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一種實(shí)驗(yàn)動物資源質(zhì)量快速監(jiān)測方法與流程

文檔序號:12346583閱讀:510來源:國知局
一種實(shí)驗(yàn)動物資源質(zhì)量快速監(jiān)測方法與流程

本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域,更具體地,本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)動物資源質(zhì)量快速監(jiān)測方法。



背景技術(shù):

實(shí)驗(yàn)動物資源(胚胎、精子等)冷凍技術(shù)的應(yīng)用有許多優(yōu)點(diǎn)。在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中,需要各種品系的實(shí)驗(yàn)動物,在隔離器內(nèi)保養(yǎng)動物品系需要花費(fèi)大量的人力和物力,代價昂貴。如將暫時用不著的動物資源進(jìn)行冷凍,就可以長期保存,既安全又能節(jié)省人力和物力。采用動物資源運(yùn)輸代替活動物運(yùn)輸,既方便又能減少疾病的傳播,便于國際間實(shí)驗(yàn)動物品系的相互交流。此外,能夠保存有價值的遺傳物質(zhì),建立基因庫,防止實(shí)驗(yàn)動物的遺傳漂變。

實(shí)驗(yàn)動物資源中若帶有的病原微生物,會對生殖細(xì)胞等的品質(zhì)、保存及受胎效果等產(chǎn)生影響,并且可能導(dǎo)致最后獲得的實(shí)驗(yàn)動物中也帶這些病原微生物,最終影響實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量。而病原微生物在實(shí)驗(yàn)動物上可以引起動物疫病表現(xiàn),甚至發(fā)生死亡,使動物繁殖率下降和動物發(fā)育不良,影響動物自身的穩(wěn)定性和反應(yīng)性,甚至引起人獸共患病,嚴(yán)重影響動物實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行,并對飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員的健康和安全造成威脅。

目前已有共識,實(shí)驗(yàn)動物資源(胚胎、精子等)冷凍操作都不是無菌的技術(shù),在動物的運(yùn)輸過程中,資源的冷凍過程中,包括冷凍所需的試劑和實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境中可能都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物資源中帶有某些日常生活中比較常見的病原微生物。并且實(shí)驗(yàn)室所使用的主要冷凍媒介是液氮(-196℃),液氮中微生物含量非常低,但是,在儲存和分配過程中會被病原微生物污染,從而成為冷凍芽孢、酵母菌、細(xì)菌和病毒的有效培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)動物的微生物質(zhì)量控制中,很多病原微生物必須被排除,但是目前在實(shí)驗(yàn)動物資源中對這些病原微生物還沒有進(jìn)行嚴(yán)格檢測控制,所以建立一個實(shí)驗(yàn)動物資源(胚胎、精子等)質(zhì)量(微生物)快速監(jiān)測方法以保證實(shí)驗(yàn)動物資源的微生物質(zhì)量達(dá)標(biāo)。

金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性鏈球菌是實(shí)驗(yàn)動物上比較常見的病原微生物,它們廣泛存在于空氣和水中,是人和動物體表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常見菌,也是條件性致病菌。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14922.2-2011規(guī)定金黃色葡萄球菌檢測采用分離培養(yǎng)法與生化鑒定相結(jié)合的方法。采取可疑樣品接種于高鹽甘露醇(SP)培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)18-24h。SP培養(yǎng)基上形成1mm左右、凸起、黃色的菌落,菌落周圍的培養(yǎng)基因金黃色葡萄球菌發(fā)酵甘露醇而紅色變成黃色。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于血瓊脂平皿,37℃培養(yǎng)18-24h,形成白色或金黃色、凸起、圓形、不透明、表面光滑、周圍有β溶血環(huán)的群落。革蘭氏染色后鏡檢觀察,其為革蘭氏陽性球菌,排列成葡萄球狀,無莢膜和芽孢。當(dāng)符合以上結(jié)果時,做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。同時設(shè)立已知的血漿凝固酶陽性和陰性的金黃色葡萄球菌及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為對照。但已知的陽性株和待檢株均出現(xiàn)凝固塊時,可判斷待檢菌株為金黃色葡萄球菌。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14926.13-2001規(guī)定肺炎克雷伯氏菌采用分離培養(yǎng)法與生化鑒定相結(jié)合的方法。采取可疑樣品接種于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)18-24h。DHL培養(yǎng)基上形成淡粉色,大而隆起,光滑濕潤,呈粘液狀,相鄰菌落易融合成濃汁樣,直接接種針挑取時刻拉出較長的絲。革蘭氏染色后鏡檢觀察,其為革蘭氏陰性短桿菌,單個、成雙或成短鏈排列,有莢膜,無芽孢。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于碘化鉀或三糖鐵(TSI)瓊脂培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)18-24h,斜面產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣,或僅產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,硫化氫陰性。VP試驗(yàn)陽性,硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性,MR陰性,西蒙氏檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陽性,丙二酸鹽試驗(yàn)陽性,尿素酶陽性,賴氨酸脫羧酶陽性、鳥氨酸脫羧酶陰性,利用葡萄糖和乳糖,靛基質(zhì)陰性,半固體動力試驗(yàn)陰性。凡符合上市各項(xiàng)檢測結(jié)果者,可判斷待檢菌株為肺炎克雷伯氏菌。

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB14926.13-2001規(guī)定乙型溶血性鏈球菌采用分離培養(yǎng)法與生化鑒定相結(jié)合的方法。采取可疑樣品接種于血瓊脂培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)18-24h。血瓊脂培養(yǎng)基上形成1mm左右,灰白色圓形、凸起,半透明或不透明,表面光滑,周圍有2-4mm界限分明,無色透明溶血環(huán)(β溶血)的小菌落。革蘭氏染色后鏡檢觀察,其為革蘭氏陽性球菌,成鏈狀排列。固體培養(yǎng)基上生長多呈短鏈或葡萄狀,而液體培養(yǎng)基中則成典型的鏈球狀排列。 鏈激酶試驗(yàn)陽性,桿菌肽敏感試驗(yàn)陽性。凡符合上市各項(xiàng)檢測結(jié)果者,可判斷待檢菌株為乙型溶血性鏈球菌。

多年來,在實(shí)驗(yàn)動物病原微生物的檢測中主要是依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法,它是微生物學(xué)上普遍認(rèn)可的經(jīng)典方法,容易得出明確的結(jié)論,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以反復(fù)驗(yàn)證,并可以在絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室開展。但是這些方法或耗時,或特異性低,且需要檢測人員對病原微生物的菌落形態(tài)、理化反應(yīng)性質(zhì)等有準(zhǔn)確的判斷,才能得出正確的結(jié)論,這就要求檢測人員必須具有扎實(shí)的微生物學(xué)理論基礎(chǔ)和豐富的病原微生物檢測經(jīng)驗(yàn)。

因此,對于實(shí)驗(yàn)動物病原微生物的檢測技術(shù),還需要加以改進(jìn),以提高檢測效率,提高檢測準(zhǔn)確性。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)驗(yàn)動物資源質(zhì)量快速監(jiān)測方法。

在本發(fā)明的第一方面,提供一種特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的方法,所述方法包括:

(1)以實(shí)驗(yàn)動物資源待測樣品的DNA為模板,以目標(biāo)微生物特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;

(2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,若測得陽性產(chǎn)物,則表明存在目標(biāo)微生物感染;

其中,所述的目標(biāo)微生物是金黃色葡萄球菌,其PCR引物選自:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物,或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物;或

所述的目標(biāo)微生物是肺炎克雷伯氏菌,其PCR引物選自:SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物,或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物;或

所述的目標(biāo)微生物是乙型溶血性鏈球菌,其PCR引物選自:SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物,SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物,SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO: 30的引物,或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在一個優(yōu)選例中,所述的實(shí)驗(yàn)動物資源是冷凍的實(shí)驗(yàn)動物資源。

在另一優(yōu)選例中,所述的實(shí)驗(yàn)動物資源包括(但不限于):動物胚胎,精子、卵子。

在另一優(yōu)選例中,步驟(2)中,通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,若電泳條帶陽性,則表明存在目標(biāo)微生物感染。

在另一優(yōu)選例中,步驟(2)中,通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,若電泳條帶陽性,將陽性條帶中的DNA進(jìn)行測序,將測序結(jié)果與目標(biāo)微生物的基因序列進(jìn)行BLAST比較,從而準(zhǔn)確確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在目標(biāo)微生物。

在本發(fā)明的另一方面,提供一種PCR引物,所述引物是擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物,或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物;或

所述引物是擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物,或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物;或

所述引物是擴(kuò)增乙型溶血性鏈球菌的引物,選自:SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物,SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物,SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物,或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在本發(fā)明的另一方面,提供所述的引物的用途,用于特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況。

在本發(fā)明的另一方面,提供一種用于特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的試劑盒,其中包括:

擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物,或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物;和/或

擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物,或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物;和/或

擴(kuò)增乙型溶血性鏈球菌的引物,選自:SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物,SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物,SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物,或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的引物。

在一個優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括:含有目標(biāo)微生物標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

在另一優(yōu)選例中,所述試劑盒中還包括選自以下的試劑:DNA提取試劑,PCR緩沖液,DNA聚合酶,和/或說明鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的方法的使用說明書。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、利用陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株建立PCR體系及篩選引物的流程示意圖。

圖2、針對冷凍資源的快速檢測方法的流程示意圖。

圖3、利用金黃色葡萄球菌引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

圖4、利用金黃色葡萄球菌引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

圖5、利用肺炎克雷伯氏菌引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

圖6、利用肺炎克雷伯氏菌引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

圖7、利用乙型溶血性鏈球菌引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

圖8、利用乙型溶血性鏈球菌引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳獲得的目的條帶的序列Blast結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究,首次揭示一種可特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的方法,篩選獲得了特異性非常好的PCR引物,具有檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。

如本文所用,所述的“目標(biāo)微生物”包括:金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性鏈球菌中的一種或多種。

本發(fā)明人通過對引物的篩選,獲得一種可特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源、特別是冷凍的實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染的引物,其特異性良好,對于目標(biāo)微生物的DNA樣品發(fā)生特異性擴(kuò)增,而對沒有目標(biāo)微生物的DNA不發(fā)生特異性擴(kuò)增樣品。

因此,本發(fā)明提供一種引物,所述的引物是擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的引物,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物,或SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物?;颍鲆锸菙U(kuò)增金黃色葡萄球菌的引物,選自:SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物,或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物;或所述引物是擴(kuò)增乙型溶血性鏈球菌的引物,選自:SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物,SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物,SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的引物,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物,SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物,SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物,或SEQ ID NO:31和SEQ ID NO: 32的引物

本發(fā)明的這些引物還可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

利用本發(fā)明的引物以及PCR擴(kuò)增體系,只需進(jìn)行PCR反應(yīng)和/或瓊脂糖凝膠電泳,并通過判斷相應(yīng)的PCR產(chǎn)物的有無,就可以準(zhǔn)確、快速地判斷待測樣品是否存在目標(biāo)微生物的感染,而且所需的樣品量很少,對于微量的目標(biāo)微生物也能有效地檢出。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù),其基本原理是體外酶促合成特異DNA片段的方法。本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的PCR技術(shù)。

獲取待測樣品的DNA的方法可采取傳統(tǒng)的酚/氯仿/異戊醇法,或者可采用一些商購的DNA提取試劑盒,這類試劑盒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

本發(fā)明還涉及一種用于特異性鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的試劑盒,所述試劑盒中含有前面所述的引物。此外,所述的試劑盒中還可含有能夠與所述的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中某一位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合的探針,所述的探針可攜帶可檢測信號如熒光信號,從而應(yīng)用于熒光定量PCR檢測。

此外,所述的試劑盒還可含有其它對于鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況有用的試劑,如(但不限于):

(A)各種PCR反應(yīng)用試劑,例如但不限于:Taq酶,PCR緩沖液,dNTP,DNA聚合酶等;或

(B)各種提取DNA(即制備PCR反應(yīng)模板)所需的試劑,例如但不限于:酚、氯仿、異戊醇、NaCl等;或

(C)提取DNA的試劑盒。

此外,所述的試劑盒中還可含有鑒定實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的使用說明書和/或標(biāo)準(zhǔn)操作程序。本發(fā)明所述的試劑盒可實(shí)現(xiàn)快速檢測、批量檢測實(shí)驗(yàn)動物資源中目標(biāo)微生物感染情況的目的,大大縮短了實(shí)驗(yàn)動物資源中檢測病原微生物所需的時間和所耗費(fèi)的試劑。

與傳統(tǒng)的形態(tài)分析方法相比,PCR技術(shù)更具特異性和精確性,不會受外界因素(如溫度改變、化學(xué)藥物)影響而改變,而且其敏感度高、快速、簡便, 它不僅能檢測出活的病原微生物,而且也能檢測出死亡的和難以培養(yǎng)的病原微生物,對檢測人員的相關(guān)技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求不高。

本發(fā)明的PCR方法只需將冷凍實(shí)驗(yàn)動物資源、冷凍和復(fù)蘇過程中所需要的溶液、保存凍存物液氮的滅菌水的冷凍物直接用微量DNA提取試劑盒的提取微生物的DNA,設(shè)計對應(yīng)的引物和相應(yīng)的條件后進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng)),從而快速了解冷凍資源中的微生物情況。

此外,也可以使用LAMP方法代替上述的PCR方法檢測三種病原微生物,該方法所需的時間更短,實(shí)驗(yàn)過程中不需要使用PCR儀,并且不需要通過電泳的方式檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,可以通過比濁法等進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測,其所需要的儀器成本更低。LAMP技術(shù)主要是利用四條不同的引物特異的識別目的基因上的六個特定序列,然后借助具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在60℃-65℃恒溫條件下催化新鏈的合成,從而實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚋咝?、快速的擴(kuò)增。

下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南,第三版,科學(xué)出版社,2002中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線的制定及利用陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株篩選引物

1、陽性對照的PCR方法建立

本實(shí)驗(yàn)需檢測的目標(biāo)微生物為:金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌。

從中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)購買上述三株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對照,將這三株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)蘇,提取復(fù)蘇后的標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA,根據(jù)各個標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列設(shè)計與其相對應(yīng)的特異性引物,對相應(yīng)引物篩選和PCR體系優(yōu)化,將PCR產(chǎn)物測序后比對,驗(yàn)證陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株準(zhǔn)確性,以此建立PCR方法。流程如圖1。

2、引物篩選

經(jīng)過大量的反復(fù)研究篩選,本發(fā)明人優(yōu)化了適用于進(jìn)行金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性鏈球菌的PCR引物。具體如下:

(1)、金黃色葡萄球菌的引物及PCR條件與PCR擴(kuò)增體系

針對金黃色葡萄球菌的引物及擴(kuò)增條件如表1。

表1

PCR擴(kuò)增體系如下:

(2)、肺炎克雷伯氏菌的引物及PCR條件

針對肺炎克雷伯氏菌的引物及擴(kuò)增條件如表2。

表2

PCR擴(kuò)增體系如下:

(3)、乙型溶血性鏈球菌的引物及PCR條件

針對乙型溶血性鏈球菌的引物及擴(kuò)增條件如表3。

表3

PCR擴(kuò)增體系如下:

實(shí)施例2、陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR結(jié)果產(chǎn)物測序結(jié)果BLAST

對獲得的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、測序。將獲得的測序結(jié)果進(jìn) 行BLAST。參數(shù)如下:

Score為比對得分,兩個序列相似性越高;

E Value值越小,越可信;

Identities為一致性,就是兩個序列保持一致的比例。

1、金黃色葡萄球菌引物1

利用金黃色葡萄球菌引物1,獲得目的條帶122bp。Blast結(jié)果如圖3所示。

2、金黃色葡萄球菌引物2

利用金黃色葡萄球菌引物2,獲得目的條帶132bp。Blast結(jié)果如圖4所示。

3、肺炎克雷伯氏菌引物1

利用肺炎克雷伯氏菌引物1,獲得目的條帶368bp。Blast結(jié)果如圖5所示。

4、肺炎克雷伯氏菌引物2

利用肺炎克雷伯氏菌引物2,獲得目的條帶423bp。Blast結(jié)果如圖6所示。

5、乙型溶血性鏈球菌引物3

利用乙型溶血性鏈球菌引物3,獲得目的條帶346bp。Blast結(jié)果如圖7所示。

6、乙型溶血性鏈球菌引物5

利用乙型溶血性鏈球菌引物5,獲得目的條帶423bp。Blast結(jié)果如圖8所示。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和乙型溶血性鏈球菌使用PCR方法檢測是可行的,且檢測準(zhǔn)確性高。

實(shí)施例3、針對冷凍資源的快速檢測方法的建立

將冷凍資源(胚胎和精子等)、冷凍和復(fù)蘇過程中所需要的溶液、含有保存 凍存物液氮的滅菌水分別用微量DNA提取試劑盒(購自QIAGEN)提取DNA。

以前述實(shí)施例1提供的針對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型溶血性鏈球菌的PCR引物及相應(yīng)的PCR條件和PCR反應(yīng)體系對上述樣品DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),若得到陽性條帶,即可證明冷凍資源中有相應(yīng)菌株存在,同時可以回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序進(jìn)一步確認(rèn)。

操作流程如圖2所示。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

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