本發(fā)明涉及熒光定量PCR儀領(lǐng)域，尤其涉及一種利用熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法。

背景技術(shù)：

目前，基因檢測的常用方法主要是熒光定量PCR法，所用儀器為即時(shí)PCR儀，當(dāng)前市場所能提供的產(chǎn)品主要是為科研而設(shè)計(jì)，操作較復(fù)雜，包括數(shù)據(jù)分析的應(yīng)用，需要經(jīng)過培訓(xùn)并在較長期的使用積累經(jīng)驗(yàn)后方可熟練掌握。國內(nèi)只有極少數(shù)廠家可能夠生產(chǎn)此類儀器，這些設(shè)備在功能設(shè)計(jì)上與國外進(jìn)口產(chǎn)品無區(qū)別，因此我國只有較大型的醫(yī)院才擁有熒光定量PCR儀。而目前使用的常規(guī)熒光定量PCR儀，運(yùn)行一次需耗時(shí)2至3小時(shí)之間，以八小時(shí)工作制為例，則一個(gè)工作日最多運(yùn)行3批次(其中包括一次過夜運(yùn)行)，更進(jìn)一步限制了基因檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用。

另外，部分傳統(tǒng)的熒光定量PCR是通過將金屬塊加熱降溫來達(dá)到控制溫度的目的，使DNA得以擴(kuò)增，熒光信號(hào)讀取是從試管底部獲得，故而只能讀取熒光強(qiáng)度。這種熒光定量PCR儀(ABI，Biorad，Ependoff，stretagen等公司)占據(jù)了世界市場(包括中國市場)的主要份額。這些儀器的共同缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間長(約需3小時(shí))，由于調(diào)節(jié)溫度的電子設(shè)備精度要求高，尤其是在升溫或降溫時(shí)，溫度不能過溫，所以在加降溫時(shí)必須提前“剎車”，才能保證不過溫，大大減低了運(yùn)行速度，要達(dá)到溫差正負(fù)不能超過0.5度，增加了技術(shù)難度，造成成本增加，另外，在對(duì)非接觸到試管的金屬加降溫時(shí)，浪費(fèi)了大量的能耗和時(shí)間，這也降低了儀器的運(yùn)行速度。而且在讀取融解曲線時(shí)，要求溫度每升高一度讀取一次數(shù)據(jù)，以獲得融解曲線，故耗時(shí)較長。最新型的Roche Lightcycler熒光定量PCR儀，采用空氣加熱法控制溫度，大大提高了儀器運(yùn)行速度，每一個(gè)循環(huán)僅需40秒，完成40個(gè)循環(huán)也需要約30分鐘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種利用熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法，成功解決了溫度快速循環(huán)的問題。

本發(fā)明提供的一種利用熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法，所述熒光定量PCR儀包括兩個(gè)熱風(fēng)器，所述方法在兩個(gè)分別的熱風(fēng)器下進(jìn)行，包括：

步驟1：將待擴(kuò)增DNA加入到試管中，利用第一個(gè)熱風(fēng)器將試管加熱到95℃，當(dāng)熱啟動(dòng)酶活化后，將第一個(gè)熱風(fēng)器溫度降到60℃；

步驟2：利用第二個(gè)熱風(fēng)器將試管加熱到95℃，試管將在95℃和60℃環(huán)境中高速旋轉(zhuǎn)，DNA獲得高速擴(kuò)增；

步驟3：當(dāng)擴(kuò)增完后，兩個(gè)熱風(fēng)器停止加熱。

本發(fā)明提出的方法具有如下突出的技術(shù)優(yōu)勢：在100個(gè)試管的平臺(tái)上，完成每一個(gè)循環(huán)僅需要5秒鐘，比目前世界上最快的lighcycler快8倍。儀器的檢測系統(tǒng)則可同步采集數(shù)據(jù)繪制出即時(shí)融解曲線，完成40個(gè)循環(huán)僅需不到4分鐘

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

一種利用熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法，熒光定量PCR儀包括兩個(gè)熱風(fēng)器，方法在兩個(gè)分別的熱風(fēng)器下進(jìn)行，包括：

步驟1：將待擴(kuò)增DNA加入到試管中，利用第一個(gè)熱風(fēng)器將試管加熱到95℃，當(dāng)熱啟動(dòng)酶活化后，將第一個(gè)熱風(fēng)器溫度降到60℃；

步驟2：利用第二個(gè)熱風(fēng)器將試管加熱到95℃，試管將在95℃和60℃環(huán)境中高速旋轉(zhuǎn)，DNA獲得高速擴(kuò)增；

步驟3：當(dāng)擴(kuò)增完后，兩個(gè)熱風(fēng)器停止加熱。

本發(fā)明實(shí)施方式中，試管放置在圓盤上，旋轉(zhuǎn)一個(gè)循環(huán)所需時(shí)間為5秒。

本發(fā)明實(shí)施方式中，試管高速旋轉(zhuǎn)的同時(shí)熒光檢測器按每0.05秒收集每一個(gè)試管的數(shù)據(jù)，完成40個(gè)循環(huán)的時(shí)間為3.4分鐘。

本發(fā)明實(shí)施方式中，試管直徑為1.2毫米，長2厘米，管壁厚度為0.05毫米。

本發(fā)明實(shí)施方式中，步驟1中熱啟動(dòng)酶活化的時(shí)間為5-10分鐘。

本發(fā)明實(shí)施方式中，步驟2中轉(zhuǎn)動(dòng)速度為每0.05秒一個(gè)試管。

本發(fā)明實(shí)施方式中，熒光定量PCR儀采用空氣加熱法控制溫度。

本發(fā)明實(shí)施方式中，步驟2中試管升到95℃或降到60℃的時(shí)間為1.5秒。

本發(fā)明采用了四個(gè)關(guān)鍵技術(shù)：

第一固定溫度風(fēng)動(dòng)加降溫。

溫度的變化是保障模板DNA擴(kuò)增的基本要素，只有將雙鏈DNA打開后引物才能互補(bǔ)到模板DNA上，溫度的變化速度決定了擴(kuò)增速度。FDHFS技術(shù)使溫度變化速度大大提高使DNA擴(kuò)增得到大大提升，該技術(shù)采用了兩個(gè)固定風(fēng)動(dòng)加熱法，即節(jié)省了時(shí)間，也節(jié)省了對(duì)升降溫變化的控制難度。

部分傳統(tǒng)的熒光定量PCR是通過將金屬塊加熱降溫來達(dá)到控制溫度的目的，使DNA得以擴(kuò)增，熒光信號(hào)讀取是從試管底部獲得，故而只能讀取熒光強(qiáng)度。這種熒光定量PCR儀(ABI，Biorad，Ependoff，stretagen等公司)占據(jù)了世界市場(包括中國市場)的主要份額。這些儀器的共同缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間長(約需3小時(shí))，由于調(diào)節(jié)溫度的電子設(shè)備精度要求高，尤其是在升溫或降溫時(shí)，溫度不能過溫，所以在加降溫時(shí)必須提前“剎車”，才能保證不過溫， 大大減低了運(yùn)行速度，要達(dá)到溫差正負(fù)不能超過0.5度，增加了技術(shù)難度，造成成本增加，另外，在對(duì)非接觸到試管的金屬加降溫時(shí)，浪費(fèi)了大量的能耗和時(shí)間，這也降低了儀器的運(yùn)行速度。而且在讀取融解曲線時(shí)，要求溫度每升高一度讀取一次數(shù)據(jù)，以獲得融解曲線，故耗時(shí)較長。

第二、高靈敏讀取熒光信號(hào)。

傳統(tǒng)的熒光定量PCR儀大多采用固定波長激發(fā)的原理，獲取數(shù)據(jù)量少，對(duì)一些單一突變DNA判斷容易產(chǎn)生誤差，我們采用多波長掃描，可以有效地克服兩個(gè)基因在某單一波長差異小不易識(shí)別的缺點(diǎn)。

第三、溫度梯度，多點(diǎn)收集數(shù)據(jù)。

傳統(tǒng)熒光定量PCR儀，在測定融解溫度時(shí)是采用逐點(diǎn)讀取的方法，即每升高一度讀取一次熒光量，這同樣也要對(duì)沒有接觸到試管的金屬進(jìn)行加熱，耗時(shí)耗能，我們利用溫度梯度的方法，對(duì)試管部分加熱，使每一試管都形成溫度梯度，在溫度梯度下，也形成了熒光梯度，這個(gè)熒光梯度就代表了該基因的融解曲線，用SIPM元件掃描法可以在0.05秒內(nèi)一次性直接讀取到融解曲線數(shù)據(jù)，進(jìn)一步縮短了時(shí)間，并減低了能耗。

第四、內(nèi)標(biāo)校正誤差。

由于熒光定量PCR反應(yīng)具有很高的靈敏度，微量誤差將造成結(jié)果誤差，尤其在兩兩比較的樣品，為了消除誤差，比如，加樣，環(huán)境，試管差異等誤差。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)特殊內(nèi)標(biāo)，所有的樣品都參照這個(gè)內(nèi)標(biāo)，這個(gè)內(nèi)標(biāo)模板來源于同一個(gè)樣品并且同時(shí)被擴(kuò)增，這樣可有效地消除這些誤差。系統(tǒng)誤差的消除通過內(nèi)標(biāo)來實(shí)現(xiàn)，在反應(yīng)體系內(nèi)另加入一對(duì)特殊設(shè)計(jì)的引物，反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定含量較高的DNA片段稱之為內(nèi)標(biāo)，其熒光信號(hào)將提前出現(xiàn)，相應(yīng)信號(hào)可用于對(duì)隨后出現(xiàn)的樣品信號(hào)的校正。

通過這四個(gè)關(guān)鍵技術(shù)的合理整合，完成DNA的快速擴(kuò)增反應(yīng)，以及融解曲線的快速測定，顯著提高了熒光定量PCR儀運(yùn)行速度，由傳統(tǒng)的熒光定量PCR的約3小時(shí)，提高至約3-4分鐘。本發(fā)明的每一個(gè)循環(huán)僅需要不到5秒，數(shù)據(jù)獲取響應(yīng)時(shí)間小于0.05毫秒，遠(yuǎn)超出現(xiàn)有的熒光定量PCR儀的技術(shù)指標(biāo)；同時(shí)整體設(shè)計(jì)應(yīng)用計(jì)算機(jī)平臺(tái)，操作方便。

本說明書上文中結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了闡釋，但應(yīng)理解，這些描述和闡釋只是為了更好地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本申請(qǐng)說明書之后可對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行必要的改動(dòng)而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書限定，并且涵蓋了權(quán)利要求的等同變換。