發(fā)酵罐工藝控制：發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為50/80m³，移種量為10％，培養(yǎng)溫度26-30℃，攪拌轉(zhuǎn)速30-120rpm，溶氧大于5％，空氣流量0.2-0.8vvm，培養(yǎng)周期240h。

發(fā)酵補(bǔ)料控制：流加甲醇及控制pH7.2，累計(jì)補(bǔ)入甲醇27％。

發(fā)酵過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行溶氨、甲醇、OD、pH及發(fā)酵效價(jià)等的檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)果放罐效價(jià)達(dá)到1783mg/L。