本發(fā)明屬于生物技術應用研究領域，尤其涉及一種不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法。

背景技術：

梭狀神經(jīng)毒素(Clostridial Neurotoxins，CNTs)是導致人類中毒的最強蛋白質(zhì)類毒素之一，其中肉毒神經(jīng)毒素(Botulinum Neurotoxins，BoNTs)導致肌肉松弛性麻痹，破傷風神經(jīng)毒素(Tetanus Neurotoxin，TeNT)導致痙攣性麻痹。CNTs全長為150kDa,整體而言，可劃分為N端的活性區(qū)域，即輕鏈(light chain,LC)，約為50kDa，C端的受體識別和結(jié)合區(qū)域，即重鏈(heavy chain,HC)，約為100kDa，而重鏈還可進一步劃分為輕鏈輸送區(qū)域(HCT)和受體結(jié)合區(qū)域(HCR)兩個亞區(qū)域。對BoNTs而言，目前已有七種不同血清型(依次命名為BoNT-A至BoNT-G型)獲得分離鑒定，它們能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蛏窠?jīng)細胞，并特異性地水解位于神經(jīng)突觸細胞膜上或囊泡膜上的底物，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)(比如乙酰膽堿)的釋放，導致疾病。

七種亞型肉毒神經(jīng)毒素血清型中，BoNT-A、BoNT-B、BoNT-E和BoNT-F型能引起人肉毒中毒癥狀，其中BoNT-A型的毒性最強，致死劑量可以低至微克級。美國CDC(Center for Disease Control and Prevention)把BoNTs定義為A類試劑和潛在的生物恐怖武器。而基于BoNTs中毒還具有可逆性、局部性和持久性等特點，BoNTs及其衍生物也被視為可用來治療神經(jīng)肌肉類癥狀的新型藥物。盡管BoNTs應用廣泛，但基于BoNTs的治療藥物的有效期往往比較有限，需要重復多次注射，所以不可避免地有病人產(chǎn)生免疫抵抗，從而降低甚至完全抵消治療效果。

目前，普遍認為導致病人產(chǎn)生中和抗體的因素主要有兩個，即治療藥物中的神經(jīng)毒素(有效成分)和非神經(jīng)毒素成分(比如與神經(jīng)毒素相結(jié)合的血凝素等其他蛋白質(zhì))，此外，免疫抵抗現(xiàn)象的出現(xiàn)還涉及到病人體質(zhì)，藥物成分和用藥時間等多種因素。近年來已經(jīng)有很多研究涉及到如何解釋或解決免疫抵抗問題，并且已經(jīng)有若干相關專利獲得批準，然而其應用空間仍然受到限制。綜合目前相關的研究成果，提高BoNTs類治療藥物的生物活性，從而降低BoNTs類治療藥物的使用劑量，似乎可以成為未來的一個行之有效的解決免疫抵抗問題的可行方案。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可能降低甚至消除免疫抵抗水平的不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，旨在解決現(xiàn)有BoNTs類治療藥物容易產(chǎn)生免疫抵抗現(xiàn)象的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，包括下述步驟：

純化獲得各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白；

檢測所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白對特異性重組型底物的水解活性，并獲取特異性重組型底物水解活性數(shù)據(jù)；

將所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白以不同形式組合、或?qū)⑺龈鱽喰腿舛旧窠?jīng)毒素輕鏈蛋白酶與LC/TeNT的重組蛋白以不同形式組合，得到組合重組蛋白，分別檢測所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白、以及所述組合重組蛋白對特異性內(nèi)源性天然底物的水解活性，獲取特異性內(nèi)源性天然底物水解活性數(shù)據(jù)；

將所述特異性重組型底物水解活性數(shù)據(jù)和特異性內(nèi)源性天然底物水解活性數(shù)據(jù)進行整理、比較分析，篩選所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白的活性組合。

本發(fā)明提供的不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，通過將組合前后的所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶進行特異性內(nèi)源性天然底物的水解活性篩選，從而獲得水解效率得到提高的肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的活性組合篩選方案，為BoNTs類治療藥物容易產(chǎn)生免疫抵抗問題提供一個可能的解決途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例3和4提供的單種或肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的組合各自輕鏈蛋白酶對內(nèi)源性天然底物的水解活性結(jié)果圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例提供了一種不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，包括下述步驟：

S01.純化獲得各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白；

S02.檢測所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白對特異性重組型底物的水解活性，并獲取特異性重組型底物水解活性數(shù)據(jù)；

S03.將所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白以不同形式組合、或?qū)⑺龈鱽喰腿舛旧窠?jīng)毒素輕鏈蛋白酶與LC/TeNT的重組蛋白以不同形式組合，得到組合重組蛋白，分別檢測所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及LC/TeNT的重組蛋白、以及所述組合重組蛋白對特異性內(nèi)源性天然底物的水解活性，獲取特異性內(nèi)源性天然底物水解活性數(shù)據(jù)；

S04.將所述特異性重組型底物水解活性數(shù)據(jù)和特異性內(nèi)源性天然底物水解活性數(shù)據(jù)進行整理、比較分析，篩選所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的 重組蛋白的活性組合。

具體的，上述步驟S01中，肉毒神經(jīng)毒素中的輕鏈,即N端的活性區(qū)域。為了獲得高活性的肉毒神經(jīng)毒素，需要提供所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶，并純化出所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白。采用所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶，可提高所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶及其組合后對內(nèi)源性天然底物的水解活性，而在作為治療藥物使用時提高有效濃度，同等條件下可以降低單個肉毒神經(jīng)毒素的使用劑量，從而解決免疫抵抗問題。

常規(guī)分離純化肉毒神經(jīng)毒素的過程中，為了防止毒素泄露或擴散而影響周邊環(huán)境，需要嚴格控制操作空間。為了避免上述現(xiàn)象的發(fā)生，作為本發(fā)明優(yōu)選實施例，所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶重組蛋白的純化，以原核表達系統(tǒng)表達純化實現(xiàn)。以原核表達系統(tǒng)表達純化獲得的各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶重組蛋白，不僅可以防止泄露造成的毒素污染，還能以便捷的方式獲得高純度的所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶重組蛋白。

研究證明，自然與神經(jīng)毒素一起構(gòu)成肉毒神經(jīng)毒素復合物的蛋白質(zhì)能對肉毒神經(jīng)毒素起到保護作用，該保護作用可持續(xù)到肉毒神經(jīng)毒素侵入到人體或動物體內(nèi)后的一段很長的遷移過程。一旦失去了自然與神經(jīng)毒素一起構(gòu)成肉毒神經(jīng)毒素復合物的復合蛋白質(zhì)的保護作用，在到達作用位點時肉毒神經(jīng)毒素的質(zhì)和量都會有所損失。本發(fā)明實施例中，作為優(yōu)選實施例，為了提高亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶活性組合的篩選范圍，所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶既可以是純的重組型毒素蛋白，也可以是任何其他包含有功能性肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的復合物或混合物。

本發(fā)明實施例中，所述肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶可包括所述肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的各種亞型。作為優(yōu)選實施例，所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶、以及參與組合成所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白中至少包括但不限于LC/BoNT-A、LC/BoNT-B、LC/BoNT-D、LC/BoNT-E、LC/BoNT-F。其中，BoNT為肉毒神經(jīng)毒素，A、B、D、E、F分別肉毒神經(jīng)毒素的幾種亞型， TeNT為破傷風神經(jīng)毒素，LC表示輕鏈。所述LC/TeNT用于與上述各種亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶作為組合使用。

優(yōu)選的，所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶在氨基酸水平上的長度分別如下，其中，aa是氨基酸的簡寫：

所述LC/BoNT-A(后述以LC/A表示)：aa1-aa425；

所述LC/BoNT-B(后述以LC/B表示)：aa1-aa430；

所述LC/BoNT-D(后述以LC/D表示)：aa1-aa430；

所述LC/BoNT-E(后述以LC/E表示)：aa1-aa408；

所述LC/BoNT-F(后述以LC/F表示)：aa1-aa446；

所述LC/TeNT：aa1-aa436。

作為另一個優(yōu)選實施例，所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶也可以是肉毒神經(jīng)毒素全毒素水平上的輕鏈蛋白酶。

上述步驟S02中，分析所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶對其特異性重組型底物的水解活性，可以獲得各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的對其特異性重組型底物進行水解的活性數(shù)據(jù)，從而在后述評價所述各組合重組蛋白的水解活性時，作為可靠的參比數(shù)據(jù)。

由于所述肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶有嚴格的底物特異性要求，所以本發(fā)明實施例中選擇的所述重組型底物均以所述肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的天然底物為模型進行重組和構(gòu)建的，作為具體實施例，所述重組型底物為VAMP-2(aa1-aa97)和SNAP25(aa141-aa206)。

上述步驟S03中，將所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白以不同形式組合、或?qū)⑺龈鱽喰腿舛旧窠?jīng)毒素輕鏈蛋白酶與LC/TeNT的重組蛋白以不同形式組合，包括將所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白以兩種亞型、三種亞型甚至更多種亞型進行組合，或?qū)⑺龈鱽喰腿舛旧窠?jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白以兩種亞型、三種亞型甚至更多種亞型進行組合后于TeNT組合形成組合重組蛋白。

所述特異性內(nèi)源性天然底物為來自神經(jīng)元組織、神經(jīng)元細胞，以及其他一切非人工改造過的內(nèi)源性底物。進一步地，所述特異性內(nèi)源性天然底物優(yōu)選為Neuro-2A細胞裂解物，所述Neuro-2A細胞裂解物中含有所述肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的特異性內(nèi)源性天然底物。

上述步驟S04中，將所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶重組蛋白及其各組合重組蛋白與特異性性內(nèi)源性天然底物進行水解獲得的活性數(shù)據(jù)進行整理、與上述S02步驟中獲得的所述特異性重組型底物水解活性數(shù)據(jù)進行對比分析，篩選所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的重組蛋白的活性組合，所述組合能夠提高各自輕鏈蛋白酶對內(nèi)源性天然底物的水解活性。作為本發(fā)明實施例，所述活性組合為所述LC/A和所述LC/B的組合。作為本發(fā)明另一個實施例，所述活性組合為所述LC/A和所述LC/F的組合。當然，應當理解，能提高所述內(nèi)源性天然底物水解活性的不同亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的組合方式可以是、但并不局限于本發(fā)明實施例所述的較佳實施例，也可以是其他任何能夠達到預期目的的組合方式。

本發(fā)明實施例提供的一種不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，是基于目前出現(xiàn)的接受BoNTs類藥物進行治療的病人產(chǎn)生免疫抵抗現(xiàn)象而提出的，使用所述各亞型肉毒神經(jīng)毒素中的輕鏈蛋白酶對內(nèi)源性天然底物的水解活性作為研究基礎，獲得能夠提升各自輕鏈蛋白酶水解活性的不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合，從而降低單個肉毒神經(jīng)毒素的使用劑量，達到解決免疫抵抗問題的效果。同時，采用純的所述重組型毒素蛋白、或任何其他包含有功能性該肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的復合物或混合物，進而提高了肉毒神經(jīng)毒素作為藥物篩選的使用范圍。本發(fā)明實施例所述不同亞型肉毒神經(jīng)毒素蛋白的活性組合篩選方法，提供了一種可能降低甚至消除免疫抵抗水平的治療新方案。

下面結(jié)合具體實施例進行進一步說明。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件(如《分子 克隆實驗指南》(第三版)(2002,96-98,科學出版社)中所述條件)實施，或遵循試劑供應商建議的方法實施。實施例中所涉及的耗材都購于市場，并無特殊要求。另外，Guo J，et al,Toxicon,2013,74:158-66中發(fā)表的LC/B和LC/TeNT的表達純化，以及它們對內(nèi)源性天然底物的水解效率的測定分析等內(nèi)容均納入本發(fā)明實施例作為參考。

實施例一 單種肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶對內(nèi)源性天然底物的水解效率

首先，構(gòu)建含有各亞型肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶基因的重組載體，以His標簽融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達所述幾種肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶，并利用Ni-NTA agrose(Invitrogen)親和介質(zhì)分離純化得到具有較高純度和濃度的融合蛋白；

其次，依照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法以及遵循供應商的建議，培養(yǎng)出Neuro-2A細胞(ATCC)；

最后，將一定濃度的單種所述融合蛋白與一定體積的Neuro-2A細胞裂解液在10μl反應體系(10mM Tris–HCl pH 7.6和20mM NaCl)中混合，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中20min后加入SDS-PAGE樣品緩沖液終止反應。

將實施例一得到的數(shù)據(jù)以SDS-PAGE和western blotting分析，并以AlphaEaseFC軟件定量被水解的底物，結(jié)果如表1所示，顯示不同的肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶具有不同的內(nèi)源性天然底物水解活性，其中，eSNAP25和eVAMP2分別代表內(nèi)源性天然底物SNAP25和VAMP2；“#”表示水解50％的eSNAP25所需要的LC/A的量；“*”表示水解50％的eSNAP25所需要的LC/E的量。

實施例二 不同肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶的組合對內(nèi)源性天然底物的水解效率

為了進一步分析肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶之間的不同組合是否能夠影響各 自輕鏈蛋白酶對其特異性內(nèi)源性天然底物的水解效率，將兩種不同的肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶與一定體積的Neuro-2A細胞裂解液在10μl反應體系中混合，重復實施例1中的實驗操作。肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶之間的組合遵循如下原則：特異性水解SNAP-25的LCs(如LC/A和LC/E)與特異性水解VAMP-2的LCs(如LC/B，LC/D，LC/F和LC/TeNT)之間進行組合，即組合內(nèi)的兩種LCs水解不同的底物。

結(jié)果如表1所示，表1顯示本發(fā)明實施例2所述的多種肉毒神經(jīng)毒素輕鏈蛋白酶之間的組合都能夠提高各自輕鏈蛋白酶對內(nèi)源性天然底物的水解活性。

實施例三 LC/A&LC/B組合能顯著提高LC/A或LC/B對其特異性內(nèi)源性天然底物的水解效率

對所述實施例1和2分析發(fā)現(xiàn)，在同一衡量標準條件下(即以50％內(nèi)源性天然底物被水解時所需要的LC的量為準)，單獨的LC/A和LC/B分別需要>40000nM和0.5nM才能夠水解50％的相應底物，但在所述兩種LCs的組合中，這一數(shù)值分別降低到了800nM和0.007nM，如表1、圖1A和圖1B所示，圖1A表示單獨LC/A及其在組合LC/A&LC/B和LC/A&LC/F中所表現(xiàn)出的對內(nèi)源性天然底物的水解活性，圖1B表示為單獨LC/B及其在組合LC/A&LC/B中所表現(xiàn)出的對內(nèi)源性天然底物的水解活性，由圖可知，LC/A和LC/B的活性分別提高了>50倍和約72倍。該分析結(jié)果說明，如果把所述組合方案應用于臨床上，有可能顯著降低BoNT/A和BoNT/B及其衍生藥物的使用劑量，從而有可能降低病人產(chǎn)生免疫抵抗的概率。

實施例4 LC/A&LC/F組合能顯著提高LC/A或LC/F對其特異性內(nèi)源性天然底物的水解效率

與實施例3類似，對所述實施例1和2分析發(fā)現(xiàn)，在同一衡量標準條件下(即以50％內(nèi)源性天然底物被水解時所需要的LC的量為準)，單獨的LC/A 和LC/F分別需要>40000nM和125nM才能夠水解50％的相應底物，但在所述兩種LCs的組合中，這一數(shù)值分別降低到了250nM和0.08nM，如表1、圖1A和圖1C所示，圖1A表示單獨LC/A及其在組合LC/A&LC/B和LC/A&LC/F中所表現(xiàn)出的對內(nèi)源性天然底物的水解活性，圖1C表示單獨LC/F及其在組合LC/A&LC/F中所表現(xiàn)出的對內(nèi)源性天然底物的水解活性，由圖可知，LC/A和LC/F的活性分別提高了>160倍和約1562倍。該分析結(jié)果說明，如果把所述組合方案應用于臨床上，有可能顯著降低BoNT/A和BoNT/F及其衍生藥物的使用劑量，從而有可能降低病人產(chǎn)生免疫抵抗的概率。

表1

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。