本發(fā)明涉及農(nóng)林生物質(zhì)資源利用和處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，發(fā)明一種雙功能化離子液體預(yù)處理原生生物質(zhì)提高酶解效率的新方法。
背景技術(shù)：
：隨著石油和煤炭等不可再生資源的短缺和價格的上升，以及人們對環(huán)境污染的關(guān)注，使得僅次于煤炭、石油和天然氣而居于世界能源消費總量第四位的生物質(zhì)能源而備受關(guān)注。生物質(zhì)能源作為一種潔凈而又可再生的能源，是唯一可替代化石能源轉(zhuǎn)化成氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)燃料以及其它化工原料或者產(chǎn)品的碳資源。生物質(zhì)作為低品位的能源形式，將其轉(zhuǎn)化為高品位的液體燃料，是生物能源領(lǐng)域最為重要的研究方向。在木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化過程中，基于糖平臺的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)由于反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點備受青睞。木質(zhì)纖維素原料由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成。半纖維素作為分子黏合劑結(jié)合在纖維素和木質(zhì)素之間，而木質(zhì)素具有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為支撐骨架包圍并加固著纖維素和半纖維素[BioresourceTechnology,1996,55(1):1-33]。木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和纖維素的結(jié)晶度等對纖維素的水解糖化均會產(chǎn)生很大的影響，在生物利用纖維素的過程中，為使微生物更易于利用纖維素，必須對基質(zhì)進行預(yù)處理，以降解木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，提高對纖維素的利用效率[BiotechnologyandBioengineering,1995,45(4):328-336]。傳統(tǒng)的生物質(zhì)前處理方法如：酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、汽爆法、熱水預(yù)處理、氨爆法，但是由于這些方法都存在固有的缺點，例如酸預(yù)處理方法容易產(chǎn)生微生物發(fā)酵抑制物，增加了后續(xù)處理的難度，此外，稀酸對預(yù)預(yù)處理裝置的腐蝕性也是制約其工業(yè)化的重要因素之一；堿處理難以破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度， 與無定形纖維素相比，其酶解時間仍較長；蒸汽爆破法對設(shè)備要求較高，設(shè)備投入大，制約了規(guī)?；瘧?yīng)用。近年來，離子液體以其獨特的優(yōu)勢，成為生物質(zhì)前處理體系的優(yōu)良選擇[Chem.Commun.,2011,47:1405-1421]。與傳統(tǒng)的化學(xué)溶劑相比，離子液體具有以下特點：(1)極低的蒸氣壓，不容易揮發(fā)；(2)具有較寬的液程范圍(從低于或接近室溫到300℃)、較好的化學(xué)穩(wěn)定性及較寬的電化學(xué)穩(wěn)定電位窗口；(3)通過設(shè)計陰陽離子，可調(diào)節(jié)其對無機物、水、有機物及聚合物的溶解性。目前對于離子液體在生物質(zhì)前處理領(lǐng)域的應(yīng)用，主要是應(yīng)用離子液體的超溶解能力，將盡可能多的木質(zhì)素從生物質(zhì)中提取或者是分離出來，因為木質(zhì)素的存在一方面是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻礙的微生物接近纖維素以及半纖維素，另一方面木質(zhì)素會造成酶的無效吸附，使得酶活降低和酶解成本升高[ChemSusChem,2013,6(5):919–927]。但是在移除木質(zhì)素的同時希望盡可能多的保留纖維素和半纖維，這樣有利于更有效的利用生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素。從已有的研究成果上看，1,3-dimethylimidazoliummethylsulfate(MMimMeSO4)[J.WoodChem.Technol.,2007,27,23–33],1-butyl-3-methylimidazoliummethylsulfate(BmimMeSO4)[J.WoodChem.Technol.,2007,27,23–33],1-butyl-3-methylimidazoliumacesulfamate(BmimAce)[GreenChem.,2011,13,3124-3136],1-ethyl-3-methylimidazoliumacesulfamate(EmimAce)[GreenChem.,2011,13,3124-3136]and1-ethyl-3-methylimidazoliumxylenesulfonate(EmimABS)[GreenChem.,2009,11,339–345]。含磺酸陰離子基的離子液體對木質(zhì)素顯示出更好的溶解以及提取效果，但是由于離子液體很容易吸水，而磺酸陰離子基在有水以及加熱的條件下，很溶液水解成酸性基團，這樣纖維素和半纖維素在酸性條件下容易發(fā)生降解。而本發(fā)明提供了一種雙功能化離子液體預(yù)處理原生生物質(zhì)提 高酶解效率的新方法，把堿性基團和磺酸基團相結(jié)合的雙功能化離子液體可以有效的去除木質(zhì)素而又盡可能多的保留纖維素和半纖維素。并且相對于傳統(tǒng)的預(yù)處理方法，處理條件溫和，對實驗設(shè)備要求低，并且離子液體可循環(huán)等優(yōu)點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種雙功能化離子液體預(yù)處理生物質(zhì)提高酶解效率的方法，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：(1)原生生物質(zhì)經(jīng)干燥、粉碎，其平均粒徑控制在20-200目；(2)以雙功能化離子液體為預(yù)處理溶劑，按著生物質(zhì)和離子液體的質(zhì)量比為1:2.5～25混合生物質(zhì)和離子液體，于室溫～200℃下攪拌0.5～36h，然后冷卻至室溫，加入2～10倍離子液體體積的水，過濾，洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理后的生物質(zhì)；(3)按著固液比為1～10mg/ml稱取預(yù)處理后的生物質(zhì)原料加入到檸檬酸鹽緩沖液中，再按著5～30FPU/g預(yù)處理后的生物質(zhì)的比例加入纖維素酶，在100-300r/min，40-60℃下反應(yīng)，酶解時間為0.5-100h，溶液中葡萄糖收率遠遠大于未經(jīng)處理的生物質(zhì)原料所產(chǎn)生的葡萄糖量。所述雙功能化離子液體為含磺酸陰離子基但不含氟的-CHxSO3-陰離子，其中x＝0，1或2；且磺酸陰離子基含堿性基團。所述堿性基團為-NHx，其中X＝0,1或2。所述含磺酸陰離子基的離子液體：優(yōu)選的含磺酸陰離子基的堿性離子液體的陰離子結(jié)構(gòu)如下所示:M1和M2是分別獨立的，-H，-CH3，-C2H5，C3-C16直鏈或帶支鏈的烷烴、烯烴，芳烴，單取代芳烴，二取代芳烴以及多取代芳烴；n為1或2；X為-H，-CH3、-C2H5，C3-C8直鏈或帶支鏈的烷烴、烯烴，芳烴，單取代芳烴，二取代芳烴以及多取代芳烴。所述含磺酸陰離子基的離子液體：所述的陰離子優(yōu)選為[Et2NC3SO3],[Et2NC4SO3],[Me2NC4SO3],[Me2NC3SO3],[n-BuNHC3SO3],[n-BuNHC4SO3],[n-HeNHC3SO3],[i-PrNHC3SO3],[i-PrNHC4SO3],[i-BuNHC3SO3],[i-BuNHC4SO3],[MeNHC4SO3],[MeNHC3SO3],[EtNHC4SO3]或[EtNHC3SO3]。所述含磺酸陰離子基的離子液體：所述的含磺酸陰離子基的離子液體的陽離子為咪唑類有機陽離子、吡啶類有機陽離子、哌啶類有機陽離子、吡咯類有機陽離子、季銨鹽類有機陽離子、季磷鹽類有機陽離子或膽堿類有機陽離子。所述咪唑類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：吡啶類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：哌啶類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：吡咯類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：季銨鹽類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：季磷鹽類有機陽離子結(jié)構(gòu)通式為：膽堿類有機陽離子結(jié)構(gòu)為：其中，R1-R6是分別獨立的，-CH3，-C2H5或者是C3-C6直鏈或帶支鏈的烷烴或烯烴；R7-R10是分別獨立的，-CH3，-C2H5或者是C3-C15直鏈或帶支鏈的烷烴或 烯烴。所述含磺酸陰離子基的離子液體：陽離子優(yōu)選為四甲基胺(Me4N)，四乙基胺(Et4N)，四丁基胺(Bu4N)，1-甲基-3-乙基咪唑(Emim)，膽堿(Ch)。所述的雙功能化離子液體，優(yōu)選的離子液體組合為:陽離子為四甲基胺(Me4N)，四乙基胺(Et4N)，四丁基胺(Bu4N)，1-甲基-3-乙基咪唑(Emim)，膽堿(Ch)中的一種；陰離子為[Et2NC3SO3],[Et2NC4SO3],[Me2NC4SO3],[Me2NC3SO3],[n-BuNHC3SO3],[n-BuNHC4SO3],[n-HeNHC3SO3],[i-PrNHC3SO3],[i-PrNHC4SO3],[i-BuNHC3SO3],[i-BuNHC4SO3],[MeNHC4SO3],[MeNHC3SO3],[EtNHC4SO3],[EtNHC3SO3]中的一種。所述的雙功能化離子液體：優(yōu)選的離子液體為[Ch][Et2NC3SO3],[Ch][Me2NC4SO3],[Ch][n-BuNHC3SO3],[Ch][n-HeNHC3SO3],[Ch][i-PrNHC3SO3],[Ch][i-PrNHC4SO3],[Ch][i-BuNHC3SO3],[Et4N][i-PrNHC3SO3],[Et4N][Me2NC4SO3],[Et4N][Et2NC3SO3],[Et4N][n-BuNHC3SO3],[Et4N][i-BuNHC3SO3],[Me4N][MeNHC3SO3]，[Me4N][MeNHC4SO3]，[Emim][MeNHC3SO3]其中一種或者幾種的混合物。所述的原生生物質(zhì)原料有各種樹木、農(nóng)作物秸稈、農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)副產(chǎn)品、畜禽糞便和能源作物等中的一種或者幾種混合物，所述樹木為軟木和/或硬木。所述的原生生物質(zhì)原料優(yōu)選粒徑為：40-80目；所述的預(yù)處理優(yōu)選溫度為：50-180℃。所述的預(yù)處理后原生生物質(zhì)干燥方法為冷凍干燥或者加熱干燥；加熱干燥溫度為65-110℃。所述檸檬酸緩沖液，濃度為50mmol/L，pH為4.8。本發(fā)明的優(yōu)點在于：(1)離子液體預(yù)處理條件相對溫和，對實驗設(shè)備要求低。(2)與未處理生物質(zhì)原料相比，經(jīng)過雙功能化離子液體預(yù)處理后，酶解效率明顯增強，還原糖收率提高。(3)與傳統(tǒng)的離子液體預(yù)處理工藝相比較，經(jīng)過雙功能化離子液體預(yù)處理后，纖維素和半纖維素最大程度的得到保留，對于工業(yè)上的共發(fā)酵技術(shù)來說這種處理工藝至關(guān)重要。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍不受實施例的限制，如果該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1[Et4N][Me2NC4SO3]120℃預(yù)處理提高桉樹皮酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量500mg按樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計 算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表1。表1時間(h)48244896葡萄糖收率(％)24.4630.3258.1364.5680.33木糖收率(％)21.0721.8645.1648.5460.30實施例2[Et4N][i-PrNHC3SO3]120℃預(yù)處理提高桉樹皮酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量500mg按樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][i-PrNHC3SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表2。表2時間(h)48244896葡萄糖收率(％)16.2524.0036.0039.7348.39木糖收率(％)10.8817.1026.6429.3238.83實施例3[Ch][Et2NC4SO3]120℃預(yù)處理提高桉樹皮酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Ch][Et2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表3。表3時間(h)48244896葡萄糖收率(％)12.8220.0428.1934.4437.73木糖收率(％)10.5416.9522.3229.2232.78實施例4[Ch][n-BuNHC3SO3]120℃預(yù)處理提高桉樹皮酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Ch][n-BuNHC3SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于120℃下攪拌10小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置 于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表4。表4時間(h)48244896葡萄糖收率(％)11.6914.9620.3922.4323.37木糖收率(％)8.4810.4917.7819.5221.32實施例5[Et4N][Me2NC4SO3]180℃預(yù)處理提高桉樹皮酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量500mg桉樹皮粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于180℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入40ml去離子水洗滌、過濾，再用40ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的桉樹皮。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表5。表5時間(h)96葡萄糖收率(％)92.10木糖收率(％)80.20實施例6[Et4N][Me2NC4SO3]140℃預(yù)處理提高速生楊酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量1000mg速生楊粉末(粒徑40-80目)和10g[Et4N][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于140℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入80ml去離子水洗滌、過濾，再用80ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的速生楊。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的速生楊20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前速生楊中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表6。表6時間(h)96葡萄糖收率(％)85.20木糖收率(％)63.20實施例7[Emim][Me2NC4SO3]150℃預(yù)處理提高紅麻芯酶解效率(1)預(yù)處理：準確稱量2000mg紅麻芯粉末(粒徑40-80目)和10g[Emim][Me2NC4SO3]離子液體，置于100ml圓底燒瓶中，于150℃下攪拌6小時；冷卻至室溫后，加入120ml去離子水洗滌、過濾，再用120ml去離子水洗滌濾渣5次，濾渣經(jīng)干燥后記得到預(yù)處理后的速生楊。(2)酶解實驗：精確稱量預(yù)處理后的紅麻芯20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)預(yù)處理前紅麻芯中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表7。表7時間(h)96葡萄糖收率(％)73.20木糖收率(％)60.20對比例1未經(jīng)預(yù)處理的桉樹皮酶解精確稱量未經(jīng)預(yù)處理的桉樹皮20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。定時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)桉樹皮中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表8。表8時間(h)48244896葡萄糖收率(％)2.953.866.487.148.83木糖收率(％)7.288.2115.1116.9118.20對比例2未經(jīng)預(yù)處理的速生楊酶解精確稱量未經(jīng)預(yù)處理的速生楊粉末20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)速生楊中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表9。表9時間(h)96葡萄糖收率(％)6.23木糖收率(％)15.20對比例3未經(jīng)預(yù)處理的紅麻芯酶解精確稱量未經(jīng)預(yù)處理的紅麻芯粉末20mg，置于50ml具塞三角燒瓶中，加入7ml檸檬酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH4.8)和纖維素酶，密封后置于160r/min，50℃的恒溫振蕩器中反應(yīng)。96小時取樣200ul，然后拿出后置于沸水中以猝滅酶解反應(yīng)，離心后，用高效液相色譜測定葡萄糖和木糖的濃度。根據(jù)紅麻芯中葡萄糖和木糖的理論產(chǎn)量，即可計算最終的葡萄糖以及木糖的收率，如表10。表10時間(h)96葡萄糖收率(％)9.10木糖收率(％)17.65當(dāng)前第1頁1 2 3