本發(fā)明涉及中藥組合物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種風(fēng)輪菜中黃酮類化合物的分離方法及黃酮組合物。

背景技術(shù)：

風(fēng)輪菜(Clinopodium chinense(Benth.)O.Kuntze)為唇形科風(fēng)輪菜屬植物。在我國(guó)主要分布于山東、浙江、江蘇、安徽、福建、臺(tái)灣、湖南、湖北、廣東、廣西及云南東北部等地。風(fēng)輪菜性涼，味苦辛，有疏風(fēng)清熱，解毒消腫之功。用于治療感冒、中暑、過(guò)敏性皮炎、腸炎、痢疾、血尿等癥。首載于《救荒本草》(1406)草部，在我國(guó)有悠久的民間藥用歷史?，F(xiàn)已被《中華人民共和國(guó)藥典》收載為斷血流藥用，主要用于治療各種出血癥。

目前有研究表明，風(fēng)輪菜總黃酮具有顯著的活血化瘀活性，而風(fēng)輪菜中的皂苷類成分又具有止血的功效，因此，風(fēng)輪菜具有止血加活血的雙向作用，即在止血的同時(shí)又可以祛除已瘀之血，達(dá)到止血而不留淤的效果。所以風(fēng)輪菜總黃酮在活血化瘀，治療和/或預(yù)防心血管疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有著良好的研究開發(fā)前景。

然而，中醫(yī)所記載的總黃酮并沒有明確的化合物，且現(xiàn)有技術(shù)在對(duì)風(fēng)輪菜中的總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取分離時(shí)，不同研究者分離得到的黃酮類物質(zhì)的種類都不盡相同。因而，到目前為止，研究人員仍然不清楚風(fēng)輪菜中具有醫(yī)藥活性的總黃酮類物質(zhì)具體有哪些。

因此，仍需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，以提供一種成分相對(duì)齊全的黃酮組合物，為從風(fēng)輪菜的天然產(chǎn)物中尋找具有良好療效的治療和/或預(yù)防心血管疾病的藥物提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種風(fēng)輪菜中黃酮類化合物的分離方法及黃酮組合物，為從風(fēng)輪菜的天然產(chǎn)物中尋找具有良好療效的治療和/或預(yù)防心血管疾病的藥物提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種風(fēng)輪菜中黃酮類化合物的分離方法，該分離方法包括以下步驟：從風(fēng)輪菜的干燥地上部分提取總黃酮類物質(zhì)；對(duì)總黃酮類物質(zhì)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，在分離過(guò)程中，以體積比為100：5～100：25的氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，依次得到第1流分至第320流分；對(duì)第1流分至第320流分中的第133-176流分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以體積比依次為9:1、4:1、2:1、1:1和1:2的氯仿和丙酮為洗脫劑進(jìn)行洗脫，并經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，得到A1至A13共13個(gè)流分；然后以體積比為60:40 的甲醇和水作為洗脫劑，依次對(duì)13個(gè)流分進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，分別得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35；對(duì)第1流分至第320流分中的第231-260流分進(jìn)行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇和水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，并經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，得到B1至B7共7個(gè)流分；然后依次對(duì)7個(gè)流分進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分別得到化合物6、21、22、28、29、30和33；對(duì)第1流分至第320流分中的第295-310進(jìn)行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，并經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，得到C1至C8共8個(gè)流分；依次對(duì)8個(gè)流分進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分別得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34；對(duì)第1流分至第320流分中的第12-48流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，并以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后經(jīng)薄層追蹤檢測(cè)合并相同組分，得到D1、D2和D3共3個(gè)流分；對(duì)D2流分進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到化合物13和19；對(duì)D3流分進(jìn)行反相高效液相色譜分離，以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到化合物25；對(duì)第1流分至第320流分中的第49-55流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18。

進(jìn)一步地，對(duì)總黃酮類物質(zhì)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離的過(guò)程中，利用體積比分別為100：5、100：10、100：15、100：20和100：25的氯仿和甲醇作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，依次得到第1流分至第320流分。

進(jìn)一步地，分離法方法還包括：對(duì)第1流分至第320流分中的第49-55流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18。

進(jìn)一步地，分離法方法進(jìn)一步包括：對(duì)第1流分至第320流分中的第79-86流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物7和31。

進(jìn)一步地，從風(fēng)輪菜的干燥地上部分提取總黃酮類物質(zhì)的步驟包括：取風(fēng)輪菜的干燥地上部分，用水提取得到水提液；將水提液進(jìn)行壓縮、干燥，得到水提物；將水提物進(jìn)行大孔樹脂層析，以乙醇和水為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，得到洗脫物；以及將洗脫物進(jìn)行堿提酸沉法富集，然后精制得到總黃酮類物質(zhì)。

進(jìn)一步地，大孔樹脂層析過(guò)程中采用D101大孔樹脂層析柱進(jìn)行層析；乙醇和水形成的洗脫劑中乙醇的體積濃度分別為20％、50％、70％和95％；優(yōu)選得到的洗脫物為乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種黃酮組合物，該黃酮組合物包括黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物、二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物、黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物以及異黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物；其中，黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物至少包括以下任意一種：洋芹素-7-O-蕓香糖苷、木 犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷和金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷，黃酮組合物是從風(fēng)輪菜中分離得到，且黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)上述任一種分離方法分離得到。

進(jìn)一步地，黃酮組合物中的二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物至少包括以下任意一種：柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、高圣草素、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、圣草次苷、新北美圣草苷和5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷；二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)上述任一種分離方法分離得到。

進(jìn)一步地，黃酮組合物中的黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物至少包括以下任意一種：山奈酚-3-O-鼠李糖苷和山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷；黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)上述任一種分離方法分離得到。

進(jìn)一步地，黃酮組合物包括以下35種化合物：洋芹素、洋芹素-7-O-葡萄糖苷、洋芹素-7-O-葡糖醛酸苷、洋芹素-7-O-葡糖醛酸甲酯苷、羊紅膻酯、洋芹素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷、金合歡素、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷、金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷、日本椴苷、蒙花苷、柚皮素、異櫻花素、江戶櫻花苷、柚皮素-7-O-蕓香糖苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷、香蜂草苷、枳屬苷、高圣草素、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、圣草次苷、新北美圣草苷、5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷、槲皮素、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷、蘆丁和染料木苷；35種化合物通過(guò)上述任一種分離方法分離得到。

應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)綜合應(yīng)用各種先進(jìn)的色譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)風(fēng)輪菜中黃酮類化合物的有效分離。通過(guò)利用硅膠色譜載樣量大的特點(diǎn)，對(duì)風(fēng)輪菜中的總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行初步分離；利用凝膠色譜填料、MCI色譜填料和反相色譜填料無(wú)死吸附的特點(diǎn)，對(duì)總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分離，利用高效液相色譜高分離度的特點(diǎn)，對(duì)性質(zhì)相近的化合物進(jìn)行分離，得到目前為止種類最齊全的黃酮類化合物成分。由于風(fēng)輪菜中的總黃酮類物質(zhì)對(duì)心肌細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，本發(fā)明對(duì)風(fēng)輪菜中黃酮組合物的成分進(jìn)行了更全面的分離，得到了新的黃酮類成分，為黃酮組合物在治療心血管疾病的藥物中的應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為風(fēng)輪菜黃酮組合物在制藥中各有效活性成分含量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了理論依據(jù)。

附圖說(shuō)明

構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施例中黃酮組合物中35種化合物的結(jié)構(gòu)；以及

圖2示出了本發(fā)明的黃酮組合物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

在本發(fā)明中，黃酮類化合物是指具有黃酮類結(jié)構(gòu)、二氫黃酮類結(jié)構(gòu)、黃酮醇類結(jié)構(gòu)或者異黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物。

如背景技術(shù)部分所提到的，現(xiàn)有技術(shù)中并不清楚風(fēng)輪菜中所含的黃酮類物質(zhì)的具體成分，也不清楚其中真正起到活血化瘀作用的有效成分；因而在開發(fā)治療和/或預(yù)防心血管疾病方面的藥物時(shí)也無(wú)法確定各有效成分的含量。

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明在對(duì)現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)測(cè)定手段進(jìn)行改進(jìn)的基礎(chǔ)上，對(duì)唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜活血化瘀活性部位——風(fēng)輪菜總黃酮進(jìn)行了化學(xué)成分的分離和研究，并從中分離得到35種黃酮類成分，如圖1所示，這35種黃酮類成分分別為：洋芹素1，洋芹素-7-O-葡萄糖苷2，洋芹素-7-O-葡糖醛酸苷3，洋芹素-7-O-葡糖醛酸甲酯苷4，羊紅膻酯5，洋芹素-7-O-蕓香糖苷6，木犀草素7，木犀草苷8，木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷9，木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷10，木犀草素-7-O-蕓香糖苷11，木犀草素-7-O-新橙皮糖苷12，金合歡素13，金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷14，金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷15，日本椴苷16，蒙花苷17，柚皮素18，異櫻花素19，江戶櫻花苷20，柚皮素-7-O-蕓香糖苷21，柚皮素-7-O-新橙皮糖苷22，香蜂草苷23，枳屬苷24，高圣草素25，橙皮素-7-O-葡萄糖苷26，橙皮苷27，圣草次苷28，新北美圣草苷29，5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷30，槲皮素31，山奈酚-3-O-鼠李糖苷32，山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷33，蘆丁34，染料木苷35。

基于上述研究結(jié)果，在本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種從風(fēng)輪菜中黃酮類化合物的分離方法。上述分離方法包含以下步驟：

取風(fēng)輪菜的干燥地上部分，凈選、切段，用水進(jìn)行提取。提取液經(jīng)濃縮干燥后得的提取物，經(jīng)D101大孔樹脂層析，以乙醇體積濃度分別為20％、50％、70％以及95％的乙醇-水為洗脫劑，得到乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物，各洗脫物經(jīng)堿提酸沉法富集，精制后得到風(fēng)輪菜總黃酮類物質(zhì)；

風(fēng)輪菜總黃酮類物質(zhì)利用硅膠柱色譜進(jìn)行粗分離，以體積比分別為100：5，100：10，100：15，100：20，100：25的氯仿-甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，依次得到第1流分至320個(gè)流分共320個(gè)流分；其中體積比為100：5的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第1-90流分；體積比為100：10的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第91-190流分；體積比為100：15的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第191-260流分；體積比為100：20的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第261-310流分；體積比為100：25的氯仿-甲醇洗脫劑洗脫得到第311-320流分；

對(duì)第12-48流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，以體積比為4:6的氯仿-甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，薄層檢測(cè)合并相同組分，得到D1、D2和D3共3個(gè)流分。對(duì)D2流 分進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，以體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到化合物13和19；對(duì)D3流分進(jìn)行反相高效液相色譜分離，以體積比為60:40甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到化合物25；

對(duì)第49-55流分進(jìn)行Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜，以體積比為4：6氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后以體積比為60:40甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C18反相高效液相色譜分離，得到化合物1和18；

按照上述Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜和C-18反相高效液相色譜分離的條件，對(duì)第79-86流分進(jìn)行分離，得到化合物7和31；

對(duì)第133-176流分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以體積比分別為9:1、4:1、2:1、1:1和1:2的氯仿和丙酮為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，得到A1至A13共13個(gè)流分；然后以體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對(duì)所得13個(gè)流分進(jìn)行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35；

對(duì)第231-260流分進(jìn)行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水系統(tǒng)洗脫，對(duì)洗脫產(chǎn)物進(jìn)行薄層檢測(cè)合并相同組分，得到B1至B7共7個(gè)流分；然后對(duì)所得7個(gè)流分，按照上述C-18反相高效液相色譜分離條件進(jìn)行分離，得到化合物6、21、22、28、29、30和33；

對(duì)第295-310流分進(jìn)行MCI柱色譜分離，以體積比為60:40的甲醇-水系統(tǒng)洗脫，并對(duì)洗脫產(chǎn)物進(jìn)行薄層檢測(cè)合并相同組分，得到C1至C8共8個(gè)流分；然后對(duì)所得8個(gè)流分，按照上述C-18反相高效液相色譜分離條件依次對(duì)上述8個(gè)流分進(jìn)行分離，以甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，分別得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34。

本發(fā)明的上述分離方法，可以對(duì)其中的一種或多種新的成分進(jìn)行分離，也可以同時(shí)對(duì)上述35種化合物進(jìn)行分離。因而，無(wú)論是分離得到一種新的化合物成分，還是同時(shí)得到上述所有新的化合物成分，相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，都提供了種類更多、成分更齊全的黃酮類化合物，為研究風(fēng)輪菜黃酮類組合物在活性化瘀和治療心血管疾病方面的具體有效藥物成分奠定更全面的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在本發(fā)明另一種典型的實(shí)施方式中，提供了黃酮組合物，該黃酮組合物為風(fēng)輪菜的提取物，且包括黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物、二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物、黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物以及異黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物；其中，黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物至少包括以下任意一種：洋芹素-7-O-蕓香糖苷(6)、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷(9)、木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸正丁醇酯苷(10)、木犀草素-7-O-蕓香糖苷(11)、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷(12)、金合歡素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷(14)和金合歡素-7-O-β-D-蕓香糖苷(15)，上述黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)上述方法分離得到。包含了本申請(qǐng)的上述黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物的黃酮組合物，因具有相對(duì)較齊全的物質(zhì)組成，為從風(fēng)輪菜的天然產(chǎn)物中尋找具有良好療效的治療和/或預(yù)防心血管疾病的藥物提供了相對(duì)更豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)和更可靠的理論依據(jù)。

在另一種優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的黃酮組合物在二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物方面也有新的成分增加，至少包括以下任意一種：柚皮素-7-O-新橙皮糖苷(22)、高圣草素(25)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷(26)、圣草次苷(28)、新北美圣草苷(29)和5，7，3′，5′-四羥基二氫黃酮-7-O-新橙皮糖苷(30)。包含了上述二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物的黃酮組合物，相比現(xiàn)有技術(shù)的黃酮組合物，具有相對(duì)更全面的化合物組成，有更明確的候選藥物，為真正有效天然藥物成分的選擇提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的黃酮組合物既包含本發(fā)明的上述黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物，同時(shí)還包含二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物。在同時(shí)增加了上述兩類成分的基礎(chǔ)上所得到的黃酮類組合物成分更加齊全，更有利于后續(xù)的藥物篩選和研究。同樣的，上述二氫黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物也通過(guò)上述分離方法得到。

更優(yōu)選地，本發(fā)明所提供的黃酮組合物中的黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物至少包括以下任意一種：山奈酚-3-O-鼠李糖苷(32)和山奈酚3-O-吡喃鼠李糖-7-O-葡萄糖苷(33)。上述黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物通過(guò)上述分離法方法得到。因包含上述新的黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物，該黃酮組合物在黃酮醇類結(jié)構(gòu)的化合物方面具有更明確的物質(zhì)組成，在此基礎(chǔ)上，所得到的黃酮組合物中的化合物的種類也更多，為從中篩選出治療和/或預(yù)防心血管疾病的有效成分提供了更多樣化的選擇，為確定主要有效成分提供了更詳實(shí)的物質(zhì)依據(jù)。

在本發(fā)明的上述任一種黃酮組合物中，異黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物為染料木苷(35)。在本發(fā)明一種更優(yōu)選的實(shí)施例中，提供了一種包含了上述35種化合物的黃酮組合物，且這35種化合物采用上述分離方法得到。該黃酮組合物是目前為止，所分離到的黃酮類化合物種類最多的組合物，為從眾多的黃酮類化合物中明確對(duì)治療和/或預(yù)防心血管疾病的有效藥物提供了物質(zhì)依據(jù)，為進(jìn)一步確定藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

下面將結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。

需要說(shuō)明的是，下來(lái)實(shí)施例中所用的凝膠柱層析是指用Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠柱進(jìn)行層析，所說(shuō)的反相高效液相色譜分離是指用C-18反相高效液相色譜柱(Agilent phenyl9.4×250mm；填充物粒徑：5μm；V_MeOH:V_H2O＝40:60；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；流速：2ml/min)進(jìn)行分離。

實(shí)施例1：化合物制備。

取風(fēng)輪菜的干燥地上部分，凈選、切段，用水進(jìn)行提取。提取液經(jīng)濃縮干燥后得提取物，經(jīng)大孔樹脂層析，以乙醇體積濃度分別為20％、50％、70％以及95％的乙醇-水為洗脫劑，得到乙醇體積濃度分別為20％、50％和70％的洗脫物，再經(jīng)堿提酸沉法富集，精制后即得到風(fēng)輪菜總黃酮類物質(zhì)。

對(duì)總黃酮類物質(zhì)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，在分離過(guò)程中，分別用體積比為100：5、100：10、100：15、100：20和100：25的氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，依次得到第1-90流分、第91-190流分、第191-260流分、第261-310流分和第311-320流分；

對(duì)第12-48流分進(jìn)行羥丙基葡聚糖凝膠柱層析，在羥丙基葡聚糖凝膠柱層析的過(guò)程中，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，并經(jīng)薄層追蹤檢測(cè)合并相同組分，分別得到3個(gè)流分；然后以體積比為60:40的甲醇和水為洗脫劑，對(duì)第2個(gè)流分進(jìn)行C-18反相高效液相色譜分離，在第28.3min得到化合物13，在第26.9min得到化合物19；同樣，以體積為60:40的甲醇：水為洗脫劑，對(duì)第3個(gè)流分進(jìn)行C-18反相高效液相色譜分離，在第22.5min得到化合物25。

對(duì)第49-55流分進(jìn)行羥丙基葡聚糖凝膠柱色譜純化，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C-18反相高效液相制備色譜分離，在第24.2min得到化合物1，在第26.3min得到化合物18。

對(duì)第79-86流分進(jìn)行羥丙基葡聚糖凝膠凝膠柱色譜純化，以體積比為4：6的氯仿和甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑進(jìn)行C-18反相高效液相制備色譜分離，在第17.8min得到化合物7，在第20.3min得到化合物31。

對(duì)第133-176流分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以體積比為9:1，4:1，2:1，1:1，1:2的氯仿-丙酮為洗脫劑進(jìn)行洗脫，對(duì)各洗脫物經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，分別得到共得13個(gè)流分，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對(duì)13個(gè)流分進(jìn)行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物2、3、4、5、8、9、10、14、16、20、26、32和35。

對(duì)第231-260流分經(jīng)MCI柱色譜分離，以體積比分別為30:70和50:50的甲醇和水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到E1-E30共30個(gè)組分，經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，共得7個(gè)流分；然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對(duì)7個(gè)流分進(jìn)行C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物6、21、22、28、29、30和33；以及

對(duì)第295-310經(jīng)MCI柱色譜分離，以體積比分別為30:70和50:50的甲醇-水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，經(jīng)薄層檢測(cè)合并相同組分，共得8個(gè)流分，然后用體積比為60:40的甲醇和水作為洗脫劑，分別對(duì)8個(gè)流分經(jīng)C-18反相高效液相色譜分離，依次得到化合物11、12、15、17、23、24、27和34。

實(shí)施例2：本發(fā)明的風(fēng)輪菜黃酮組合物總黃酮對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

大鼠心肌細(xì)胞H9C2以1×10⁵的密度接種于96孔板中培養(yǎng)36h后，風(fēng)輪菜黃酮組合物(1.5625、3.125、6.25、12.5、25，50μg/ml)預(yù)處理4h，缺氧6h，復(fù)氧24h。去上清，5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)孵育4h。棄上清，每孔加150μl DMSO溶解，570nm酶標(biāo)儀(Spectrafluor、TECAN、Sunrise、Austria)檢測(cè)吸光度。結(jié)果如圖2所示，其中，以正常細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，以缺氧處理未加藥的細(xì)胞為陰性對(duì)照，從圖2可以看出，本發(fā)明所提供的風(fēng)輪菜黃酮組合物能夠保護(hù)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡，且呈濃度依賴性。

從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了如下技術(shù)效果：本發(fā)明通過(guò)綜合應(yīng)用各種先進(jìn)的色譜技術(shù)，利用硅膠色譜載樣量大的特點(diǎn)，對(duì)風(fēng)輪菜中的總黃酮類物質(zhì)進(jìn) 行初步分離；利用凝膠色譜填料、MCI色譜填料和反相色譜填料無(wú)死吸附的特點(diǎn)，對(duì)總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分離，利用高效液相色譜高分離度的特點(diǎn)，對(duì)性質(zhì)相近的化合物進(jìn)行分離。由于黃酮組合物對(duì)心肌細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，且本發(fā)明對(duì)風(fēng)輪菜中黃酮組合物的成分進(jìn)行了更全面的分離，得到了新的黃酮類成分，為黃酮組合物在治療心血管疾病的藥物中的應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為風(fēng)輪菜黃酮組合物在制藥中各有效活性成分含量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了理論依據(jù)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。