本發(fā)明涉及一種地衣芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，屬于微生態(tài)制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：益生菌在發(fā)酵過(guò)程往往使用市場(chǎng)上提供的培養(yǎng)基成品，該成品大多為普通培養(yǎng)基，或者符合某一類型的細(xì)菌，沒(méi)有辦法針對(duì)某一株菌提供最優(yōu)良的配方，導(dǎo)致活菌數(shù)較低，發(fā)酵成本高昂等問(wèn)題。豐貴鵬，楊麗云，2009，公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，最佳配比為：玉米漿0.45g，蛋白胨1.50g，豆餅粉浸汁為1:50，葡萄糖1.50g。劉陽(yáng)等，2012，公開(kāi)了對(duì)地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，具體公開(kāi)了素對(duì)活菌數(shù)影響的顯著性次序?yàn)?MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨，對(duì)芽孢數(shù)影響的顯著性次序?yàn)?MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉，培養(yǎng)基的最佳配比為:蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、NaCl1.0％、25％濃度的硫酸錳0.2％。宋浩等公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，配比為：玉米淀粉16.894g/L，黃豆餅粉10.131g/L，蛋白胨1.126g/L，葡萄糖2.413g/L，硫酸銨7.965g/L，磷酸氫二鉀0.45g/L，硫酸鎂0.45g/L，氯化鈉4.5g/L。謝銀堂等，2010，公開(kāi)了地衣芽孢桿菌XY-2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基質(zhì)量濃度配比為：玉米淀粉20g/L、豆餅粉90g/L、玉米漿7g/L。CN201310041566.4公開(kāi)了一種促進(jìn)地衣芽孢桿菌BL63516生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括牛肉粉或牛肉膏、蛋白胨、麥芽糊精、低聚半乳糖、NaCl和水，所述蛋白胨為牛蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚(yú)蛋白胨的一種或幾種。然而，不同菌所需的培養(yǎng)基配比不同，造成培養(yǎng)基的成本高低，然而，目前的培養(yǎng)基還沒(méi)有能兼顧發(fā)酵活菌數(shù)高，芽孢數(shù)高和低成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種地衣芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，能使地衣芽胞桿菌發(fā)酵所得活菌數(shù)和芽孢數(shù)含量高。本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基，其含有0.75％的酵母浸粉、1-1.5％的明膠、0.5％的CaCl2。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有0.75％的酵母浸粉、1％的明膠、0.5％的CaCl2，用于提高芽孢數(shù)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有0.75％的酵母浸粉、1.5％的明膠、0.5％的CaCl2，用于提高活菌數(shù)。其中，所述的地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌CGMCCNo.8147。本發(fā)明中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，其保藏號(hào)為CGMCCNo.8147，于2013年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，具有耐胃酸、耐腸液、耐膽鹽、耐高溫等抗逆性能和產(chǎn)酶等益生功能。本發(fā)明還提供一種地衣芽孢桿菌CGMCCNo.8147的發(fā)酵方法，將地衣芽孢桿菌CGMCCNo.8147的種子液按照1-2％的接種量接種到含有所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，溫度35-40℃，轉(zhuǎn)速60-150rpm，罐壓0.04-0.06Mpa，通風(fēng)比1：0.1-0.3，培養(yǎng)12-24h，得到活菌數(shù)為1×1010cfu/ml以上的發(fā)酵液。本發(fā)明提供一種地衣芽胞桿菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，用于發(fā)酵地衣芽孢桿菌菌液中活菌數(shù)能達(dá)到1×1010CFU/g以上。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)化1)碳源的確定：分別用0.5％的酵母浸粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉替代LB培養(yǎng)基中的酵母粉作為碳源，其余成分不變，配好培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，接種量2％，37℃培養(yǎng)20h，以平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，取平均值，綜合活菌數(shù)與芽孢數(shù)以確定最佳碳源。結(jié)果如表1所示，酵母浸粉作為碳源的培養(yǎng)基中活菌數(shù)及芽孢數(shù)都比其他碳源的結(jié)果高，故酵母浸粉為最佳碳源。表1不同碳源對(duì)地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)及芽孢數(shù)的影響處理活菌數(shù)(CFU/mL)芽孢數(shù)(CFU/mL)葡萄糖1.18×1091.67×107酵母浸粉1.94×1092.37×107淀粉6.33×1088.57×106蔗糖6.47×1085.3×106麥芽糖5.13×1087.9×1062)氮源的確定：分別用1％的黃豆餅粉、牛肉膏、明膠、硝酸鉀替代LB培養(yǎng)基中的蛋白胨作為氮源，其余成分不變，配好培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，處理方法同1)碳源的確定。結(jié)果如表2所示，明膠作為氮源的培養(yǎng)基中活菌數(shù)及芽孢數(shù)都比其余氮源結(jié)果高，故確定明膠為最佳氮源。表2不同氮源對(duì)地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)及芽孢數(shù)的影響處理活菌數(shù)(CFU/mL)芽孢數(shù)(CFU/mL)黃豆餅粉1.07×1081.62×105明膠3.77×1096.33×106牛肉膏3.51×1082.8×105硝酸鉀2.17×1083.30×1053)無(wú)機(jī)鹽的確定：分別用1％的NaCl、CaCl2、K2HPO4、MgSO4替代LB培養(yǎng)基中NaCl，其余成分不變，配好培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，處理方法同1)碳源的確定。結(jié)果如表3所示，CaCl2作為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中活菌數(shù)及芽孢數(shù)都優(yōu)于NaCl、K2HPO4、MgSO4，故確定CaCl2為最佳無(wú)機(jī)鹽。表3不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)地衣芽孢桿菌的活菌數(shù)及芽孢數(shù)的影響處理活菌數(shù)(CFU/mL)芽孢數(shù)(CFU/mL)K2HPO42.74×1095.43×107CaCl28.35×1094.73×108NaCl1.45×1096.62×107MgSO41.74×1091.23×1084)培養(yǎng)基成分含量的優(yōu)化：將篩選出的最佳碳源按照0.25％、0.5％、0.75％，最佳氮源0.5％、1.0％、1.5％，最佳無(wú)機(jī)鹽按照0.5％、1.0％、1.5％的添加量設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(L933)，按正交表配置培養(yǎng)基，滅菌，處理方法同1)碳源的確定。結(jié)果如表4所示，通過(guò)直觀分析可得出實(shí)際最佳組合為：A3B2C1；通過(guò)極差分析，酵母浸粉、明膠、CaCl2的極值R1分別為32.74、23.62、28.08，所以從活菌數(shù)來(lái)看，各營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)效果的影響大小順序?yàn)椋航湍附?gt;CaCl2>明膠；極值R2分別為30.28、18.98、50.94，所以從芽孢數(shù)來(lái)看，各營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)效果的影響大小順序?yàn)椋篊aCl2>酵母浸粉>明膠。以生物量為指標(biāo)對(duì)A3B2C1和A3B3C1進(jìn)行試驗(yàn)，最后確定最佳組合為A3B2C1，即最佳培養(yǎng)基為：0.75％酵母浸粉、1％明膠、0.5％CaCl2。表4正交設(shè)計(jì)方案及結(jié)果5)與LB培養(yǎng)基比較：按得到的最佳培養(yǎng)基配方配制液體培養(yǎng)基，分別接種2％的地衣芽孢桿菌菌液至最佳培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，處理方法同1)碳源的確定。結(jié)果如表5所示，優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基活菌數(shù)達(dá)到2.85×1010CFU/mL，芽孢數(shù)為5.43×109CFU/mL，比LB的活菌數(shù)8.35×108CFU/mL和芽孢數(shù)4.73×106CFU/mL都要高。表5最佳培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果比較培養(yǎng)基活菌數(shù)(CFU/mL)芽孢數(shù)(CFU/mL)最佳培養(yǎng)基2.85×10105.43×109LB培養(yǎng)基8.35×1084.73×1066)與現(xiàn)有的各種地衣芽孢桿菌培養(yǎng)基的比較：按得到的最佳培養(yǎng)基配方配制液體培養(yǎng)基，分別接種2％的地衣芽孢桿菌菌液至最佳培養(yǎng)基、培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B、培養(yǎng)基C及培養(yǎng)基D中，處理方法同1)碳源的確定。培養(yǎng)基A：玉米漿0.45g，蛋白胨1.50g，豆餅粉浸汁為1:50，葡萄糖1.50g；培養(yǎng)基B：蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、NaCl1.0％、25％濃度的硫酸錳0.2％；培養(yǎng)基C：玉米淀粉16.894g/L，黃豆餅粉10.131g/L，蛋白胨1.126g/L，葡萄糖2.413g/L，硫酸銨7.965g/L，磷酸氫二鉀0.45g/L，硫酸鎂0.45g/L，氯化鈉4.5g/L；培養(yǎng)基D：玉米淀粉20g/L、豆餅粉90g/L、玉米漿7g/L。結(jié)果如表6所示，優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基活菌數(shù)達(dá)到2.26×1010CFU/mL，芽孢數(shù)為5.27×109CFU/mL，比目前公開(kāi)的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后的活菌數(shù)和芽孢數(shù)都要高。表6最佳培養(yǎng)基與各優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果比較培養(yǎng)基活菌數(shù)(CFU/mL)芽孢數(shù)(CFU/mL)本發(fā)明培養(yǎng)基2.26×10105.27×109培養(yǎng)基A6.55×1093.73×107培養(yǎng)基B9.96×1088.85×106培養(yǎng)基C7.63×1093.68×107培養(yǎng)基D2.25×1084.95×106當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3