本發(fā)明涉及化學(xué)合成領(lǐng)域;具體地說,本發(fā)明涉及用于檢測二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)的化合物。
背景技術(shù):
瘧疾(Malaria)是由寄生性瘧原蟲所引起的嚴(yán)重危害人類健康的蟲媒介傳染病,至今依然是世界上最嚴(yán)重的寄生蟲病之一。瘧疾通過雌性按蚊叮咬被感染者和健康人群持續(xù)傳播。能感染人類并導(dǎo)致瘧疾的致病瘧原蟲有四種,分別是惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)和間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)。其中,惡性瘧原蟲所導(dǎo)致的兇險型瘧疾發(fā)病迅速,病癥強(qiáng)烈且致死率極高。
生物體內(nèi)的嘧啶合成與許多生命活動息息相關(guān),嘧啶合成為DNA和RNA的生成提供原料,而DNA和RNA對于細(xì)胞的生長分裂是不可或缺的。就惡性瘧原蟲而言,其體內(nèi)DNA和RNA復(fù)制只依賴于嘧啶源合成途徑,而惡性瘧原蟲二氫乳清酸脫氫酶(PfDHODH)是瘧原蟲嘧啶源合成途徑中的關(guān)鍵酶(Wu,T.;S.Nagle,A.;K.Chatterjee,A.Road Towards New Antimalarials-Overview of the Strategies and their Chemical Progress.Current Medicinal Chemistry.2011,18(6),853-871),對PfDHODH進(jìn)行熒光檢測對瘧原蟲的定位示蹤及瘧疾的早期預(yù)警、診斷有著極其重要的科學(xué)價值和研究意義(Malmquist,N.A.;Gujjar,R.;Rathod,P.K.;Phillips,M.A.Analysis of flavin oxidation and electron-transfer inhibition in Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase.Biochemistry.2008,47(8),2466-2475)。
長期以來,瘧原蟲的生長周期、耐藥機(jī)理研究尚不透徹,同時現(xiàn)有的瘧疾快速診斷方法如鏡檢染色法、抗體抗原檢測(ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等,這些方法缺點(diǎn)較多,主觀偏差大、耗時長、成本高、操作復(fù)雜嚴(yán)重依賴儀器(Wilson,M.L.Malaria Rapid Diagnostic Tests.Clinical Infectious Diseases,2012,54(11):1637-1641)。化學(xué)發(fā)光檢測手段簡便、靈敏、快捷但利用化學(xué)探 針識別定位瘧原蟲及研究其生命史和機(jī)理目前尚未有報道。
因此,本領(lǐng)域急需能夠簡便、靈敏、快捷地檢測或定位瘧原蟲,從而用于研究其生命史和機(jī)理的物質(zhì)手段和方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便、靈敏、快捷地檢測或定位瘧原蟲的探針化合物以及利用所述化合物研究瘧原蟲的生命史和機(jī)理的方法。
在第一方面,本發(fā)明提供式I所示化合物:
A——L——R
I
式中,
A為色素基團(tuán);
L為連接臂;
R為二氫乳清酸脫氫酶特異性結(jié)合配體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,A是發(fā)射波長介于400nm-800nm的色素基團(tuán),包括各種染料、(熒光)染料或染色劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,L包括2-10個碳原子的飽和或不飽和烷基鏈,或含氧、含硫、含氮或含羰基、酯基、酰胺基的飽和或不飽和烷基鏈。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,R包括二氫乳清酸脫氫酶的抑制劑、拮抗劑、激活劑、抗體等。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,L選自任選取代的C2-C10烷基、任選取代的C4-C10含烯烷基、任選取代的C4-C10含炔烷基、C4-C10含氧醚鏈,如-(CH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2)-,含酯基鏈,如-(CH2)mCOO(CH2)p-,含羰基鏈,如-(CH2)mCO(CH2)p-、O(CH2)qO、O(CH2)qNH、NH(CH2)qO、NH(CH2)qNH、OCO(CH2)qCOO、OCO(CH2)qO、O(CH2)qCOO、NHCO(CH2)qO、O(CH2)qCONH、NHCO(CH2)qCONH、S(CH2)qO、S(CH2)qS、NH(CH2)mO(CH2)mOOC(CH2)n;n=0-2,m=1-5,p=1-5,q=1-10;
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,A選自含合適共軛體系的發(fā)色團(tuán),如萘酰亞胺、4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)、熒光素、羅丹明、香豆素、氟硼熒光染料(BODIPY)、尼羅紅、尼羅藍(lán)、花菁、酞菁、噁菁染料、多次甲基染料、三 芳次甲基染料、偶氮染料及偶氮顏料、靛藍(lán)類染料、氮雜[18]輪烯染料、硝基及亞硝基染料、醌類羰基染料。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,R部分是五元環(huán),包括含O、S雜原子的五元環(huán)母核結(jié)構(gòu)DHODH抑制劑。
在具體的實(shí)施方式中,所述化合物如下式II所示:
式中,
R1為未取代的或被選自下組的取代基取代的稠環(huán)基團(tuán):C1-C5烷基、鹵素、羧基、酯基、氨基;
R2選自:C1-C6烷基,C1-C6不飽和烴基,C1-C6烷基羰基,C1-C6氟代烷基羰基,C1-C6烷氧基,C1-C6氟代烷氧基,任選取代的苯甲酰基,氨基羰基,C1-C6烷氧基羰基,C1-C6氨基羰基,羥基,C1-C6烷氧基、C1-C6酯基;
R3選自O(shè)、NH或S;
R4選自H,C1-C6烷基,任選取代的C2-C6不飽和烴基,C1-C6烷基羰基,任選取代的苯甲?;然?,氨基羰基,C1-C6烷氧基羰基,C1-C6氨基羰基,羥基,C1-C6烷氧基;
R5選自O(shè),S,NH和CH2。
在具體的實(shí)施方式中,R1為含2-3個苯環(huán)的稠環(huán)基團(tuán),優(yōu)選地,R1為萘基。
在具體的實(shí)施方式中,L為(HNCH2CH2OCH2CH2OOC)。
在具體的實(shí)施方式中,所述化合物如下式所示:
在第二方面,本發(fā)明提供一種二氫乳清酸脫氫酶介導(dǎo)的疾病的診斷試劑盒,所述試劑盒裝有本發(fā)明第一方面所述的化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述二氫乳清酸脫氫酶介導(dǎo)的疾病包括惡性瘧疾、間日瘧、卵形瘧疾、三日瘧、猴型瘧、克氏錐蟲、血吸蟲病、登革熱等寄生蟲傳染?。灰约邦愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球疾病、黑色素瘤和同種或異種器官移植引起的宿主排斥反應(yīng)。
在具體的實(shí)施方式中,所述疾病是惡性瘧疾。
在第三方面,本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的化合物在制備二氫乳清酸脫氫酶檢測或定位試劑二氫乳清酸脫氫酶介導(dǎo)的疾病的診斷試劑中的用途。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述二氫乳清酸脫氫酶介導(dǎo)的疾病包括惡性瘧疾、間日瘧、卵形瘧疾、三日瘧、猴型瘧、克氏錐蟲、血吸蟲病、登革熱等寄生蟲傳染??;以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球疾病、黑色素瘤和同種或異種器官移植引起的宿主排斥反應(yīng)。
在具體的實(shí)施方式中,所述疾病是惡性瘧疾。
在第四方面,本發(fā)明提供一種藥物組合物,所述藥物組合物包含:
本發(fā)明第一方面所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽,和
藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附圖說明
圖1顯示了本發(fā)明的化合物與PfDHODH蛋白的結(jié)合情況;
圖2顯示了本發(fā)明化合物與體外培養(yǎng)的受瘧原蟲感染紅細(xì)胞的熒光成像圖像;
圖3顯示了本發(fā)明化合物與伯氏瘧原蟲感染小鼠的血液的檢測以及熒光成像圖像。
具體實(shí)施方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究,出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一類可用于在細(xì)胞及活體水平中特異性檢測PfDHODH的熒光化合物,這些化合物不僅在細(xì)胞水平對惡性瘧原蟲有一定抑制活性,它們還能特異性識別并標(biāo)記感染瘧原蟲的紅細(xì)胞中的DHODH。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
術(shù)語定義
本文中涉及到的一些基團(tuán)定義如下:
本文中,“烷基”指碳鏈長度為1-10個碳原子的飽和的支鏈或直鏈烷基,優(yōu)選的烷基包括長2-8個碳原子、1-6個、1-4個碳原子、1-3個碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、庚基等。烷基可以被1個或多個取代基取代,例如被鹵素或鹵代烷基取代。例如,烷基可以是被1-4個氟原子取代的烷基,或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。
本文中,“酯基”是指-COORx所示的基團(tuán),其中,Rx是如上定義的烷基。
本文中,“芳基”指含有6到14個碳原子的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)芳族基團(tuán),包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、茀基、四氫化萘基、二氫化茚基等。芳基可任選地被1-5個(例如,1、2、3、4或5個)選自以下的取代基取代:鹵素、C1-C4醛基、C1-C6的直鏈或支鏈烷基、氰基、硝基、氨基、羥基、羥甲基、鹵素取代的烷基(例如三氟甲基)、鹵素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、C1-C4的烷氧基、C1-C4取代巰基、嗎啉基、任選取代的芳基(例如任選取代的苯基)、任選取代的芳氧基(例如任選取代的苯氧基)和任選取代的芐氧基。例如,芳基可以被1-3個選自以下的基團(tuán)取代:氟、氯、溴、C1-C4烷基、三氟甲基、嗎啉基、甲氧基、苯基、甲氧基取代的苯基、苯氧基、芐氧基、被鹵素取代的芐氧基、乙氧基和硝基等。
本文所使用的術(shù)語“雜環(huán)基”指單一或稠合的環(huán)結(jié)構(gòu),在性質(zhì)上可以是芳族或非芳族的,并且其優(yōu)選含有3-20個成環(huán)原子,更優(yōu)選含有5-14個環(huán)原子,其中至少1個并且優(yōu)選最多可至4個是選自O(shè)、S和N的雜原子。本文中,雜環(huán)基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、三唑基、噻唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、嗎啉基、咔唑基、二苯并噻吩、香豆素基和1,2-亞甲基二氧苯基。本文中,雜環(huán)基可任選地被1-3個本文所述的取代基取代。
本文所使用的術(shù)語“雜原子”包括O、S和N。當(dāng)雜原子是N時,此N原子可以進(jìn)一步由例如氫或C1-C10烷基的基團(tuán)所取代。當(dāng)雜原子是S時,此S原子可以進(jìn)一步由例如C1-C10烷基的基團(tuán)所取代。
本文所使用的術(shù)語“雜芳基”或“芳香雜環(huán)基”指如上所述具有芳族特性的那些雜環(huán)基,包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、嘧啶基等。
本文所使用的術(shù)語“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。
除非另有說明,本文所使用的術(shù)語“任選取代的”指其所修飾的基團(tuán)可任選地被1-5個(通常為1、2或3個)選自以下的取代基取代:C1-C4烷基、羧基、鹵素、C1-C4烷氧基、氰基、硝基、氨基、羥基、醛基、C1-C6?;⒘u甲基、鹵素取代的C1-C4烷基(例如三氟甲基)、鹵素取代的C1-C4烷氧基(例如三氟甲氧基)、巰基和C1-C4?;?/p>
本文中,酰胺基(氨基羰基)自身或作為其它基團(tuán)的一部分,指“C1-C6烷基-CO-NH-”基團(tuán)、“C3-C8環(huán)烷基-CO-NH-”或“C3-C8環(huán)烷基-C1-C6烷基-CO-NH-”。示例性的酰胺基包括但不限于甲酰胺基、乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基、環(huán)丙酰胺基、環(huán)丙甲酰胺基等。
本文中,酰基自身或作為其它基團(tuán)的一部分,可含有1-6個碳原子,優(yōu)選1-4個碳原子。示例性的?;ǖ幌抻谝阴;?、氟代乙酰基、氟代丙酰基、氟代丁酰基等。
本發(fā)明化合物
本發(fā)明設(shè)計了一類可用于在細(xì)胞及活體水平中特異性檢測PfDHODH的熒光化合物。藥理測試結(jié)果表明本發(fā)明的化合物不僅在細(xì)胞水平對惡性瘧原蟲有一定抑制活性,對PfDHODH具有親和力,同時其還其能在感染瘧原蟲的紅細(xì)胞中特異性識別標(biāo)記DHODH,并選擇性定位于線粒體中。通過伯氏瘧原蟲感染小鼠的血液檢測證明,本發(fā)明的化合物可以準(zhǔn)確地標(biāo)記和示蹤紅細(xì)胞中的瘧原蟲,并且準(zhǔn)確辨別不同時期瘧原蟲的生長形態(tài),量化并簡化瘧原蟲的檢測過程。綜上,這類新型DHODH標(biāo)記型化合物的設(shè)計和發(fā)現(xiàn)將會對于瘧疾的早期診斷和瘧原蟲生命周期、致病機(jī)理研究提供詳實(shí)、有力的證據(jù),也可用于瘧疾的早期診斷和預(yù)防。
在具體的實(shí)施方式中,本發(fā)明提供式I所示化合物:
A——L——R
I
式中,
A為色素基團(tuán),優(yōu)選發(fā)射波長介于400nm-800nm的色素基團(tuán),包括各種染料、(熒光)染料或染色劑;
L為連接臂,包括2-10個碳原子的飽和或不飽和烷基鏈,或含氧、含硫、含氮或含羰基、酯基、酰胺基的飽和或不飽和烷基鏈;
R為二氫乳清酸脫氫酶特異性結(jié)合配體,包括二氫乳清酸脫氫酶的抑制劑、拮抗劑、激活劑、抗體等。
鑒于本發(fā)明的教導(dǎo),本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用任何合適的色素基團(tuán)、連接臂和二氫乳清酸脫氫酶特異性結(jié)合配體。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中,L選自任選取代的C2-C10烷基、任選取代的C4-C10含烯烷基、任選取代的C4-C10含炔烷基、C4-C10含氧醚鏈,如-(CH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2)-,含酯基鏈,如-(CH2)mCOO(CH2)p-,含羰基鏈,如-(CH2)mCO(CH2)p-、O(CH2)qO、O(CH2)qNH、NH(CH2)qO、NH(CH2)qNH、OCO(CH2)qCOO、OCO(CH2)qO、O(CH2)qCOO、NHCO(CH2)qO、O(CH2)qCONH、NHCO(CH2)qCONH、S(CH2)qO、S(CH2)qS、NH(CH2)mO(CH2)mOOC(CH2)n;n=0-2、m=1-5、p=1-5、q=1-10;
A選自含合適共軛體系的發(fā)色團(tuán),如萘酰亞胺、4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)、熒光素、羅丹明、香豆素、氟硼熒光染料(BODIPY)、尼羅紅、尼羅藍(lán)、花菁、酞菁、噁菁染料、多次甲基染料、三芳次甲基染料、偶氮染料及偶氮顏料、靛藍(lán)類染料、氮雜[18]輪烯染料、硝基及亞硝基染料、醌類羰基染料;
R部分是五元環(huán),包括含O、S雜原子的五元環(huán)母核結(jié)構(gòu)DHODH抑制劑。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中,本發(fā)明的化合物如下式II所示:
式中,
R1為未取代的或被選自下組的取代基取代的稠環(huán)基團(tuán):C1-C5烷基、鹵素、羧基、酯基、氨基,R1優(yōu)選為含2-3個苯環(huán)的稠環(huán)基團(tuán),更優(yōu)選為萘基;R2選自:C1-C6烷基,C1-C6不飽和烴基,C1-C6烷基羰基,C1-C6氟代烷基羰基,C1-C6烷氧基,C1-C6氟代烷氧基,任選取代的苯甲?;被驶?,C1-C6烷氧基羰基,C1-C6氨基羰基,羥基,C1-C6烷氧基、C1-C6酯基;R3選自O(shè)、NH或S;R4選自H,C1-C6烷基,任選取代的C2-C6不飽和烴基,C1-C6烷基羰基,任選取代的苯甲?;?,羧基,氨基羰基,C1-C6烷氧基羰基,C1-C6氨基羰基,羥基,C1-C6烷氧基;R5選自O(shè),S,NH和CH2。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用各種結(jié)構(gòu)的連接臂,例如(HNCH2CH2OCH2CH2OOC)所示的連接臂。
在具體的實(shí)施方式中,本發(fā)明提供以下化合物:
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明化合物的吸收和發(fā)射波長涵蓋所有波長范圍,且基本沒有背景熒光干擾,可用作檢測DHODH的熒光探針;
2.本發(fā)明化合物既可特異性結(jié)合二氫乳清酸脫氫酶,又能產(chǎn)生熒光信號。
以下結(jié)合具體實(shí)施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述,但以下實(shí)施案例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制,所有依據(jù)本發(fā)明的原理和技術(shù)手段采用的各種施用方法,均屬于本發(fā)明范圍。在下列合成實(shí)施例中,除非另有說明,否則所用試劑均是從市場上直接購買所得,所用到溶劑使用前均經(jīng)無水處理,所述的常溫是指25℃。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數(shù)按重量計算。
實(shí)施例1.化合物IIA的合成
中間體A的合成
氬氣保護(hù)下,將996mg,5mmol的4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD-Cl)加入到2.5mL的無水DMF中,緩慢滴加630mg,6mmol的2-氨氧基乙醇的2.5mL無水DMF溶液和0.9mL的三乙胺,常溫攪拌過夜,減壓蒸除DMF,二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層濃縮,柱層析(石油醚:乙酸乙酯=1:2,v/v)得紅色固體,收率35%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.46(s,1H),8.50(d,J=8.0Hz,1H),6.47(d,J=8.8Hz,1H),4.61(s,1H),3.72-3.66(m,4H),3.49(brs,4H).
HRMS(ESI)calcd for C10H12N4O5[M-H]-267.0729,found 267.0506.
中間體6-氨基甲酸叔丁酯-2-萘甲酸的合成
將20mmol的6-氨基-2-萘甲酸溶于20mL叔丁醇和20mL水的混合溶液中,依次加入24mmol的二碳酸二叔丁酯和24mmol的氫氧化鈉,常溫反應(yīng)過夜。用 5%鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 2-3,加入大量二氯甲烷萃取,有機(jī)層干燥,濃縮,柱層析(石油醚:乙酸乙酯=1:1,v/v)得米色固體,收率75%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.90(s,1H),9.75(s,1H),8.48(s,1H),8.18(s,1H),7.99(d,J=8.8Hz,1H),7.90(dd,J1=1.6Hz,J2=8.4Hz,1H),7.84(d,J=8.4Hz,1H),6.47(dd,J1=2.0Hz,J2=9.2Hz,1H),1.52(s,9H).
中間體B的合成
冰浴下將5mmol的6-氨基甲酸叔丁酯-2-萘甲酸溶于20mL無水二氯甲烷中,滴加7.5mmol的二甲氨基吡啶(DMAP)和6mmol中間體A的20mL的無水二氯甲烷混合溶液,攪拌半小時后再加入10mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC),2小時后撤去冰浴,常溫反應(yīng)過夜。加入大量二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層干燥,濃縮,柱層析(石油醚:乙酸乙酯=1:2,v/v)得黃色固體,收率50%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.77(s,1H),9.43(brs,1H),8.37(d,J=8.8Hz,1H),8.34(s,1H),8.15(s,1H),7.91(d,J=8.8Hz,1H),7.74(s,2H),7.57(dd,J1=2.0Hz,J2=8.8Hz,1H),6.44(d,J=8.8Hz,1H),4.44-4.42(m,2H),3.84-3.81(m,4H),3.68(brs,2H),1.53(s,9H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ165.7,152.7,148.8,139.7,135.9,130.0,129.8,127.8,127.2,124.9,120.1,112.7,106.6,79.6,68.3,63.7,55.9,28.1,18.5.
HRMS(ESI)calcd for C26H27N5O8[M+Na]+560.1757,found 560.1757.
中間體C的合成
將0.5mmol的中間體B溶于4mL二氯甲烷中,冰浴下滴加1.5mL三氟乙酸,常溫反應(yīng)過夜。用10%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 7-8,加入大量二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層干燥,濃縮,柱層析(二氯甲烷:甲醇=50:1,v/v)得橙紅色固體,收率72%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.49(s,1H),8.41(d,J=8.8Hz,1H),8.20 (s,1H),7.66(d,J=8.8Hz,1H),7.59(d,J=8.4Hz,1H),7.41(d,J=8.4Hz,1H),6.98(dd,J1=2.0Hz,J2=8.8Hz,1H),6.80(d,J=1.6Hz,1H),6.46(d,J=8.8Hz,1H),5.86(s,2H),4.40-4.38(m,2H),3.82-3.80(m,4H),3.68(brs,2H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ166.5,149.9,145.8,144.8,144.4,138.0,130.9,130.8,125.3,125.1,121.6,119.5,105.5,99.9,68.9,63.8,56.5,43.8,19.0.
HRMS(ESI)calcd for C21H19N5O6[M-H]-436.1257,found 436.1263.
中間體D的合成
在50mL燒瓶中加入3mmol的鈉氫(60%)約240mg和1.8mL的無水THF,冰浴下滴加1.8mL含有6mmol的丙二酸二乙酯的無水THF溶液,10分鐘后滴加3mL含有3mmol的氯乙酰氯溶液,維持冰浴一小時,40-45攝氏度反應(yīng)1-2小時,,乙酸乙酯萃取,食鹽水洗滌2次,有機(jī)層濃縮,干燥,柱層析(100%EA),柱層析得白色粉末,GC-MS驗(yàn)證無誤。
化合物IIA的合成
將0.22mmol的中間體D溶于5mL無水THF中,加入0.2mmol的中間體C,40℃下反應(yīng)96小時。加入大量二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層干燥,濃縮,柱層析分離純化(二氯甲烷:甲醇=60:1,v/v)得橙黃色固體。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.50(s,1H),9.41(d,J=2.4Hz,1H),8.42(s,1H),8.29(d,J=8.8Hz,1H),8.05(d,J=8.8Hz,1H),7.91-7.80(m,3H),7.58(dd,J1=2.0Hz,J2=8.8Hz,1H),6.41(d,J=9.2Hz,1H),5.30(s,2H),4.48-4.45(m,2H),4.29(q,J=7.2Hz,2H),3.86-3.82(m,4H),3.67(brs,2H),1.30(t,J=7.2Hz,3H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ188.7,177.3,165.5,163.9,135.1,130.3,130.1,128.0,125.4,123.0,119.5,99.4,87.4,75.4,68.3,68.2,65.5,63.9,59.6,56.0,43.3,18.4,14.4,14.3.
HRMS(ESI)calcd for C28H25N5O10[M-H]-590.1523,found 590.1526.
實(shí)施例2.化合物IIB的合成
中間體A-C的合成如前所述
中間體E的合成
常溫下將溶有4mmol的2,2-二氟丙酸中的5mL無水二氯甲烷溶液滴加到溶有324mg的N,N-二羰基咪唑(2mmol)的5mL無水二氯甲烷溶液,攪拌30min后滴加溶有68mg咪唑(1mmol)和98mg的1,3-環(huán)戊二酮(1mmol),加畢,反應(yīng)6小時。5%鹽酸溶液,飽和食鹽水依次洗滌,有機(jī)層濃縮,干燥,濃縮得粗品,黃色固體,GC-MS驗(yàn)證無誤。
中間體F的合成
常溫下將0.7mL草酰氯加入到0.3mmol的中間體E中,常溫反應(yīng)4小時,常壓蒸除余下的草酰氯,二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層濃縮,干燥,快速柱層析(二氯甲烷:甲醇=100:1,v/v)得黃色油狀液體,收率55%,-35℃ 冰箱保存。
化合物IIB的合成
將0.2mmol的中間體C溶于5mL無水THF中,加入0.2mmol的中間體F,40℃下反應(yīng)96小時。加入大量二氯甲烷萃取,飽和食鹽水洗滌,有機(jī)層干燥,濃縮,柱層析分離純化(二氯甲烷:甲醇=60:1,v/v)得橙黃色固體。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.45(s,1H),8.29(d,J=9.2Hz,1H),8.10(s,1H),8.07(s,1H),7.86(q,J=8.0Hz,2H),7.66(d,J=8.4Hz,1H),6.40(d,J=9.2Hz,1H),4.48-4.46(m,2H),4.39(d,J=4.0Hz,2H),3.86-3.81(m,4H),3.67(brs,2H),2.42-2.39(m,2H),1.95(t,J=18.8Hz,3H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ197.2,165.4,137.5,134.9,130.5,130.4,130.0,128.1,127.1,125.4,124.3,122.3,117.9,107.7,68.2,63.8,55.9,54.8,47.7,47.5,47.3,33.6,25.9,19.9,18.5.
HRMS(ESI)calcd for C29H25N5O8F2[M-H]-608.1590,found 608.1593.
實(shí)施例3.本發(fā)明化合物對細(xì)胞株的抑制活性
本發(fā)明提供的化合物對兩種惡性瘧原蟲細(xì)胞株(3D7和Dd2)的體外活性的抑制效果:
氯喹購于Sigma公司,SYBR Green I購于Life technologies公司,氯喹敏感的3D7細(xì)胞株和氯喹抗性的Dd2細(xì)胞株用于體外測試抗瘧活性,通過Trager and Jensen的培養(yǎng)方法(Human malaria parasites in continuous culture.Science.1976,193(4254):673-675)在含有0.5%Albumax II非人血清的介質(zhì)中培養(yǎng)。以SYBR Green I為探針,通過熒光滴定方法測定抗瘧原蟲細(xì)胞株活性。首先,不同時期的寄生蟲一式三份,在2%的血紅細(xì)胞和在100μL的1%的寄生蟲血癥與一系列的藥物存在或不存在條件下培養(yǎng),稀釋時每個化合物濃度0.15625變化到20μM。0.2%DMSO作為反向?qū)φ?,不同濃度的氯喹作為正向?qū)φ铡E囵B(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)3天,然后取出上清液,并加入100μL of SYBR Green I的細(xì)胞緩沖液(8.26 g/L NH4Cl,1g/L KHCO3,0.037g/L EDTA和5×SYBR Green I)。培養(yǎng)皿在暗室中常溫繼續(xù)培養(yǎng)1小時,通過Synergy MX,Biotek熒光檢測器在485/520nm下讀數(shù),重復(fù)2次本實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)分析是根據(jù)Michael等報道的方法進(jìn)行改進(jìn)獲得。簡述如下,陰性對照處理組獲得的熒光數(shù)據(jù)減去未感染紅細(xì)胞組所產(chǎn)生的背景熒光數(shù)據(jù),代表本次實(shí)驗(yàn)中正常培養(yǎng)的惡性瘧原蟲中的DNA最大量,記為陰性對照孔的熒光數(shù)據(jù),各測試組及陽性對照組的熒光數(shù)據(jù)均如此校正。不同濃度下抑制率的計算由下式所得:抑制率(%)=〔1-(測試孔中平均熒光計數(shù)/陰性對照孔中平均熒光計數(shù))〕×100%。通過軟件Origin 8.0中的Growth/Sigmoidal程序擬合曲線并計算獲得半數(shù)抑制率(IC50 values),通過Microsoft Excel計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例3的結(jié)果如下表:
實(shí)施例4.本發(fā)明化合物與靶蛋白的結(jié)合
將含有PfDHODH基因的片段克隆到PET-19b載體中,得到重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá),分別經(jīng)過固定金屬離子親和色譜和凝膠過濾色譜純化后,得到較純的蛋白,將純化好的PfDHODH蛋白稀釋到終濃度為2mg/mL,分裝成兩管,每管500μL,一管加25μL母液為50mM的本發(fā)明化合物(IIA),另一管加25μL DMSO作為對照,冰上孵育30min,用PCR管分裝蛋白,將加化合物和DMSO的蛋白分別分裝12管,每管30μL,用PCR儀在不同溫度下(37℃,40℃,43℃,46℃,49℃,52℃,55℃,58℃,61℃,64℃,67℃,70℃)分別加熱3min,化合物和對照進(jìn)行相同的處理,加熱完后,4℃高速離心半小時,分別取上清2μL,用Buffer稀釋到100μL,制備蛋白樣品進(jìn)行western blot,最后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影,得到結(jié)果如圖1所示。
由圖1所知,與只加DMSO的對照相比,加入本發(fā)明化合物后,對pfDHODH蛋白起一定的穩(wěn)定作用。加DMSO的對照組,Tm=53.77℃,而加入本發(fā)明化合物的實(shí)驗(yàn)組,Tm=56.94℃,使Tm值增大了3.2℃,即,本發(fā)明化合物對PfDHODH 蛋白有結(jié)合,并且在一定程度上能夠?qū)ζ淦鸱€(wěn)定作用。
鑒于PfDHODH蛋白蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,構(gòu)象處于不停變化中,不同構(gòu)象下的能壘不同,穩(wěn)定性亦不同;本實(shí)施例證明,加入本發(fā)明物(IIA)后,其與蛋白質(zhì)結(jié)合,與之間未結(jié)合時相比,蛋白質(zhì)更穩(wěn)定,因此說明本發(fā)明化合物與靶蛋白的結(jié)合效果較好。
實(shí)施例5.本發(fā)明化合物與體外培養(yǎng)的受瘧原蟲感染紅細(xì)胞的熒光成像
用DMSO溶解本發(fā)明化合物(IIA)至50mM。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定量惡性瘧原蟲(湖州師范學(xué)院周洪昌老師惠贈),平均分兩皿,標(biāo)記為A和B;將A、B培養(yǎng)皿中的惡性瘧原蟲用5%山梨醇間隔一天同步,培養(yǎng)兩天;向A和B培養(yǎng)皿中加入本發(fā)明化合物至終濃度為10μg/mL,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5小時,之后向A、B培養(yǎng)皿中加入熒光染料Red CMXROS(購自Life Technologies)至終濃度為500nM,放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min;將兩個培養(yǎng)皿中感染惡性瘧原蟲的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中,在1800rpm,3min條件下離心,去掉上清,用PBS洗三遍;分別制作血涂片,用共聚焦顯微鏡定位。Red CMXROS:激發(fā)波長為579nm,發(fā)射波長為599nm;IIA:激發(fā)波長為480nm,發(fā)射波長為530nm。結(jié)果如圖2所示。
由圖2所見,在嚴(yán)重感染的紅細(xì)胞中,血紅蛋白變性,降解成黑色沉淀物,即瘧色素,這是肉眼區(qū)分正常紅細(xì)胞和受感染紅細(xì)胞的粗略方法。A-F為不同視野內(nèi)IIA在細(xì)胞內(nèi)的定位效果,在明顯含有瘧色素的紅細(xì)胞中,細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,同時Tracer進(jìn)行疊合發(fā)現(xiàn),IIA僅作用于細(xì)胞線粒體中,明亮如小星。而在未感染瘧原蟲的紅細(xì)胞中,沒有出現(xiàn)熒光信號,說明本發(fā)明化合物具有良好的細(xì)胞水平靶向性。
實(shí)施例6.本發(fā)明化合物對伯氏瘧原蟲感染小鼠的血液的檢測及熒光成像
昆明種小鼠(雄性,20±2g,購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司),接種伯氏瘧原蟲(第二軍醫(yī)大學(xué)潘衛(wèi)慶老師惠贈)200μL;在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠感染情況,當(dāng)感染率達(dá)到20%時,采用眼球取血的方法取血。加入本發(fā)明化合物(IIA)至終濃度為10μg/mL,熒光染料Red CMXROS至終濃度為500 nM;在37℃條件下孵育15min;在1800rpm,3min條件下離心,去掉上清,用PBS洗三遍;制作血涂片,用共聚焦顯微鏡定位。
由圖3所示,A-D不同視野下可見不同生長周期的瘧原蟲。如圖3A所示,明場下紅細(xì)胞內(nèi)小圈即處于環(huán)狀體階段的瘧原蟲;如圖3B或3C所示,明場下紅細(xì)胞內(nèi)帶有黑色素大圈即晚期的大滋養(yǎng)體,其中小點(diǎn)即小滋養(yǎng)體。不同生長周期的瘧原蟲雖然形態(tài)、體積不一,但I(xiàn)IA都可對其進(jìn)行選擇性標(biāo)記,且熒光強(qiáng)度與瘧原蟲形態(tài)、體積成一定的正相關(guān)。大滋養(yǎng)體中熒光亮而大,而小滋養(yǎng)體中熒光如小星。不僅如此,正常紅細(xì)胞完全不顯熒光,特異性強(qiáng)、背景信噪極低。
對比例
本發(fā)明人進(jìn)一步合成了包含其它連接臂的多種化合物,當(dāng)利用這些化合物重復(fù)以上實(shí)施例4-6時,發(fā)信這些化合物或無法結(jié)合PfDHODH,或無法與體外培養(yǎng)的受瘧原蟲感染紅細(xì)胞進(jìn)行熒光成像,或無法與瘧原蟲感染的小鼠血液進(jìn)行熒光成像。
發(fā)明人認(rèn)為,由于本發(fā)明將色素基團(tuán)經(jīng)連接臂與二氫乳清酸脫氫酶特異性配體結(jié)合起來,最終獲得的化合物是否能夠兼具與二氫乳清酸脫氫酶特異性結(jié)合以及產(chǎn)生熒光信號的功能是無法合理預(yù)知的;換言之,本發(fā)明化合物中色素基團(tuán)、連接臂與二氫乳清酸脫氫酶特異性結(jié)合配體之間可能會互相影響,從而不利地影響最終所得化合物與二氫乳清酸脫氫酶的結(jié)合特異性或者色素基團(tuán)產(chǎn)生熒光的能力。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。