本發(fā)明是關(guān)于一種經(jīng)修飾的趨化素，可作為一種治療劑，尤其，本發(fā)明特別有關(guān)于一種用于治療癌癥與抑制腫瘤生長(zhǎng)的經(jīng)修飾趨化素。
背景技術(shù)：
：趨化素(Chemokine，又稱趨化因子)是一群可被誘導(dǎo)，可被分泌而且結(jié)構(gòu)類似的小分子(8-14kd)。趨化素可分為CXC、CC、CX3C及C四亞群；若以功能來(lái)分類，趨化素可分為恒定性趨化素(Homeostasischemokines)及發(fā)炎性趨化素(Inflammatorychemokines)。趨化素在其結(jié)構(gòu)上通常具有三個(gè)β-褶板(β-sheet)，且在C端具有一個(gè)α-螺旋(α-helix)，在N端上會(huì)有4個(gè)保留的胱氨酸(cysteine)。按照N端所含前兩個(gè)胱氨酸序列可分成四個(gè)族群：CXC、CC、C、CX3C，而以CC和CXC趨化激素為主。細(xì)胞上的趨化素與趨化素接受器結(jié)合之后才產(chǎn)生反應(yīng)，而趨化素接受器具有7個(gè)跨細(xì)胞膜的G蛋白結(jié)合接受器，依其結(jié)合標(biāo)的上的配體(ligand)種類不同而分別被命名為CXCR、CCR、CXR、CX3CR，若是再依 照數(shù)目順序排列，如CXCR1、CXCR2、CCR4等。但在標(biāo)的細(xì)胞上不只表現(xiàn)一種趨化素接受器，發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)合標(biāo)的與趨化素接受器也并非一對(duì)一，部份趨化素接受器在不同細(xì)胞需一定刺激誘導(dǎo)才會(huì)表現(xiàn)。例如，含有谷氨酸(E)-亮氨酸(L)-精氨酸(R)特征序列(ELR特征序列)的ELR-CXC趨化素，該ELR-CXC是指在蛋白質(zhì)N端具有氨基酸序列為ELR-CXC特征的蛋白，X可為極性且?guī)в须娦曰虿痪唠娦缘陌被?，或者X并不存在，其可調(diào)控致癌基因的生長(zhǎng)、IL-8、第二型嗜中性球活化勝肽(NAP-2)，其接受器為CXCR1、CXCR2，主要作用細(xì)胞為嗜中性球，可促進(jìn)嗜中性球的蓄積與活化作用，是以此類ELR-CXC趨化素與廣范圍的急性與慢性發(fā)炎病癥的發(fā)生，素有重大關(guān)聯(lián)并扮演著重大的角色，此等的發(fā)炎反應(yīng)包含牛皮癬與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。此外ELR-CXC趨化素還更與腫瘤發(fā)展時(shí)所伴隨的血管新生有關(guān)，其誘發(fā)機(jī)制是為經(jīng)由此類趨化素，尤指IL-8，與血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelialcell,EC)上的CXCR1以及CXCR2的結(jié)合所產(chǎn)生的活化作用。目前已證實(shí)有許多不同類型的腫瘤會(huì)產(chǎn)生ELR-CXC趨化素，且會(huì)表現(xiàn)此類型趨化素的腫瘤已被認(rèn)為與腫瘤的不良預(yù)后發(fā)展有關(guān)。藉由拮抗CXCR1或CXCR2與ELR-CXC趨化素的結(jié)合，為一可行的策略，以便抑制由CXCR1或/及CXCR2受體 激活后所引發(fā)的異常訊號(hào)傳遞，進(jìn)而治療帶有該兩種受體的細(xì)胞活化所造成的相關(guān)疾病，因此科學(xué)家正致力于尋找及制備抑制CXC趨化素的受質(zhì)蛋白相似物。本案發(fā)明人鑒于習(xí)知技術(shù)中的不足，經(jīng)過(guò)悉心試驗(yàn)與研究，并一本鍥而不舍的精神，終構(gòu)思出本案發(fā)明，能夠克服先前技術(shù)的不足，以下為本案之簡(jiǎn)要說(shuō)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：癌癥為已開(kāi)發(fā)國(guó)家的重要死因之一。盡管目前對(duì)于癌癥的診斷及治療方面已有進(jìn)展，若能早期發(fā)現(xiàn)癌癥則手術(shù)及放射性治療可能治愈癌癥，但大部分的藥物不是有很大的副作用，就是效果不佳。因此，醫(yī)學(xué)界亟需一種方法及組成物來(lái)治療或防止癌癥。有鑒于此，本發(fā)明開(kāi)發(fā)一種經(jīng)修飾趨化素勝肽(peptide，肽)，以抑制腫瘤生長(zhǎng)與治療癌癥。本發(fā)明提供一種經(jīng)修飾趨化素勝肽，其包含一氨基酸序列，此氨基酸具有一N端(N’)，此氨基酸序列帶有：(a)N’-谷氨酸(E)-亮氨酸(L)-精氨酸(R)的特征序列，此特征序列位于所述趨化素勝肽N端；(b)N’-脯氨酸(P)-丙氨酸(A)-絲氨酸(S)-谷氨酰胺(Q)-苯基丙氨酸(F)-Cys3的特征序列，此特征序列位于趨化素勝肽N端算起第3個(gè)胱氨酸(Cys3)；其中所述趨化素勝肽是包含該(a)、 (b)特征序列并具有一修飾位置，且此修飾位置位于所述趨化素勝肽上由N端算起第17,12,13個(gè)氨基酸。在一實(shí)施例中，其中此趨化素勝肽上第17個(gè)氨基酸由苯基丙氨酸(F)置換為亮氨酸(L)。在一實(shí)施例中，其中此經(jīng)修飾趨化素勝肽的未經(jīng)修飾的前身系來(lái)自于來(lái)源趨化素勝肽，所述來(lái)源趨化素勝肽N端的第1個(gè)胱氨酸及第2個(gè)胱氨酸之間可存在0-2個(gè)氨基酸，且當(dāng)氨基酸為1-2個(gè)時(shí)，此氨基酸為具有電性或不具電性的極性氨基酸。在一實(shí)施例中，其中所述來(lái)源趨化素勝肽選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9及其組合所組成的群組其中之一。在一實(shí)施例中，本發(fā)明經(jīng)修飾趨化素勝肽選自由SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12及其組合所組成的群組其中之一。本發(fā)明另提供一種醫(yī)藥組合物，包含本發(fā)明的經(jīng)修飾趨化素勝肽及醫(yī)藥可接受性賦形劑。在一實(shí)施例中，其中經(jīng)修飾趨化素勝肽的用途是用于治療癌癥或抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明另提供一種治療癌癥及抑制腫瘤的醫(yī)藥組合物，包括本發(fā)明的經(jīng)修飾趨化素勝肽及醫(yī)藥可接受性賦形劑。在一實(shí)施例中，其中癌癥包括前列腺癌、乳癌、子宮癌、血癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膽癌、甲狀腺癌、肝癌、腎臟癌以及鼻咽癌等。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的來(lái)源趨化素勝肽序列(SEQIDNO:1-SEQIDNO:9)，亦是對(duì)CXCR1或/及CXCR2具有高親和力的ELR-CXC趨化素的氨基酸序列比對(duì)圖。圖2為本發(fā)明的經(jīng)修飾趨化素勝肽的氨基酸序列比對(duì)圖(SEQIDNO:10-12)。圖3顯示具有趨化素CXCL8的細(xì)胞遷移數(shù)量。圖4分別顯示黑色部分為具有化學(xué)激素刺激，灰色部分為具有化學(xué)激素刺激及CXCL8-IP10，白色部分為具有化學(xué)激素刺激及IL8-17LIP10之細(xì)胞遷移數(shù)量。圖5顯示實(shí)驗(yàn)組(IL8-17LIP10)與對(duì)照組(食鹽水)的腫瘤體積。圖6顯示實(shí)驗(yàn)組(IL8-17LIP10)與對(duì)照組(食鹽水)的腫瘤重量圖7顯示實(shí)驗(yàn)組(IL8-17LIP10)與對(duì)照組(食鹽水)的微血管密度。圖8為注射CXCL8-IP10、生理食鹽水后腫瘤體積大小觀察圖，其中：A組：每個(gè)禮拜注射4次的CXCL8-IP10500ug/kg，B組：每個(gè)禮拜注射2次之CXCL8-IP10500ug/kg，C組：每個(gè)禮拜注射2次之CXCL8-IP10250ug/kg，D組：每天皮下注射100μl的食鹽水并觀察腫瘤體積大小。圖9為犧牲后的小鼠肺臟腫瘤組織，其中，A為每個(gè)禮拜注射4次CXCL8-IP10500ug/kg的老鼠在第24天犧牲后,取出的肺臟；B為注射生理食鹽水的老鼠肺臟，其中箭頭所指的白色腫瘤部位為轉(zhuǎn)移到肺部所產(chǎn)生病灶。圖10顯示腫瘤細(xì)胞中表達(dá)CXCR1或CXCL8的趨勢(shì)。圖11顯示本發(fā)明拮抗劑對(duì)趨化反應(yīng)的影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種新穎的趨化素勝肽。本發(fā)明的新穎趨化素勝肽源自屬于ELR-CXC趨化素或是對(duì)CXCR1或CXCR2具有高親和力的受質(zhì)，例如，CXCL1(SEQIDNO:3)、CXCL2(SEQIDNO:4)、CXCL3(SEQIDNO:5)、CXCL5(SEQIDNO:6)、CXCL6(SEQIDNO:7)、CXCL7(SEQIDNO:8)、CXCL8(SEQIDNO:2)、hG31P(SEQIDNO:1)。本發(fā)明系根據(jù)此一類型的趨化素進(jìn)行修飾，主要在其30s-loop處插入一段PASQF特征序列(如圖1)，此 一PASQF原本是存在于趨化素CXCL10中，且該CXCL10為一種非ELR-CXC趨化素。本發(fā)明的經(jīng)修飾趨化素，包括：(a)N’-谷氨酸(E)-亮氨酸(L)-精氨酸(R)的特征序列，此特征序列位于該趨化素勝肽N端；以及(b)N’-脯氨酸(P)-丙氨酸(A)-絲氨酸(S)-谷氨酰胺(Q)-苯基丙氨酸(F)-Cys3的特征序列，此特征序列是位于趨化素勝肽N端算起第3個(gè)胱氨酸(Cys3)。此外，應(yīng)注意的是，本發(fā)明的趨化素勝肽更具有一突變位置(即修飾位置)，其是位于由趨化素勝肽N端算起第17個(gè)氨基酸。在一實(shí)施例中，本發(fā)明趨化素勝肽的第17位氨基酸原本為苯基丙氨酸(F)，并經(jīng)突變置換后變?yōu)槠渌潜交彼岬陌被?。在另一?shí)施例中，本發(fā)明趨化素勝肽的第17位氨基酸可為丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、硒半胱氨酸(U)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、吡咯賴氨酸(O)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)，較佳為亮氨酸(L)。與未置換的趨化素多勝肽相比較，第17位氨基酸在置換后的趨化素多勝肽具有較高親和性并能夠有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在本發(fā)明一特定實(shí)施例中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的趨化素勝肽包括，但不限于，SEQIDNO:10、SEQIDNO:11及/或SEQIDNO:12(如圖2)。以SEQIDNO:10為例，SEQIDNO:10除具有ELR-CQC的N端序列而符合ELR-CXnC的氨基酸特征序列之規(guī)則外，SEQIDNO：10還具有一由N端起算的Pro-Ala-Ser-Gln-Phe(脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸，PASQF)的寡肽序列，此PASQF為一修飾序列，且被插入于N端起算的第3個(gè)半胱氨酸(Cysteine,C)的上游(10192)，并且此第3個(gè)半胱氨酸緊接在PASQF寡肽序列的苯丙氨酸(F)之后。更重要的是，第17位的氨基酸不為苯丙氨酸，而為亮氨酸。由本發(fā)明所提供的序列表(如圖2)可知，SEQIDNO:10至SEQIDNO:12的ELR-CXC趨化素類似物序列均具有由N端起算第3個(gè)半胱氨酸之前的PASQF修飾序列。另外，本發(fā)明趨化素勝肽的第17位氨基酸經(jīng)突變?yōu)榱涟彼帷１景l(fā)明的經(jīng)修飾趨化素勝肽、其類似物及/片斷可抑制血管新生相關(guān)的疾病。血管新生相關(guān)的疾病包括，但不限于，發(fā)炎性疾病、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及牛皮癬、不正常血管侵犯有關(guān)的疾病、以及細(xì)胞增生性疾病，如與腫瘤或癌癥有關(guān)的疾病(例如，前列腺癌、乳癌、子宮癌、血癌、卵巢 癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膽癌、甲狀腺癌、肝癌、腎臟癌以及鼻咽癌等)。本發(fā)明的趨化素修飾勝肽及/或包含此趨化素修飾勝肽的藥學(xué)組成物可以口服，非腸胃、吸入、直腸、陰道、皮內(nèi)、經(jīng)皮或局部給予，一藥劑單位可包括傳統(tǒng)無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑及載具。本發(fā)明的趨化素修飾勝肽及/或包含此趨化素修飾勝肽的藥學(xué)組成物可一次給予，24小時(shí)內(nèi)多次給予或連續(xù)給予。當(dāng)注射的方式為連續(xù)給予時(shí)，可選用適合的習(xí)知方式，包括，但不限于，靜脈注射點(diǎn)滴、靜脈注射幫浦、埋植式注射泵或局部給予。治療的時(shí)間可依不同的情況做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如，血管新生作用的病程及嚴(yán)重性。在以本發(fā)明經(jīng)修飾的趨化素勝肽單獨(dú)或合并本發(fā)明其他藥劑直到治愈，或持續(xù)治療終身。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種治療癌癥及抑制腫瘤的醫(yī)藥組合物。此藥學(xué)組成物包括一有效量的本發(fā)明趨化素修飾勝肽或其類似物，以及一藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散劑、涂層、抗菌劑/抗真菌劑、等滲壓、吸收延遲劑及其類似物?！緦?shí)施例】1.細(xì)胞趨化利用Boydenchamberassay評(píng)估LMVECs的遷移狀況，將LMVECs培養(yǎng)于含有2％FCS的HuMedia-EB28小時(shí)，之后將12X104cells/cm2的細(xì)胞推平于孔徑大小5μm且涂布10μg/mlfibronectin的polycarbonate濾膜(Sigma-Aldrich)。分別將10ng/mLofCXCL8,CXCL6,CXCL1,CXCL5,及CXCL8-IP10或IL8-F17LIP10置入Boydenchamber的底部。LMVECs于Boydenchamber于37℃培養(yǎng)4小時(shí)，之后使用Diff-Quick(Harleco)將濾膜固定與染色，而遷移的細(xì)胞利用(HPFs)(X200)計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)量。圖3顯示具有趨化素CXCL8的遷移數(shù)量最多。圖4中黑色部分僅具有化學(xué)激素刺激，灰色部分為具有化學(xué)激素刺激及CXCL8-IP10，白色部分為具有化學(xué)激素刺激及IL8-17LIP10。由圖4可知CXCL8-IP10及IL8-17LIP10同樣具有抑制細(xì)胞遷移的效用，而IL8-17LIP10抑制細(xì)胞遷移的效用相對(duì)于CXCL8-IP10較好。2.裸鼠異種移植分析將無(wú)胸腺雄鼠(4-6周BALB/c)置于無(wú)菌操作房中。無(wú)菌操作房中具有充分的飲水與飼料，并每天監(jiān)測(cè)小鼠。將GFP-標(biāo)記PC-3細(xì)胞(PC-3-GFP)注射至3只裸鼠的右腹 部，每只裸鼠注射5x106的細(xì)胞。培養(yǎng)2-4周后，采取腫瘤以供移植。取出此3只裸鼠的腫瘤組織進(jìn)行切片(1mm3的切片)，并于麻醉及消毒的狀態(tài)下移植至其它小鼠的前列腺中。移植后第5天，將動(dòng)物分為2組(每組12只)，每天皮下注射100μl的食鹽水(對(duì)照組)或本發(fā)明的序列(IL8-17LIP10(SEQIDNO:13)，0.5mg/kg)(實(shí)驗(yàn)組)，持續(xù)24天。在第12、18、與24天，利用光學(xué)解剖顯微鏡與數(shù)字相機(jī)以515mm的濾光片攝影腫瘤生長(zhǎng)影像。腫瘤體積的計(jì)算方式如下：腫瘤體積＝(長(zhǎng)度x寬2)/2。在第24天時(shí)，將所有小鼠犧牲，并取得腫瘤GFP熒光影像。微血管密度的計(jì)算方式如下：密度＝微血管長(zhǎng)度/腫瘤體積。腫瘤樣本以4％甲醛固定后，包埋于石蠟中，以供后續(xù)的免疫組織化學(xué)分析。圖5顯示第12、18與24天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腫瘤體積。由圖5可知，本發(fā)明的序列(IL8-17LIP10)可顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，可抑制腫瘤體積達(dá)5倍以上，且隨著時(shí)間增加，抑制效果更明顯。圖6顯示第24天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腫瘤重量。由圖6可知，本發(fā)明的序列(IL8-17LIP10)可顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)，可抑制腫瘤重量達(dá)2倍以上。3.免疫組織化學(xué)分析將包埋于石蠟中的腫瘤切片脫蠟并以PBS再水化。詳細(xì) 地說(shuō)，將切片經(jīng)PBS潤(rùn)濕3次，并于10mM檸檬酸鈉(pH6.0)熱處理15分鐘。之后，以3％的過(guò)氧化氫處理10分鐘以去除內(nèi)源性的過(guò)氧化酶活性，再以PBS清洗3次，于室溫下以蛋白質(zhì)封阻溶液(含5％馬血清的PBS溶液)處理15分鐘后，以PBS清洗3次，再以小鼠抗-VEGF單株抗體(1：50)，兔子抗-NF-κB多株抗體或山羊抗-CD3多株抗體(1：50)于4℃下反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)完成后，以PBS清洗3次，并以適當(dāng)?shù)亩?jí)抗體于37℃下反應(yīng)40分鐘。再以PBS清洗3次后，將切片以生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠或抗兔子的抗山羊IgG多株抗體于暗室反應(yīng)30分鐘。在呈色反應(yīng)中，以PBS清洗3次，二氨基聯(lián)苯胺溶液染色10分鐘，再以蘇木精染色1分鐘(Kollmaretal,2007)。陰性對(duì)照組以PBS取代初級(jí)抗體。將影像轉(zhuǎn)為灰階(0-225)，以積分光密度(IOD)表示，并利用Image-Pro6.0Microsoft軟件測(cè)得密度。每組分析5只小鼠的移植腫瘤。每個(gè)腫瘤隨機(jī)選擇5個(gè)切片影像，以平均出每個(gè)腫瘤的灰階值(Csilliketal,2005)。可使用CD31的免疫組織化學(xué)分析來(lái)鑒定微血管的密度，利用Image-Pro6.0Microsoft軟件計(jì)數(shù)，并以平均值表示。圖7顯示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的微血管密度。由圖7可知，本發(fā)明的序列(IL8-17LIP10)可有效地抑制小鼠體內(nèi)前列腺癌的微血管新生。4.C57BL/6小鼠分析C57BL/6小鼠置于無(wú)菌操作房中。無(wú)菌操作房中具有充分的飲水與飼料，并每天監(jiān)測(cè)小鼠。將LLW2細(xì)胞(Lewislungcarcinma)注射至3只裸鼠的右腹部，每只裸鼠注射5x106的細(xì)胞。培養(yǎng)2-4周后，采取腫瘤以供移植?？偣灿?4只小鼠接受腫瘤的移植。移植后第5天，將動(dòng)物分為4組(每組6只)，A組每個(gè)禮拜注射4次IL8-IP10500ug/kg，B組每個(gè)禮拜注射2次IL8-IP10500ug/kg，C組每個(gè)禮拜注射2次IL8-IP10250ug/kg，D組每天皮下注射100μl的食鹽水。腫瘤體積的計(jì)算方式如下：腫瘤體積＝(長(zhǎng)度x寬2)/2。長(zhǎng)度及寬度利用Image-Pro6.0Microsoft測(cè)量。在第24天時(shí)，將所有小鼠犧牲(處死)，并取得腫瘤GFP熒光影像。微血管密度的計(jì)算方式如下：密度＝微血管長(zhǎng)度/腫瘤體積。腫瘤樣本以4％甲醛固定后，包埋于石蠟中，以供后續(xù)的免疫組織化學(xué)分析。圖8顯示A組抑制腫瘤體積的效果最佳。第24天時(shí)，將所有小鼠犧牲前,所量測(cè)的腫瘤大小,發(fā)現(xiàn)A組每個(gè)禮拜注射4次CXCL8-IP10500ug/kg的老鼠腫瘤體積比D組對(duì)照組間的腫瘤小了30％.結(jié)果顯示CXCL8-IP10對(duì)控制腫瘤發(fā)展有顯著的效果。圖9為犧牲后的小鼠肺臟腫瘤組織，而由A圖可得知腫 瘤的遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移已被CXCL8-IP10明顯抑制。圖9中的A為每個(gè)禮拜注射4次CXCL8-IP10500ug/kg的老鼠在第24天犧牲后,取出的肺臟；圖B為施打生理食鹽水的老鼠肺臟，其中箭頭所指的白色腫瘤部位為轉(zhuǎn)移到肺部所產(chǎn)生病灶。經(jīng)過(guò)CXCL8-IP10投藥的老鼠肺部則非常干凈，并沒(méi)有肺部轉(zhuǎn)移病灶的出現(xiàn)。5.嗜中性白血球趨化性分析嗜中性白血球趨化性是藉由改良后的Boydenchambermicrochemotaxisassays來(lái)評(píng)估。白血球是由人類外圍血液經(jīng)由一般濃度梯度分離而取得，而嗜中性白血球是由濃度低梯分離的底部取得并利用hypotoniclysis清除污染的紅血球細(xì)胞。將純化后的5x106/ml之嗜中性白血球懸浮于HBSS(400mg/L氯化鉀(KCl)，60mg/L磷酸氫鉀(KH2PO4)，8000mg/L氯化鈉(NaCl)，350mg/L碳酸氫鈉(NaHCO3)，90mg/L磷酸氫鈉(NaH2PO4·7H2O)，1000mg/L葡萄糖(glucose)，以及0.5％pH7.4牛胎盤血清(fetalcalfserum；pH7.4)，之后嗜中性白血球以CalceinAM(Invitrogen,Stockholm,Sweden)培養(yǎng)30分鐘，培養(yǎng)溫度為37℃。趨化因子(例如：CXCL820ng/mL)單獨(dú)或與其他結(jié)抗劑結(jié)合(IL8-IP10F17L,etc.)放置于Boydenchamber的培養(yǎng)區(qū)底部而純化后的嗜中性白血球置于培養(yǎng)槽上端，而培養(yǎng)槽的上端與底部是由孔徑5μm的聚碳酸 酯濾膜(pore-sizepolycarbonatefilters)所隔開(kāi)。于37℃及5％二氧化碳(CO2)中培養(yǎng)30分鐘之后移除未移動(dòng)的細(xì)胞及濾膜，并將移動(dòng)的細(xì)胞打破并以VICTOR3(Perkin-Elmer,UK，excitation:485nm；emission:530nm)分析，移動(dòng)的細(xì)胞百分比以趨化指數(shù)(ChemotaxisIndex(CI)value)表示:CI＝(intensityantagonist-intensityHBSS)/(intensityCXCL8-intensityHBSS)X100％其中，intensityantagonist是指同時(shí)加入本發(fā)明所敘的具有拮抗作用的蛋白和CXCL8所產(chǎn)生細(xì)胞移動(dòng)；intensityCXCL8是指細(xì)胞僅經(jīng)由CXCL8刺激而移動(dòng)，而intensityHBSS是指細(xì)胞的移動(dòng)是由重力所造成。6.RT-PCR分析各腫瘤細(xì)胞中CXCR1/2及CXCL8的基因表現(xiàn)量。本實(shí)驗(yàn)的各癌癥細(xì)胞株的RNA均藉由TRIzolreagent(Invitrogen,America)及其操作說(shuō)明萃取而得，其中大部分的RNA的定量是使用ND-1000spectrophotometer。于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過(guò)程，樣本是使用cDNAreverse-transcriptionkit(PrimeScriptTMRTreagentkit,Takara,Japan)進(jìn)行培養(yǎng)，并于基因表現(xiàn)分析前置于冰上。GAPDH為內(nèi)部控制組。RT-PCR的反應(yīng)是藉由SYBR (PremixExTaqTM,Takara,Japan)所完成，其CXCL引物為以下所述：5′-gagcactccataaggcacaaa-3′(forward)and5′-atggttccttccggtggt-3′(reverse)forCXCL8；5′-gaccaacatcgcagacacat-3′(forward)and5′-tgcttgtctcgttccacttg-3′(reverse)forCXCR1；5′-ggctaagcaaaatgtgatatgtacc-3′(forward)and5′-caaggttcgtccgtgttgta-3′(reverse)forCXCR2?；虮憩F(xiàn)的計(jì)算方法如算式所表現(xiàn)geneexpression＝2-ΔΔCt表一、腫瘤細(xì)胞株HCC827lungadenocarcinomaHCC827GRHCC827gefitinib-resistantH1975lungadenocarcinomaH2170lungsquamouscellcarcinomaH157oralsquamouscellcarcinomaCT26coloncarcinomacellCL1-0lungadenocarcinomaCL1-5lungadenocarcinomaPC9lungadenocarcinomaH3255NonsmallcelllungcarcinomaA549lungadenocarcinomaH520lungsquamouscellcarcinomaH460Nonsmallcelllungcarcinoma圖10顯示利用RT-PCR偵測(cè)到部分腫瘤細(xì)胞對(duì)于趨化素受體CXCR1具有高度的表達(dá)，此外許多的腫瘤細(xì)胞會(huì)表達(dá)高量的CXCR1/2等兩類受體的受質(zhì)CXCL8,因此可以利用CXCR1/2受體拮抗劑來(lái)達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。圖11顯示更多的結(jié)抗劑設(shè)計(jì),在先前揭露的CXCL8–IP10中增加了第12號(hào)或/和第13號(hào)或/和第17號(hào)氨基酸的變異,可以增強(qiáng)對(duì)于其受體CXCR1/2所引發(fā)生理反應(yīng)的結(jié)抗作用,有效達(dá)到降低因?yàn)槟[瘤細(xì)胞所表達(dá)CXCR1/2受體,或是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞高量表達(dá)其受體對(duì)應(yīng)受質(zhì)細(xì)胞激素(CXCL1,2,3,5,6,7,8等)所伴隨引發(fā)腫瘤增生,抗藥性,轉(zhuǎn)移和血管新生的抑制作用.由此可知，由于本發(fā)明趨化素勝肽可有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)、血管新生，以及治療癌癥。所有說(shuō)明書中所揭示的發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)可以任意方式組合。說(shuō)明書中揭示的每一技術(shù)特點(diǎn)可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替換。因此，除非另有特別說(shuō)明，文中所有揭示的特點(diǎn)均只是等同或相似特點(diǎn)的一般系列的實(shí)例。由上述可知，熟習(xí)此技藝者能輕易地了解本發(fā)明的必要特征，在不脫離其精神與范圍之下能就本發(fā)明做許多改變與調(diào)整以應(yīng)用于不同用途與條件。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3