本發(fā)明屬于醫(yī)療產(chǎn)品
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種特異性檢測結(jié)核分枝桿菌感染的蛋白。
背景技術(shù)：
：我國體外診斷產(chǎn)業(yè)現(xiàn)正處于快速增長時期。然而巨大的市場需求與我國診斷試劑行業(yè)相對落后的自主研發(fā)能力的存明顯的差距。如何從源頭上開展自主創(chuàng)新，如何在診斷試劑原材料供應(yīng)上不受制于個別境外醫(yī)藥巨頭，如何將現(xiàn)有的生物醫(yī)藥領(lǐng)域的科研成果轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品是我國政府、科研院所和醫(yī)藥行業(yè)在近年來都非常關(guān)注的熱點。并且現(xiàn)今市場上對更靈敏、高效的診斷試劑提出了剛性需求，能夠快速準確的確診結(jié)核病患者對于醫(yī)務(wù)工作者和病人本人都具有重要意義。近年來數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，有結(jié)核病癥狀的患者76.6％接受過結(jié)核病病前相關(guān)檢查，但是僅有35.8％被診斷為肺結(jié)核患者，提高病人發(fā)現(xiàn)率仍是當前結(jié)核病防治工作的重點也是難點。利用抗原特異性T細胞的細胞免疫反應(yīng)進行病原微生物感染的體外診斷，是今年發(fā)展起來的一種新的檢測方法。我們通過分離新鮮全血中的外周血單核細胞并進行刺激培養(yǎng)，然后利用ELISPOT檢測能夠分泌IFN-γ的細胞的數(shù)量。該方法目前主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷。目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷主要依賴于臨床癥狀、影響學(xué)診斷和病原學(xué)診斷，對結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染的診斷不敏感。同時，在結(jié)核病篩查過程中，直接檢測病原體或檢測結(jié)核分枝桿菌抗體的靈敏度和特異性也不理想。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述臨床實際工作情況，我們篩選了結(jié)核分枝桿菌來源的蛋白片段，提供了一種檢測結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌標識物抗原，通過該抗原來體外檢測特異性T細胞免疫反應(yīng)，可以作為診斷結(jié)核病患者的參照，用于診斷患者是否被結(jié)核分枝桿菌感染。同時，進一步動物實驗表明，該蛋白抗原能夠誘導(dǎo)針對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)，具有制備相應(yīng)的疫苗的功能。具體而言，本發(fā)明首先涉及一種結(jié)核分枝桿菌的特異性蛋白抗原Rv1098c，所述的抗原氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)為：編碼所述蛋白抗原Rv1098c的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA序列結(jié)構(gòu)為：本發(fā)明還涉及所述的蛋白抗原Rv1098c的制備方法，該方法包括如下步驟，方法一：步驟(1)以LREnzymemix催化Rv1098c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設(shè)的PFGRC所免費提供)和pDESTTM17載體重組生成Rv1098c的表達載體；步驟(2)將步驟(1)所述Rv1098c的表達載體轉(zhuǎn)化目標表達宿主，表達目標Rv1098c蛋白；步驟(3)破碎細胞收集蛋白并復(fù)性目標蛋白。所述的步驟(1)的具體方法是：a.克隆反應(yīng)體系：Rv1098c的入門載體1.5μL，pDESTTM17載體1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反應(yīng)條件：25℃，過夜反應(yīng)；b.轉(zhuǎn)化方法：反應(yīng)體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復(fù)性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h；c.質(zhì)粒提取：以N96高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP114)提取質(zhì)粒，獲得Rv1098c的表達載體；所述的步驟(2)的具體方法是：a.取1μL步驟(1)獲得的質(zhì)粒溶液加入100μl大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)，冰浴30min后，42℃熱激90s；b.體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復(fù)性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h；c.以0.75mMIPTG誘導(dǎo)Rv1098c蛋白表達；所述的步驟(3)的具體方法是：a.以重懸液：60mMtrisPH9.0，0.15MEDTA重懸細菌，在4℃條件下使用超聲波破碎儀超聲破碎細菌；b.4℃，10000rpm離心15min收集沉淀即為固體形態(tài)包涵體，目標蛋白電泳結(jié)果如圖2所示。c.以溶解液(60mMTris-HClPH7.0，10M尿素，15mMDTT，1mMEDTA)溶解包涵體；第一次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析，透析液成分為：20mMTris-HClPH9.0，1M尿素，3mML-Argine；d.再透析第二次，透析液成分為：20mMTris-HClPH9.0，10mMNaCl，第二次透析：以截留分子量為3K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫原篩選的蛋白。方法二：步驟(1)表達含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白并收集表達宿主菌體：步驟(2)收集含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白：步驟(3)純化目標融合蛋白。所述步驟(1)的具體方法為：1)采用E.coliBL21菌株表達6*His-Nus.a-Rv1098cc融合蛋白；2)LB平板劃線活化(加入相應(yīng)抗生素)，37℃靜置過夜(12h左右)；3)接種于5ml液體LB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)抗生素)37℃200rpm，培養(yǎng)至OD大于0.6-0.8(大約3h)；4)按接種量1-3％接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8(大約3h)。降溫到16℃，加入IPTG至終濃度0.1mM；5)16℃，200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)16h，4℃，4000rpm離心15min收集菌體。所述步驟(2)的具體方法為：1)菌體重懸：每1L培養(yǎng)基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(如需加入蛋白酶抑制劑PMSF，則終濃度為0.5-1mM；)2)菌體破碎：超聲3s、間隔9s、功率為38％，超聲30min。(懸濁液透亮為標準，酌情調(diào)整超聲工作總時間)如使用高壓細胞破碎儀破碎1-2次，所需時間10min左右；3)去除細菌碎片：4℃，15000-18000rpm離心20分鐘，4)上樣：上述上清液體與柱材料Ni-NTA樹脂(NovagenCat.NO70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右。所述步驟(3)的具體方法為：1)10倍柱體積左右的lysisbuffer流過重力柱，重復(fù)2次(每次必須重力柱中液體流凈才能進行下一次加液體)；2)10倍柱體積左右的20mM咪唑的lysisbuffer流過重力柱，重復(fù)3次(同上)；3)收集洗脫混勻樣品用于檢測洗雜效果；4)1-2倍柱體積左右的Elutionbuffer流過重力柱，重復(fù)3次(同上)，分管收集，用bradford試劑檢測洗脫液，了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白，則繼續(xù)洗脫，直至完全；5)檢測：SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在；6)透析以截留分子量為3K的透析袋在4℃下過夜透析洗脫液，外圍透析液為PBS，同時加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，產(chǎn)生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv1098c；7)將酶切產(chǎn)物與Ni-NTA樹脂4℃撫育30min，收集穿透樣品獲得目的片段Rv1098c，同時6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都將與Ni-NTA樹脂結(jié)合從而被清除；8)以HiTrapQHP(GECat.NO17-1154-01)純化以上獲取蛋白，獲得高純度樣品。本發(fā)明還涉及所述的Rv1098c蛋白抗原作為檢測結(jié)核分枝桿菌的免疫原的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括，(1)將該Rv1098c蛋白抗原單獨用于檢測結(jié)核分枝桿菌；或(2)將該Rv1098c抗原與現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原聯(lián)用，用于檢測結(jié)核分枝桿菌。本發(fā)明還涉及所述的Rv1098c蛋白抗原在制備結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為，(1)將所述的Rv1098c蛋白抗原單獨作為檢測抗原制備檢測試劑盒；或(2)將所述Rv1098c蛋白抗原和現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原協(xié)同聯(lián)用，增加現(xiàn)有抗原免疫檢測準確度。所述的現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌檢測抗原為結(jié)核分枝桿菌來源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PPD抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。本發(fā)明還涉及由所述的Rv1098c蛋白抗原制備的單一抗原型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優(yōu)選濃度為75ug/ml)的Rv1098c蛋白抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發(fā)明還涉及包含所述的Rv1098c蛋白抗原的多抗原聯(lián)用型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒，所述試劑盒包含，(1)檢測有效量濃度(優(yōu)選濃度為75ug/ml)的Rv1098c蛋白抗原，以及檢測有效量的其他抗原；(2)必要的檢測試劑及顯色試劑。本發(fā)明還涉及所述的單一型或聯(lián)用型結(jié)核分枝桿菌檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述的檢測方法為，(1)檢測樣品為由待測患者血樣制備得到的抗凝全血或PBMC細胞；(2)Rv1098c蛋白抗原作為免疫原與抗凝全血或者PBMC細胞孵育20-30個小時，優(yōu)選20-24個小時(3)檢測受到Rv1098c蛋白抗原刺激分泌的細胞因子，與陽性參照對比確定檢測結(jié)果，所述的細胞因子為IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10和IL-12，優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-1ra、GM-CSF、MIP-1betta，進一步優(yōu)選IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13，最優(yōu)選IFN-gamma。本發(fā)明還涉及所述Rv1098c抗原在制備抗結(jié)核分枝桿菌的疫苗中的應(yīng)用。附圖說明圖1.Pdest17-Rv1098c表達載體酶切驗證結(jié)果，泳道A2為酶切后的條帶。圖2.Rv1098c蛋白質(zhì)SDS-PAGE檢測圖，左側(cè)為Marker(單位Kd)，圖3.結(jié)核分枝桿菌攻毒感染模型豚鼠的肺部照片圖4.結(jié)核分枝桿菌攻毒感染模型豚鼠各個組織切片的免疫組化照片具體實施方式實施例1.Rv1098c-pDEST17表達載體構(gòu)建及目標蛋白Rv1098c的表達及復(fù)性(方法一)以LREnzymemix催化Rv1098c的入門載體(美國CraigVentorInstitute下設(shè)的PFGRC所免費提供)和pDESTTM17載體重組生成Rv1098c的表達載體。具體方法：A.克隆反應(yīng)體系：Rv1098c的入門載體1.5μL，pDESTTM17載體1μL，BPIIEnzymemix2.5μL；反應(yīng)條件：25℃，過夜反應(yīng)。B.轉(zhuǎn)化方法：反應(yīng)體系中加入100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復(fù)性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20h。C.質(zhì)粒提取：以N96高純度質(zhì)粒小提試劑盒(DP114)提取質(zhì)粒，獲得Rv1098c的表達載體。D.酶切驗證：以BsrG1酶切試劑盒(R0575SNEB)酶切質(zhì)粒驗證克隆是否完成，結(jié)果如圖1所示結(jié)果顯示，酶切片段大小約為700bp，質(zhì)粒構(gòu)建成功。將獲得的Rv1098c的表達載體導(dǎo)入rosetta(DE3)表達載體中，具體方法為：a.取1μL質(zhì)粒溶液加入100μrosetta(DE3)感受態(tài)(自制)，冰浴30min后，42℃熱激90s，b.體系冰上放置10min，加入200μLLB培養(yǎng)基復(fù)性后，涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h；c.以0.75mMIPTG誘導(dǎo)Rv1098c蛋白表達。2.超聲破碎細菌后超速離心，獲取包涵體固體沉淀并收集蛋白及復(fù)性步驟具體方法為：a.以重懸液：PBS重懸細菌，在4℃條件下使用超聲波破碎儀超聲破碎細菌；b.4℃，10000rpm離心20min收集沉淀即為固體形態(tài)包涵體，對收集的蛋白的電泳結(jié)果如圖2所示。c.以溶解液(PBS+10M尿素)溶解包涵體；第一次透析：以截留分子量為3.5K的透析袋過夜透析 將蛋白透析，透析液成分為：PBS，1M尿素，3mML-Argine；d.再透析第二次，透析液為PBS，第二次透析：以截留分子量為3.5K的透析袋過夜透析將蛋白透析至透析液，即可獲得可直接用于免疫原篩選的蛋白。實施例2.含多聚組氨酸標簽的Rv1098c表達載體構(gòu)建及目標蛋白Rv1098c的表達及復(fù)性(方法二)1.表達含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白并收集宿主菌體：1)采用E.coliBL21菌株表達6*His-Nus.a-Rv1098c融合蛋白；2)LB平板劃線活化(加入相應(yīng)抗生素)，37℃靜置過夜(12h左右)；3)接種于5ml液體LB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)抗生素)37℃200rpm，培養(yǎng)至OD大于0.6-0.8(大約3h)；4)按接種量1-3％接種于300mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600≈0.6-0.8(大約3h)。降溫到16℃，加入IPTG至終濃度0.1mM；5)16℃，200rpm培養(yǎng)培養(yǎng)16h，4℃，4000rpm離心15min收集菌體；2.收集含有多聚組氨酸標簽的目標融合蛋白：1)菌體重懸：每1L培養(yǎng)基所收集的菌體用40ml左右lysisbuffer重懸(如需加入蛋白酶抑制劑PMSF，則終濃度為0.5-1mM；)2)菌體破碎：超聲3s、間隔9s、功率為38％，超聲30min。(懸濁液透亮為標準，酌情調(diào)整超聲工作總時間)如使用高壓細胞破碎儀破碎1-2次，所需時間10min左右；3)去除細菌碎片：4℃，15000-18000rpm離心20分鐘，4)上樣：上述上清液體與柱材料Ni-NTA樹脂(NovagenCat.NO70691-5)4℃孵育1h-1.5h左右；3.純化目標融合蛋白：3.1洗雜蛋白：1)10倍柱體積左右的lysisbuffer流過重力柱，重復(fù)2次(每次必須重力柱中液體流凈才能進行下一次加液體)；2)10倍柱體積左右的20mM咪唑的lysisbuffer流過重力柱，重復(fù)3次(同上)；3)收集洗脫混勻樣品用于檢測洗雜效果；3.2目的蛋白洗脫：1)1-2倍柱體積左右的Elutionbuffer流過重力柱，重復(fù)3次(同上)，分管收集。用bradford試劑檢測洗脫液，了解蛋白是否完全洗脫。如含有蛋白，則繼續(xù)洗脫，直至完全；2)檢測：SDS-PAGE檢測目的蛋白是否存在；3)透析以截留分子量為3K的透析袋在4℃下過夜透析洗脫液，外圍透析液為PBS，同時加入HRV3c蛋白酶限制性酶切融合蛋白，產(chǎn)生6*His-Nus.a片段和目的片段Rv1098c；4)將酶切產(chǎn)物與Ni-NTA樹脂4℃撫育30min，收集穿透樣品獲得目的片段Rv1098c，同時6*His-Nus.a，HRV3c以及未酶切完全的融合蛋白都將與Ni-NTA樹脂結(jié)合從而被清除；5)以HiTrapQHP(GECat.NO17-1154-01)純化以上獲取蛋白，獲得高純度樣品。實施例3.目標蛋白Rv1098c的免疫原性測試為了檢測Rv1098c的免疫原性及其對于現(xiàn)有抗原檢測試劑盒的增強效果，對于來自北京胸科醫(yī)院臨床確診的多個病例進行了進一步的抗原檢測篩選。測試血樣：來自北京胸科醫(yī)院就診患者陽性對照試劑與耗材：T-SPOT試劑盒(ESAT-6和CFP10雙抗原試劑盒)，Oxfordimmunotec(英國)產(chǎn)品，陰性對照：Rv2327蛋白抗原，隨機選取的另一段來源于結(jié)核分枝桿菌的已知蛋白片段Rv2327，其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQIDNO.3及SEQIDNO.4所示SEQIDNo.4SEQIDNo.3實驗方法及評價方法如下：1)肝素抗凝血，抗凝血樣本按體積1:1與RPMI1640混勻；按2-3:1比例小心將血樣加在Ficoll淋巴細胞分離液上層；2)1000g離心22分鐘；水平轉(zhuǎn)子，緩升緩降；3)將單核細胞層(位于離心管中間層，為一層較薄的白膜狀)從Ficoll分離管中轉(zhuǎn)移到已加10mlAIM-V培養(yǎng)液的無菌15ml離心管，輕輕混勻，室溫600g離心7min；4)小心去除上清，加入1mlAIM-V，輕緩重懸細胞，加入AIM-V培養(yǎng)液至10ml,350g離心7min；5)小心棄上清，加入1mlAIM-V培養(yǎng)液重懸細胞；6)細胞計數(shù)及稀釋，取10μl細胞懸液加入40μl的1％trypanblue，制備1：5細胞稀釋液，進行活細胞計數(shù)，計算細胞稀釋需要的體積并加入相應(yīng)的AIM-V無血清培養(yǎng)液制備細胞稀釋液，試劑盒檢測要求加入每孔(24孔PVDF膜板)細胞數(shù)量2.5×105；7)將培養(yǎng)板從鋁封袋中取出，按順序加入：50μlAIMV至陰性對照孔；50μl抗原ESAT-6至抗原A孔；50μl抗原CFP10至抗原B孔；50μl陽性對照至陽性對照孔；在上述4孔中分別加入已制備細胞稀釋工作液100μl。50μl實施例2制備獲得的Sampleprotein(初始濃度為60ug/ml)加入到樣品孔中，隨后加入培養(yǎng)基和細胞，樣品孔中Sampleprotein的終濃度為初始濃度的1/3。8)將培養(yǎng)板放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育16-20hrs。9)用無菌PBS按1:200制備新鮮酶標抗體工作液。從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)板，棄去孔內(nèi)液體。以200μl/well無菌PBS洗滌4遍。10)加入50μl/well酶標抗體工作液，將培養(yǎng)板在2-8℃孵育1小時。用PBS洗滌4遍去除未結(jié)合酶標抗體。11)每孔加入室溫平衡過的底物工作液50μl，室溫反應(yīng)7分鐘。以蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，在37℃2-3hrs或室溫過夜干燥培養(yǎng)板。免疫原測試結(jié)果和分析：免疫原性測試在胸科醫(yī)院分子生物學(xué)實驗室進行，測試選用一定數(shù)量的已臨床確診的結(jié)核病患者，通過使用各種蛋白抗原檢測上述已確診患者的血樣，并由此結(jié)果分析Rv1098c蛋白抗原的免疫原性及應(yīng)用方向，具體的檢測結(jié)果統(tǒng)計見下表1所示，表1.Rv1098c抗原對住院已確診結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果*注：無反應(yīng)應(yīng)答患者不同于T-spot試劑盒檢測無應(yīng)答對象。有12例是T-spot試劑盒檢測沒有結(jié)果，但是Rv1098c可以篩選出。Rv1098c的結(jié)果優(yōu)于T-spot的檢測結(jié)果，Rv1908c和T-spot聯(lián)用時，檢測效果最佳。相比于與市售T-spot試劑盒的檢測結(jié)果，Rv1098c蛋白抗原的的高應(yīng)答率更高，無應(yīng)答反應(yīng)率更低， 因此，Rv1098c免疫原相比于市售的雙抗原檢測試劑盒能夠更有效的檢測結(jié)核分枝桿菌，若與其他陽性抗原聯(lián)用，能夠更有效的提高檢出率。實施例4.目標蛋白Rv1098c的免疫原性檢測1.豚鼠感染模型的建立取豚鼠，采用腹股溝皮下注射的方式注射結(jié)核分枝桿菌感染源，注射劑量為0.2ml，攻毒劑量4x106～4x107CFU。攻毒完成后處死豚鼠，檢測注射感染源的豚鼠的肺部器官感染情況，并取相關(guān)組織切片進行免疫組化分析。感染模型豚鼠的肺部照片見圖3，可見，攻毒后的豚鼠肺部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。感染模型豚鼠各個組織切片的免疫組化分析照片見圖4，臟器切片結(jié)果顯示，攻毒后的豚鼠肺部出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎(30-40％)，肺間質(zhì)淤血(40-50％)；脾臟局部紅髓內(nèi)可見上皮樣細胞結(jié)節(jié)，周邊少量淋巴細胞侵潤，中心可見干酪樣壞死灶；肝臟出現(xiàn)肝淤血(20-30％)，局部可見小肉芽形成(1-5％)。上述結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌攻毒后的豚鼠出現(xiàn)了明顯的感染癥狀，模型構(gòu)建成功2.免疫原性檢測取成功攻毒建模后的豚鼠兩只，分別于皮下注射不同濃度的實施例2制備獲得的抗原蛋白，于72小時后觀察抗原引起的免疫反應(yīng)炎癥斑塊大小，結(jié)果如下表所示，結(jié)果顯示，和陽性對照相似，Rv1098c抗原也能引起感染結(jié)核分枝桿菌的豚鼠的免疫反應(yīng)，說明該抗原具有用作結(jié)核分枝桿菌疫苗的能力。樣品72h橫徑X縱徑(mm)PBS(陰性對照)-BCG-PPD20ug/ml(陽性對照)13x18Rv1098c25ug/ml9x10最后需要說明的是，以上實施例僅供本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實質(zhì)，并不用作對本法保護范圍的限定。當前第1頁1 2 3