本發(fā)明屬于醫(yī)療產(chǎn)品
技術(shù)領域：
，具體而言，涉及一種特異性檢測結(jié)核分枝桿菌感染的蛋白。
背景技術(shù)：
：我國體外診斷產(chǎn)業(yè)現(xiàn)正處于快速增長時期。然而巨大的市場需求與我國診斷試劑行業(yè)相對落后的自主研發(fā)能力的存明顯的差距。如何從源頭上開展自主創(chuàng)新，如何在診斷試劑原材料供應上不受制于個別境外醫(yī)藥巨頭，如何將現(xiàn)有的生物醫(yī)藥領域的科研成果轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品是我國政府、科研院所和醫(yī)藥行業(yè)在近年來都非常關注的熱點。并且現(xiàn)今市場上對更靈敏、高效的診斷試劑提出了剛性需求，能夠快速準確的確診結(jié)核病患者對于醫(yī)務工作者和病人本人都具有重要意義。近年來數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，有結(jié)核病癥狀的患者76.6％接受過結(jié)核病病前相關檢查，但是僅有35.8％被診斷為肺結(jié)核患者，提高病人發(fā)現(xiàn)率仍是當前結(jié)核病防治工作的重點也是難點。利用抗原特異性T細胞的細胞免疫反應進行病原微生物感染的體外診斷，是今年發(fā)展起來的一種新的檢測方法。我們通過分離新鮮全血中的外周血單核細胞并進行刺激培養(yǎng)，然后利用ELISPOT檢測能夠分泌IFN-γ的細胞的數(shù)量。該方法目前主要應用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學診斷和病原學診斷，對結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時，在結(jié)核病篩查過程中，直接檢測病原體或檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述臨床實際工作情況，我們篩選了結(jié)核分枝桿菌來源的蛋白片段，提供了一種檢測結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌標識物抗原，通過該抗原來體外檢測特異性T細胞免疫反應，可以作為診斷結(jié)核病患者的參照，用于診斷患者是否被結(jié)核分枝桿菌感染。同時，進一步動物實驗表明，該蛋白抗原能夠誘導針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應，具有制備相應的疫苗的功能。具體而言，本發(fā)明首先涉及一種結(jié)核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv3710c，所述的抗原氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)為：編碼所述蛋白抗原Rv3710c的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA序列結(jié)構(gòu)為：本發(fā)明還涉及所述的蛋白抗原Rv3710c的制備方法，該方法包括如下步驟，方法一：步驟(1)以LREnzymemix催化Rv3710c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設的PFGRC所免費提供)和pDESTTM17載體重組生成Rv3710c的表達載體；步驟(2)將步驟(1)所述Rv3710c的表達載體轉(zhuǎn)化目標表達宿主，表達目標Rv3710c蛋白；步驟(3)破碎細胞收集蛋白并復性目標蛋白。所述的步驟(1)的具體方法是：a.克隆反應體系：Rv3710c的入門載體1.5μL，pDESTTM17載體1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反應條件：25℃，過夜反應；b.轉(zhuǎn)化方法：反應體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h；c.質(zhì)粒提?。阂訬96高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP114)提取質(zhì)粒，獲得Rv3710c的表達載體；所述的步驟(2)的具體方法是：a.取1μL步驟(1)獲得的質(zhì)粒溶液加入100μl大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)，冰浴30min后，42℃熱激90s；b.體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h；c.以0.75mMIPTG誘導Rv3710c蛋白表達；所述的步驟(3)的具體方法是：a.以重懸液：60mMtrisPH9.0，0.15MEDTA重懸細菌，在4℃條件下使用超聲波破碎儀超聲破碎細菌；b.4℃，10000rpm離心15min收集沉淀即為固體形態(tài)包涵體，目標蛋白電泳結(jié)果如圖2所示。c.以溶解液(60mMTris-HClPH7.0，10M尿素，15mMDTT，1mMEDTA)溶解包涵體；第一次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析，透析液成分為：20mMTris-HClPH9.0，1M尿素，3mML-Argine；d.再透析第二次，透析液成分為：20mMTris-HClPH9.0，10mMNaCl，第二次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫原篩選的蛋白；方法二：步驟(1)表達含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白并收集表達宿主菌體：步驟(2)收集含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白：步驟(3)純化目標融合蛋白。所述步驟(1)的具體方法為：1)采用E.coliBL21菌株表達6*His-Nus.a-Rv3710c融合蛋白；2)LB平板劃線活化(加入相應抗生素)，37℃靜置過夜(12h左右)；3)接種于5ml液體LB培養(yǎng)基(加入相應抗生素)37℃200rpm，培養(yǎng)至OD大于0.6-0.8(大約3h)；4)按接種量1-3％接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8(大約3h)。降溫到16℃，加入IPTG至終濃度0.1mM；5)16℃，200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)16h，4℃，4000rpm離心15min收集菌體。所述步驟(2)的具體方法為：1)菌體重懸：每1L培養(yǎng)基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(如需加入蛋白酶抑制劑PMSF，則終濃度為0.5-1mM；)2)菌體破碎：超聲3s、間隔9s、功率為38％，超聲30min。(懸濁液透亮為標準，酌情調(diào)整超聲 工作總時間)如使用高壓細胞破碎儀破碎1-2次，所需時間10min左右；3)去除細菌碎片：4℃，15000-18000rpm離心20分鐘，4)上樣：上述上清液體與柱材料Ni-NTA樹脂(NovagenCat.NO70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右。所述步驟(3)的具體方法為：1)10倍柱體積左右的lysisbuffer流過重力柱，重復2次(每次必須重力柱中液體流凈才能進行下一次加液體)；2)10倍柱體積左右的20mM咪唑的lysisbuffer流過重力柱，重復3次(同上)；3)收集洗脫混勻樣品用于檢測洗雜效果；4)1-2倍柱體積左右的Elutionbuffer流過重力柱，重復3次(同上)，分管收集。用bradford試劑檢測洗脫液，了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白，則繼續(xù)洗脫，直至完全；5)檢測：SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在；6)透析以截留分子量為3K的透析袋在4℃下過夜透析洗脫液，外圍透析液為PBS，同時加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，產(chǎn)生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv3710c；7)將酶切產(chǎn)物與Ni-NTA樹脂4℃撫育30min，收集穿透樣品獲得目的片段Rv3710c，同時6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都將與Ni-NTA樹脂結(jié)合從而被清除；8)以HiTrapQHP(GECat.NO17-1154-01)純化以上獲取蛋白，獲得高純度樣品。本發(fā)明還涉及所述的Rv3710c蛋白抗原作為檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫原的應用，所述的應用包括，(1)將該Rv3710c蛋白抗原單獨用于檢測結(jié)核分枝桿菌；或(2)將該Rv3710c抗原與現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原聯(lián)用，用于檢測結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還涉及所述的Rv3710c蛋白抗原在制備結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒中的應用，所述的應用為，(1)將所述的Rv3710c蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒；或(2)將所述Rv3710c蛋白抗原和現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原協(xié)同聯(lián)用，增加現(xiàn)有抗原免疫檢測準確度。所述的現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原為結(jié)核分枝桿菌來源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。本發(fā)明還涉及由所述的Rv3710c蛋白抗原制備的單一抗原型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優(yōu)選濃度為75ug/ml)的Rv3710c蛋白抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發(fā)明還涉及包含所述的Rv3710c蛋白抗原的多抗原聯(lián)用型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優(yōu)選濃度為75ug/ml)的Rv3710c蛋白抗原，以及檢測有效量的其他抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發(fā)明還涉及所述的單一型或聯(lián)用型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒的應用，其特征在于，所述的檢測方法為，(1)檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細胞；(2)Rv3710c蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細胞孵育20-30個小時，優(yōu)選20-24個小時(3)檢測受到Rv3710c蛋白抗原刺激分泌的細胞因子，與陽性參照對比確定檢測結(jié)果，所述的細胞因子為IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12，優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta，進一步優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13，最優(yōu)選IFN-gamma。本發(fā)明還涉及所述Rv3710c抗原在制備抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗中的應用。附圖說明圖1.Pdest17-Rv3710c表達載體酶切驗證結(jié)果，泳道E4為酶切后的條帶。圖2.Rv3710c蛋白質(zhì)SDS-PAGE檢測圖，左側(cè)為Marker(單位Kd)，具體實施方式實施例1.Rv3710c-pDEST17表達載體構(gòu)建及目標蛋白Rv3710c的表達及復性(方法一)以LREnzymemix催化Rv3710c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設的PFGRC所免費提供)和pDESTTM17載體重組生成Rv3710c的表達載體。具體方法：A.克隆反應體系：Rv3710c的入門載體1.5μL，pDESTTM17載體1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反應條件：25℃，過夜反應。B.轉(zhuǎn)化方法：反應體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h。C.質(zhì)粒提?。阂訬96高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP114)提取質(zhì)粒，獲得Rv3710c的表達載體。D.酶切驗證：以BsrG1酶切試劑盒(R0575SNEB)酶切質(zhì)粒驗證克隆是否完成，結(jié)果如圖1所示結(jié)果顯示，酶切片段大小約為700bp，質(zhì)粒構(gòu)建成功。將獲得的Rv3710c的表達載體導入rosetta(DE3)表達載體中，具體方法為：a.取1μL質(zhì)粒溶液加入100μrosetta(DE3)感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，b.體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h；c.以0.75mMIPTG誘導Rv047c蛋白表達。2.超聲破碎細菌后超速離心，獲取包涵體固體沉淀并收集蛋白及復性步驟具體方法為：a.以重懸液：PBS重懸細菌，在4℃條件下使用超聲波破碎儀超聲破碎細菌；b.4℃，10000rpm離心20min收集沉淀即為固體形態(tài)包涵體，對收集的蛋白的電泳結(jié)果如圖2所示。c.以溶解液(PBS+10M尿素)溶解包涵體；第一次透析：以截留分子量為3.5K的透析袋過夜透析將蛋白透析，透析液成分為：PBS，1M尿素，3mML-Argine；d.再透析第二次，透析液為PBS，第二次透析：以截留分子量為3.5K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫原篩選的蛋白。實施例2.含多聚組氨酸標簽的Rv3710c表達載體構(gòu)建及目標蛋白Rv3710c的表達及復性(方法二)1.表達含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白并收集宿主菌體：1)采用E.coliBL21菌株表達6*His-Nus.a-Rv3710c融合蛋白；2)LB平板劃線活化(加入相應抗生素)，37℃靜置過夜(12h左右)；3)接種于5ml液體LB培養(yǎng)基(加入相應抗生素)37℃200rpm，培養(yǎng)至OD大于0.6-0.8(大約3h)；4)按接種量1-3％接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8(大約3h)。降溫到16℃，加入IPTG至終濃度0.1mM；5)16℃，200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)16h，4℃，4000rpm離心15min收集菌體；2.收集含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白：1)菌體重懸：每1L培養(yǎng)基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(如需加入蛋白酶抑制劑PMSF，則終濃度為0.5-1mM；)2)菌體破碎：超聲3s、間隔9s、功率為38％，超聲30min。(懸濁液透亮為標準，酌情調(diào)整超聲工作總時間)如使用高壓細胞破碎儀破碎1-2次，所需時間10min左右；3)去除細菌碎片：4℃，15000-18000rpm離心20分鐘，4)上樣：上述上清液體與柱材料Ni-NTA樹脂(NovagenCat.NO70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右；3.純化目標融合蛋白：3.1洗雜蛋白：1)10倍柱體積左右的lysisbuffer流過重力柱，重復2次(每次必須重力柱中液體流凈才能進行下一次加液體)；2)10倍柱體積左右的20mM咪唑的lysisbuffer流過重力柱，重復3次(同上)；3)收集洗脫混勻樣品用于檢測洗雜效果；3.2目的蛋白洗脫：1)1-2倍柱體積左右的Elutionbuffer流過重力柱，重復3次(同上)，分管收集。用bradford試劑檢測洗脫液，了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白，則繼續(xù)洗脫，直至完全；2)檢測：SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在；3)透析以截留分子量為3K的透析袋在4℃下過夜透析洗脫液，外圍透析液為PBS，同時加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，產(chǎn)生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv3710c；4)將酶切產(chǎn)物與Ni-NTA樹脂4℃撫育30min，收集穿透樣品獲得目的片段Rv3710c，同時6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都將與Ni-NTA樹脂結(jié)合從而被清除；5)以HiTrapQHP(GECat.NO17-1154-01)純化以上獲取蛋白，獲得高純度樣品。實施例3.目標蛋白Rv3710c的免疫原性測試為了檢測Rv3710c的免疫原性及其對于現(xiàn)有抗原檢測試劑盒的增強效果，對于來自北京胸科醫(yī)院臨床確診的多個病例進行了進一步的抗原檢測篩選。測試血樣：來自北京胸科醫(yī)院就診患者陽性對照試劑與耗材：T-SPOT試劑盒(ESAT-6和CFP10雙抗原試劑盒)，Oxfordimmunotec(英國)產(chǎn)品，陰性對照：Rv2327蛋白抗原，隨機選取的另一段來源于結(jié)核分枝桿菌的已知蛋白片段Rv2327，其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示SEQIDNo.4SEQIDNo.3實驗方法及評價方法如下：1)肝素抗凝血，抗凝血樣本按體積1:1與RPMI1640混勻；按2-3:1比例小心將血樣加在Ficoll淋巴細胞分離液上層；2)1000g離心22分鐘；水平轉(zhuǎn)子，緩升緩降；3)將單核細胞層(位于離心管中間層，為一層較薄的白膜狀)從Ficoll分離管中轉(zhuǎn)移到已加10mlAIM-V培養(yǎng)液的無菌15ml離心管，輕輕混勻，室溫600g離心7min；4)小心去除上清，加入1mlAIM-V，輕緩重懸細胞，加入AIM-V培養(yǎng)液至10ml,350g離心7min；5)小心棄上清，加入1mlAIM-V培養(yǎng)液重懸細胞；6)細胞計數(shù)及稀釋，取10μl細胞懸液加入40μl的1％trypanblue，制備1：5細胞稀釋液，進行活細胞計數(shù)，計算細胞稀釋需要的體積并加入相應的AIM-V無血清培養(yǎng)液制備細胞稀釋液，試劑盒檢測要求加入每孔(24孔PVDF膜板)細胞數(shù)量2.5×105；7)將培養(yǎng)板從鋁封袋中取出，按順序加入：50μlAIMV至陰性對照孔；50μl抗原ESAT-6至抗原A孔；50μl抗原CFP10至抗原B孔；50μl陽性對照至陽性對照孔；在上述4孔中分別加入已制備細胞稀釋工作液100μl。50μl實施例2制備獲得的Sampleprotein(初始濃度為60ug/ml)加入到樣品孔中，隨后加入培養(yǎng)基和細胞，樣品孔中Sampleprotein的終濃度為初始濃度的1/3。8)將培養(yǎng)板放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育16-20hrs。9)用無菌PBS按1:200制備新鮮酶標抗體工作液。從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)液體。以200μl/well無菌PBS洗滌4遍。10)加入50μl/well酶標抗體工作液，將培養(yǎng)板在2-8℃孵育1小時。用PBS洗滌4遍去除未結(jié)合酶標抗體。11)每孔加入室溫平衡過的底物工作液50μl，室溫反應7分鐘。以蒸餾水沖洗終止反應，在37℃2-3hrs或室溫過夜干燥培養(yǎng)板。免疫原測試結(jié)果和分析：免疫原性測試在胸科醫(yī)院分子生物學實驗室進行，測試選用一定數(shù)量的已臨床確診的結(jié)核病患者，通過使用各種蛋白抗原檢測上述已確診患者的血樣，并由此結(jié)果分析Rv3710c蛋白抗原的免疫原性及應用方向，具體的檢測結(jié)果統(tǒng)計見下表1所示，表1.Rv3710c抗原對住院已確診結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果-AB+Rv3710diagnosis010761559腰椎結(jié)核01853586耐多藥結(jié)核病4291982428胸椎結(jié)核4110968427初治菌陽肺結(jié)核314854314結(jié)核性胸膜炎胸壁結(jié)核073666520初治菌陽肺結(jié)核071472630結(jié)核性胸膜炎0411086110浸潤型肺結(jié)核0009886浸潤型肺結(jié)核085338409粟粒性肺結(jié)核胸壁結(jié)核031042074復治肺結(jié)核029599669耐多藥結(jié)核病0572049045浸潤型肺結(jié)核0355319902復治肺結(jié)核0106762多發(fā)性漿膜腔積液427132108416浸潤型肺結(jié)核0520118210肺部陰影矽肺0741421365腎結(jié)核頸部淋巴結(jié)結(jié)核0527108145非霍奇金淋巴瘤肺部感染0293502018復治肺結(jié)核11783260018復治肺結(jié)核1007971肺部陰影0105022浸潤型肺結(jié)核1101757254肺部陰影17136899724復治肺結(jié)核00010851腰椎結(jié)核5227636支氣管囊腫肺炎20242318胸壁腫物01865778胸椎結(jié)核腰椎結(jié)核10505713844腕關節(jié)結(jié)核浸潤型肺結(jié)核7151643348頸椎結(jié)核胸椎結(jié)核1007220腰椎結(jié)核骶骨結(jié)核069153607恥骨結(jié)核6502483082結(jié)核性胸膜炎01301241019結(jié)核性胸膜炎64414449625浸潤型肺結(jié)核3381569318初治菌陽肺結(jié)核11412010958浸潤型肺結(jié)核3111822402浸潤型肺結(jié)核51707237浸潤型肺結(jié)核10403513724196粟粒性肺結(jié)核/縱隔淋巴結(jié)結(jié)核3257562浸潤型肺結(jié)核052558272初治菌陽肺結(jié)核08125486肺結(jié)核02036513氣管結(jié)核036656932復治肺結(jié)核0102312948浸潤型肺結(jié)核26335694右肺惡腫/縱隔淋巴結(jié)炎繼發(fā)惡腫47514978011胸腔積液心包積液*注：無反應應答患者不同于T-spot試劑盒檢測無應答對象。表1.Rv3710c抗原對住院已確診結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果有11例是T-spot試劑盒檢測沒有結(jié)果，但是Rv3710c可以篩選出。Rv3710c的結(jié)果明顯優(yōu)于T-spot的檢測結(jié)果。檢測結(jié)果表明，Rv3710c蛋白抗原的能夠更有效的檢測結(jié)核分枝桿菌，若與其他陽性抗原聯(lián)用，能夠更有效的提高檢出率。更為重要的是Rv3710c能夠檢測出T-spot檢測為陰性的結(jié)果。明顯能夠提高結(jié)核病初篩檢出率。最后需要說明的是，以上實施例僅供本領域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實質(zhì)，并不用作對本法保護范圍的限定。當前第1頁1 2 3