本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及含有抗草甘膦基因的植物表達載體。
背景技術(shù)：
：草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、廣譜、低毒、低殘留、易于被微生物分解，不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。自從1976年美國孟山都公司的草甘膦類除草劑-農(nóng)達(Roundup)研制成功并得到廣泛應(yīng)用以來，作物抗草甘膦轉(zhuǎn)基因研究成為抗除草劑基因工程研究的熱點。隨著抗草甘膦基因克隆的發(fā)展，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼問世并大面積推廣應(yīng)用，這些轉(zhuǎn)基因作物具有如下優(yōu)點：(1)減少除草劑總用量，使雜草防治費用下降，增加農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟效益；(2)所用除草劑品種廣譜、選擇性強、對環(huán)境友好、使用方便，特別適用于保水，減輕土壤侵蝕及石油耗量少的少耕與免耕體系，減少機械耕作作業(yè)，大大節(jié)省能源；(3)解決了常規(guī)除草劑難以防治的特殊雜草問題，如稻田的野生稻、赤稻、寬葉臂形草、圓葉牽牛、大果田菁；小麥田的雀麥(Bromusspp)、莎草(Cyperusspp)；大豆田的鴨趾草、薊、苣荬菜、純?nèi)~決明以及寄生雜草。(6)解決土壤長殘留性除草劑對后茬作物的傷害。轉(zhuǎn)基因作物所使用的草甘膦無土壤殘留，故對后茬作物十分安全。草甘膦的作用機理主要是競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該酶是真菌、細菌、藻類和高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中一個關(guān)鍵性的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的類似物，是EPSPS競爭性抑制劑，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)結(jié)合形成EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合體(此復(fù)合體非常穩(wěn)定)，抑制EPSPS的活性導(dǎo)致分支酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導(dǎo)致一些激素和關(guān)鍵性代謝物如類黃酮、木質(zhì)素和酚類化合物代謝失調(diào)，從而擾亂了生物體正常的氮代謝而使其死亡。棉花是全球最重要的植物纖維作物，主要種植于熱帶或亞熱帶的干旱地區(qū)。草害嚴重威脅著棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量。除草劑的推廣使用，可大幅度減少棉田管理用工，降低勞動強度。目前推廣的棉花品種對除草劑不具有抗性，經(jīng)常出現(xiàn)藥害現(xiàn)象，對棉花植株造成一定的損傷，培育抗除草劑作物品種是防止除草劑藥害最有效的途徑。因此，本領(lǐng)域持續(xù)需要培育更多的防止除草劑藥害的抗除草劑作物品種。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明利用抗草甘膦基因mc2-epsps，構(gòu)建含該基因的植物雙價表達載體，并利用不同啟動子驅(qū)動目的基因的表達。通過植物遺傳轉(zhuǎn)化，可以獲得高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物。更具體而言，本發(fā)明人將抗草甘膦基因mc2-epsps基因用不同啟動子驅(qū)動，構(gòu)建出雙價植物表達載體。因此，在第一方面中，本發(fā)明的目的是提供一種植物表達載體，所述植物表達載體是含有兩個拷貝的抗草甘膦基因mc2-epsps的環(huán)形載體。優(yōu)選地，所述兩個拷貝的抗草甘膦基因相同。在一個實施方案中，所述抗草甘膦基因mc2-epsps編碼的蛋白質(zhì)可以為下述a1)或a2)：a1)氨基酸序列為序列表中SEQIDNO.1所示序列的蛋白質(zhì)；a2)氨基酸序列與a1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列相比有一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加、且具有草甘膦抗性的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，在本發(fā)明的植物表達載體中，所述抗草甘膦基因編碼序列為序列表中SEQIDNO.2所示序列。在本發(fā)明的植物表達載體中，所述兩個拷貝的抗草甘膦基因優(yōu)選分別在兩個表達盒中，所述第一表達盒中啟動抗草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的啟動子可以為來自擬南芥激動蛋白基因(ActinⅡ)的啟動子，所述啟動子序列如序列表中SEQIDNO.3所示；所述第二表達盒中啟動抗草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的啟動子可以為來自棉花1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因(Rubisco)啟動子，所述啟動子序列如序列表中SEQIDNO.4所示。在本發(fā)明的植物表達載體中，所述啟動子和抗草甘膦基因之間優(yōu)選還包括來自矮牽牛5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因(epsps)的葉綠體導(dǎo)肽，所述葉綠體導(dǎo)肽序列如序列表中SEQIDNO.5所示。在本發(fā)明的植物表達載體中，終止所述兩個抗草甘膦基因表達的終止序列可以均為NosT；優(yōu)選地，NosT的序列如序列表中SEQIDNO.6中所示的第235-504位；優(yōu)選地，所述兩個抗草甘膦基因在兩個表達盒中。在本發(fā)明的植物表達載體中，所述抗草甘膦基因和終止子之間優(yōu)選還包括用來促進剪切的PS(Processing&Splicingsequence)序列；優(yōu)選地，其序列如序列表中SEQIDNO.6中的第1-228位。在第二方面中，本發(fā)明的目的在于提供一種含有本發(fā)明第一方面的植物表達載體的重組細胞系或轉(zhuǎn)基因微生物，以及用本發(fā)明第一方面的植物表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或植株。在一個具體的實施方案中，所述重組細胞系或轉(zhuǎn)基因微生物為農(nóng)桿菌，例如菌株LBA4404。在第三方面中，本發(fā)明的目的在于提供本發(fā)明第一方面的抗草甘膦表達載體或本發(fā)明第二方面的重組細胞系或轉(zhuǎn)基因微生物在抗草甘膦植物品種中的應(yīng)用。優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括如下步驟：1)向目的植物中導(dǎo)入本發(fā)明第一方面的植物表達載體或本發(fā)明第二方面的重組細胞系或轉(zhuǎn)基因微生物，得到同時表達本發(fā)明的植物表達載體中兩個拷貝抗草甘膦基因的轉(zhuǎn)基因植物；2)從步驟1)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，草甘膦抗性增強的轉(zhuǎn)基植物。在一個具體的實施方案中，所述植物為棉花。發(fā)明人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將本發(fā)明的雙價植物表達載體遺傳轉(zhuǎn)化至棉花，在轉(zhuǎn)基因植物中獲得增量表達。發(fā)明人還對獲得轉(zhuǎn)基因棉花分別在T0和T1代進行不同強度的草甘膦篩選，大部分轉(zhuǎn)基因植株未有明顯的藥害癥狀，生長正常，而陰性對照全部死亡。以上結(jié)果表明構(gòu)建的雙價抗草甘膦植物表達載體可賦予棉花較好的草甘膦抗性，獲得草甘膦抗性更強的轉(zhuǎn)基因植物，從而提供了一種獲得抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選方案。附圖說明圖1是中間載體p3質(zhì)粒圖譜，圖中Kanamycin為卡那霉素。圖2是中間載體p4質(zhì)粒圖譜，圖中inner為內(nèi)，outer為外。圖3是基礎(chǔ)植物表達載體pBIOT1011質(zhì)粒圖譜。圖4是中間載體pBS-ACTII-MC2質(zhì)粒圖譜。圖5是中間載體pBS-RUBP-MC2質(zhì)粒圖譜。圖6是中間載體pBIOT-ACTII-MC2質(zhì)粒圖譜。圖中，inner為內(nèi)，outer為外。圖7是雙價植物表達載體pBIOT-ACTII-MC2-RUBP-MC2質(zhì)粒圖譜。圖中，inner為內(nèi)，outer為外。具體實施方式實施例1雙價mc2-epsps植物表達載體構(gòu)建植物表達載體的改造：以pCAMBIA2300(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)為模板，擴增卡那霉素耐藥基因(aadA)至質(zhì)粒復(fù)制原點(pVS1ori)的序列,在5’端添加EcoRⅠ和PvuⅠ酶切位點，在3’端添加ScaⅠ和EcoRⅠ酶切位點，引物序列為SEQIDNO：7、SEQIDNO：8，擴增得到的片段命名為片段A。利用EcoRⅠ酶切片段A，自邊環(huán)化得到載體p3。合成LB至RB端序列，為了提高遺傳轉(zhuǎn)化中陽性植株比例、降低轉(zhuǎn)基因植物基因組中載體骨架DNA的發(fā)生率、增加低拷貝轉(zhuǎn)化事件頻率，對LB和RB端進行修飾，在其內(nèi)部增加識別切割元件，中間加入兩個刪除標(biāo)記loxP位點(SEQIDNO：9)，使轉(zhuǎn)基因后代通過與轉(zhuǎn)環(huán)化重組酶基因(cre)的植株雜交，刪除標(biāo)記基因的表達框，序列兩端分別含PvuI，ScaI酶切位點，命名為片段B，具體序列如SEQIDNO：10所示。通過PvuI和ScaI酶切載體p3和片段B，將片段B連入載體p3(圖1)中，獲得重組質(zhì)粒p4(圖2)。以植物表達載體pBI121(購自北京華夏遠洋科技有限公司)為模板，擴增NPTII基因表達框，引物序列為SEQIDNO：11、SEQIDNO：12，所得片段兩端分別帶BamHI和XhoI位點，命名為片段C。利用BamHI和XhoI酶切片段C，BglII和SalI酶切p4質(zhì)粒，將片段C連入p4質(zhì)粒中，得到優(yōu)化的基礎(chǔ)植物表達載體pBIO1011(圖3)?？共莞熟⒒騧c2-epsps基因(下文簡稱mc2)由從陸地棉冀棉14中克隆，經(jīng)人為修飾獲的，具休修飾方法參考專利：PCT/CN/2013/082238，201380008110.6。構(gòu)建mc2基因的雙價植物表達載體。為了增加mc2基因在植物體內(nèi)的表達量，預(yù)防相同啟動子可能引起的基因沉默問題，分別利用來自擬南芥的激動蛋白基因的啟動子(ActⅡ)和來自棉花的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因的啟動子(RUBP)驅(qū)動mc2基因的表達。因EPSPS是在葉綠體中催化芳香族氨基酸的合成，因此在mc2基因的5端融合來自矮牽牛epsps基因的葉綠體導(dǎo)肽序列(ptp)，ptp序列如SEQIDNO：5所示。構(gòu)建過程如下：參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide，編號為GenBank:CP002686.1中的序列，從擬南芥中克隆啟動子ActⅡ，使其5端帶SpeI酶切位點，3端帶PstI酶切位點，引物序列如SEQIDNO：13、SEQIDNO：14所示?？寺“珷颗５膃psps基因的葉綠體導(dǎo)肽序列，使其5端帶PstI酶切位點，3端帶NcoI酶切位點，引物序列為SEQIDNO：15、SEQIDNO：16所示。設(shè)計mc2基因的引物，使其5端帶NcoI酶切位點，3端帶XhoI酶切位點，引物序列為SEQIDNO：17、SEQIDNO：18。合成PS序列(Processing&Splicingsequence，序列已在專利號為95119563.8中的中國專利中公開)，序列如SEQIDNO.6中的第1-228位所示，在其5端加XhoI位點，3端加SacI位點。以pBI121為模板擴增得到Tnos序列，其5端加SacI位點，3端加EcoRI位點，引物序列為SEQIDNO：19、SEQIDNO：20。通過酶切拼接的方法，將ActⅡ-ptp-mc2-PS-Tnos克隆至pBluescriptⅡSK(+)，獲得重組質(zhì)粒pBS-ActⅡ-MC2(圖4)。參考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide，編號為GenBank:DQ648074的序列，從棉花中克隆RUBP啟動子，使其5端加KpnI位點，3端加PstI位點，引物序列為SEQIDNO：20、SEQIDNO：21。同上所述，通過酶切拼接的方法，將RUBP-ptp-mc2-PS-Tnos克隆至pBluescriptⅡSK(+)，獲得重組質(zhì)粒pBS-RUBP-MC2(圖5)。利用KpnⅠ和HindⅢ同時酶切pBS-ActⅡ-MC2和pBIO1101，將ActⅡ-ptp-mc2-PS-Tnos片段連入pBIO1101中，得到重組載體pBIO-ActⅡ-MC2。利用SpeI和KpnI同時酶切pBS-RUBP-MC2和pBIOT-ActⅡ-MC2(圖6)，將RUBP-ptp-mc2-PS-Tnos片段連入載體pBIOT-ActⅡ-MC2中，得到mc2基因雙價植物表達載體pBIOT-RUBP-MC2-ActinⅡ-MC2(圖7)。實施例2轉(zhuǎn)雙價mc2-epsps基因棉花的獲得這里使用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。具體操作程序為：1.菌株培養(yǎng)將所構(gòu)建的抗草甘膦基因植物表達載體通過電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin，rif)25mg/L的LB(胰蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L)或YEB(牛肉浸膏5g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO45ml/L)液體培養(yǎng)基中。28℃振蕩暗培養(yǎng)過夜到細菌生長對數(shù)期。用LB或YEB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，再振蕩培養(yǎng)4-6h，將菌液稀釋至OD600值0.3-0.35。2.無菌苗制備(1)棉花種子用硫酸(H2SO4)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇對種子進行表面消毒1min，再用10％-15％過氧化氫(H2O2)處理2-4h，用無菌水沖洗2-3次；(2)在無菌水中浸泡18-24h，待種子露白，再在無菌條件下剝?nèi)シN皮，種入種苗培養(yǎng)基(1/2MS+瓊脂6g/L，pH6.8)中；MS培養(yǎng)基(18.78mMKNO3，1.25mMKH2PO4，20.6mMNH4NO3，1.5mMMgSO4，3.0mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNaEDTA，100μMFeSO4)。(3)25℃-28℃光培養(yǎng)3-5d備用。3.棉花外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)取步驟2制備的無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，浸入步驟1得到的稀釋好的菌液中5-10min，然后取出胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2.4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+瓊脂6g/L，pH5.0，表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。22℃-25℃共培養(yǎng)2天。4.誘導(dǎo)愈傷組織將步驟3得到的經(jīng)共培養(yǎng)后的下胚軸段放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+Km50100mg/L+Cef500mg/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)，在常規(guī)條件下(25℃)培養(yǎng)2個月(一個月?lián)Q一次相同的培養(yǎng)基)。5.愈傷組織的增殖繼代將步驟4誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+MgCl20.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，在常規(guī)條件下(25℃)培養(yǎng)，每隔一個月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。6.愈傷組織的分化及轉(zhuǎn)基因苗移栽愈傷組織經(jīng)步驟5繼代幾次后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(無NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天門冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91-1.35g/L+Gelrite2.0-3.0g/L+葡萄糖20-30g/L,pH5.8)，進一步分化成胚狀體，胚狀體長成為小植株后再轉(zhuǎn)入大的三角瓶中，待根長好后練苗移栽。洗去再生棉株根部的培養(yǎng)基，栽到滅菌蛭石中，澆足營養(yǎng)液。栽好的再生棉苗放入控溫22℃、控濕80-85％的人工培養(yǎng)箱中5-7d，再在溫室中培養(yǎng)10-20d，獲得可嫁接抗性小苗?？剐灾仓杲?jīng)過PCR鑒定后嫁接并移栽，獲得轉(zhuǎn)基因棉花共279株。實施例3T0代轉(zhuǎn)基因棉花抗性鑒定待實施例2中的轉(zhuǎn)基因苗嫁接移栽成活后，于6-8葉期噴施3000ppm草甘膦溶液(草甘膦商品制劑農(nóng)達：孟山都)，每平方米噴灑45ml(即30L/畝)，每次噴灑后7-14天觀察癥狀，以非轉(zhuǎn)基因受體材料冀棉14作為陰性對照。轉(zhuǎn)雙價mc2基因的轉(zhuǎn)基因棉花有69個轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)抗草甘膦特性。抗性植株嚴格自交授粉，因組培操作、溫室栽培條件等影響，部分抗性植株育性較差，收到52個株系的T1代自交種。實施例4T1代轉(zhuǎn)基因棉花抗性鑒定于第二年正季在深圳龍崗生物園溫室內(nèi)播種實施例3得到的T1代自交種，分別在棉花的2-4葉期、8-10葉期于作物上方及周邊噴施3000ppm草甘膦，用量及時期如表1所示，每次噴藥時以20株受體材料冀棉14作為陰性對照，每次噴施后7-14天觀察癥狀，并在花期對抗性植株進行育性觀察。表1T1代轉(zhuǎn)基因棉花草甘膦噴施時期及用量每次噴施草甘膦異丙胺鹽溶液后，陰性對照均表現(xiàn)葉片枯萎、嫩尖死亡，藥害隨著時間加重，后期均死亡。但轉(zhuǎn)基因植株在噴施兩次草甘膦異丙胺鹽后，部分植株出現(xiàn)葉片萎蔫失綠等癥狀，在受試的1610株T1代陽性轉(zhuǎn)基因材料中，有973株植株基本生長正常、無明顯藥害，對草甘膦表現(xiàn)較好的耐受性，抗性植株百分比平均值為60.48％。具體結(jié)果見表2。表2.T1代轉(zhuǎn)基因棉花抗草甘膦功能鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)基因株系試驗植株數(shù)抗性植株數(shù)抗性植株百分比(％)1352674.292412560.983462247.834392358.975381950.006371745.957292172.418361850.009351645.7110352468.5711392974.3612411536.5913492551.0214311754.8415252080.0016241562.501737924.3218402870.0019392666.6720352160.0021341750.0022291862.0723232086.9624221672.7325342161.7626392051.2827371848.6528292172.412912650.0030191052.6331262180.7732372362.1633291551.7234362775.003516425.0036321959.3837251768.003812325.0039191578.9540312064.5241332369.7042372670.2743392871.7944281967.8645241666.6746292379.314711545.4548292068.9749312167.7450381744.7451231982.615216956.25平均值311960.48冀棉14-13000冀棉14-23000序列：SEQIDNO：1：MetAlaCysLeuProAspAspSerGlyProHisValGlyHisSerThrProProArgLeuAspGlnGluProCysThrHisMetAlaSerGluIleValLeuGlnProIleAsnGluIleSerGlyThrValLysLeuProGlySerLysSerLeuSerAsnArgIleLeuLeuLeuAlaAlaLeuSerGluGlyThrThrValValGluAsnLeuLeuAsnSerAspAspValHisHisMetLeuValAlaLeuGlyLysLeuGlyLeuTyrValLysHisAspSerGluLysLysGlnAlaIleValGluGlyCysGlyGlyGlnPheProValGlyLysGlyGluGlyGlnGluIleGluLeuPheLeuGlyAsnAlaGlyIleAlaMetArgSerLeuThrAlaAlaIleThrAlaAlaGlyGlyAsnSerSerTyrValLeuAspGlyValProArgMetArgGluArgProIleGlyAspLeuValThrGlyLeuLysGlnLeuGlyAlaAspValAspCysIleLeuGlyThrAsnCysProProValArgIleGluGlyLysGlyGlyLeuProGlyGlyLysValLysLeuSerGlySerIleSerSerGlnTyrLeuThrAlaLeuLeuMetAlaAlaProLeuAlaLeuGlyAspValGluIleGluIleIleAspLysLeuIleSerIleProTyrValGluMetThrMetLysLeuMetGluArgPheGlyValThrValGluHisThrAspSerTrpAspArgPhePheIleArgGlyGlyGlnLysTyrMetSerProGlyAsnAlaTyrValGluGlyAspAlaSerSerAlaSerTyrPheLeuAlaGlyAlaAlaValThrGlyGlyThrValThrValGluGlyCysGlyThrSerSerLeuGlnGlyAspValLysPheAlaGluValLeuGluMetMetGlyAlaLysValThrTrpThrGluAsnSerValThrValThrGlyProProArgAsnSerSerGlyArgLysHisLeuArgAlaIleAspValAsnMetAsnLysMetProAspValAlaMetThrLeuAlaValValAlaLeuTyrAlaAspGlyProThrAlaIleArgAspValAlaSerTrpArgValLysGluThrGluArgMetIleAlaIleCysThrGluLeuArgLysLeuGlyAlaThrValGluGluGlyProAspTyrCysValIleThrProProGluLysLeuAsnValThrAlaIleAspThrTyrAspAspHisArgMetAlaMetAlaPheSerLeuAlaAlaCysAlaGluValProValThrIleLysAspProGlyCysThrArgLysThrPheProAspTyrPheGluValLeuAspArgValThrLysHisSEQIDNO：2：1ATGGCTTGTCTTCCCGATGACTCTGGACCTCATGTGGGTCACTCCACTCCTCCACGCCTC61GATCAAGAACCCTGCACCCATATGGCTTCAGAGATTGTGCTTCAACCAATTAATGAAATT121TCGGGTACTGTTAAGTTACCTGGGTCTAAATCATTGTCTAATCGGATCCTGCTCTTAGCT181GCTTTATCTGAGGGAACTACTGTGGTTGAAAATTTGTTGAACAGTGATGATGTTCATCAC241ATGCTTGTTGCTTTGGGTAAACTTGGTCTGTATGTGAAACATGATAGTGAAAAGAAACAA301GCCATTGTTGAAGGTTGTGGTGGTCAGTTTCCAGTCGGAAAAGGTGAAGGTCAAGAAATA361GAGCTTTTCCTCGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGATCTCTTACTGCCGCTATTACAGCT421GCCGGTGGCAATTCGAGCTACGTACTTGATGGCGTACCCCGAATGAGAGAGAGGCCGATC481GGGGACTTAGTTACTGGTCTTAAGCAGCTCGGTGCTGATGTTGATTGCATTCTTGGCACG541AATTGTCCCCCTGTTCGTATAGAAGGAAAGGGTGGTCTTCCCGGGGGAAAGGTGAAACTC601TCTGGGTCTATTAGTAGTCAATACTTGACAGCTTTACTCATGGCGGCTCCGTTGGCTCTT661GGGGATGTGGAAATTGAGATAATTGATAAACTTATTTCCATCCCTTATGTGGAAATGACT721ATGAAGTTGATGGAAAGGTTTGGGGTCACCGTGGAGCACACTGATAGCTGGGATCGATTC781TTTATCCGAGGAGGTCAAAAGTATATGTCTCCTGGAAATGCTTATGTTGAAGGTGATGCT841TCGAGTGCCAGTTACTTCCTTGCGGGTGCAGCAGTCACGGGTGGGACTGTCACAGTAGAA901GGATGTGGAACAAGTAGTTTACAGGGTGATGTAAAATTTGCCGAGGTTCTTGAGATGATG961GGTGCCAAAGTCACCTGGACCGAGAATAGCGTAACTGTCACCGGACCCCCAAGAAATTCC1021TCGGGGAGGAAACACTTGCGTGCTATTGATGTCAACATGAACAAAATGCCGGACGTTGCT1081ATGACTCTTGCTGTTGTTGCTCTTTACGCTGATGGTCCAACTGCCATAAGAGATGTGGCA1141AGTTGGAGAGTGAAGGAGACCGAAAGGATGATTGCTATATGCACAGAACTCCGGAAGCTC1201GGAGCAACAGTCGAAGAAGGGCCGGATTATTGCGTGATCACACCACCAGAGAAATTAAAC1261GTGACAGCAATCGATACTTATGATGATCACCGAATGGCTATGGCATTCTCTCTAGCCGCA1321TGCGCTGAGGTTCCAGTTACCATCAAGGATCCTGGTTGTACCCGGAAAACCTTCCCTGAT1381TACTTTGAAGTTCTCGATAGAGTTACGAAGCATTGACTCGAGGCTGAGTASEQIDNO：3：1GTCGACAAAATTTAGAACGAACTTAATTATGATCTCAAATACATTGATACATATCTCATC61TAGATCTAGGTTATCATTATGTAAGAAAGTTTTGACGAATATGGCACGACAAAATGGCTA121GACTCGATGTAATTGGTATCTCAACTCAACATTATACTTATACCAAACATTAGTTAGACA181AAATTTAAACAACTATTTTTTATGTATGCAAGAGTCAGCATATGTATAATTGATTCAGAA241TCGTTTTGACGAGTTCGGATGTAGTAGTAGCCATTATTTAATGTACATACTAATCGTGAA301TAGTGAATATGATGAAACATTGTATCTTATTGTATAAATATCCATAAACACATCATGAAA361GACACTTTCTTTCACGGTCTGAATTAATTATGATACAATTCTAATAGAAAACGAATTAAA421TTACGTTGAATTGTATGAAATCTAATTGAACAAGCCAACCACGACGACGACTAACGTTGC481CTGGATTGACTCGGTTTAAGTTAACCACTAAAAAAACGGAGCTGTCATGTAACACGCGGA541TCGAGCAGGTCACAGTCATGAAGCCATCAAAGCAAAAGAACTAATCCAAGGGCTGAGATG601ATTAATTAGTTTAAAAATTAGTTAACACGAGGGAAAAGGCTGTCTGACAGCCAGGTCACG661TTATCTTTACCTGTGGTCGAAATGATTCGTGTCTGTCGATTTTAATTATTTTTTTGAAAG721GCCGAAAATAAAGTTGTAAGAGATAAACCCGCCTATATAAATTCATATATTTTCCTCTCC781GCTTTGAATTGTCTCGTTGTCCTCCTCACTTTCATCAGCCGTTTTGAATCTCCGGCGACT841TGACAGAGAAGAACAAGGAAGAAGACTAAGAGAGAAAGTAAGAGATAATCCAGGAGATTC901ATTCTCCGTTTTGAATCTTCCTCAATCTCATCTTCTTCCGCTCTTTCTTTCCAAGGTAAT961AGGAACTTTCTGGATCTACTTTATTTGCTGGATCTCGATCTTGTTTTCTCAATTTCCTTG1021AGATCTGGAATTCGTTTAATTTGGATCTGTGAACCTCCACTAAATCTTTTGGTTTTACTA1081GAATCGATCTAAGTTGACCGATCAGTTAGCTCGATTATAGCTACCAGAATTTGGCTTGAC1141CTTGATGGAGAGATCCATGTTCATGTTACCTGGGAAATGATTTGTATATGTGAATTGAAA1201TCTGAACTGTTGAAGTTAGATTGAATCTGAACACTGTCAATGTTAGATTGAATCTGAACA1261CTGTTTAAGGTTAGATGAAGTTTGTGTATAGATTCTTCGAAACTTTAGGATTTGTAGTGT1321CGTACGTTGAACAGAAAGCTATTTCTGATTCAATCAGGGTTTATTTGACTGTATTGAACT1381CTTTTTGTGTGTTTGCAGCTCATAAAAASEQIDNO：4：1cggtgatagaaaaaggcaaggtttgttcattgatcattgcagaagcactactcccacgat61cattttgttgttgtatcctgggagacagacgaccaacgtttctccaagtaccctaggaac121tgccgaatccatcttatggaaactgtgaaaacaggcctcaacatctagtaaaactcgatt181ccttattcgatttctgatttttcaagatcttgtttatttaattatttttcagatatgatg241ttttaaataaatataaatatttatttaatttgttttgtttagatctggtgtttttacatg301aatataaatatttgtttatattatttgttcaagatcttgtatttaatataaatagttata361tttatatttattcactaaagtattttatctaacatataacttttcagtaattatcaaata421ttcattttctttcaataattcatatcttcaagattaaaagatttagtttagtattgttat481atttattgagtgtgtattaatgttttgtacaggaatccgttggattttggtcttgtgtaa541attagctgtggttgtgggtaaataaatgtgtgcctttcttctttctccaaacatactgaa601tataattattggcatttcaagtgtggcataatataaaaaaatggttggcttcatcataat661ctgttttccaggagactaacaggccacactttgacctccaaatttagaaaatatttccag721agttggaaattgtatttgtaataccctaatatttgtacactgcagtgaacatggacaatc781atgtcatgatgcagaactataaaattgtgccaactctccttcttctccccctttttcttc841caaaactatatcctcgaaaatggtgacatcaaacttcctttcgtttatcaaaggttcacc901cctcacattactgggtcctgttcgcatctcaaggcaatcaaacatggaatccatatatat961gaatcttccccaatccttgttgtagattctttggggatacaagcctttttgtttgtattt1021aaatacaaaaaagggaaaaagaaaagcgccatctataactgcatgctaatgattgccaaa1081atcactgtttgttttgttggaaggctttcaatgttgcggggtcttgaagtaagagcctgt1141ttcagtaacttgccattaattctctcatacattccaatcctaaaaaatgcttccatcttt1201tagctgcaacagtttataatcatcagaaaggtctagtcagaataatattaccttctcctt1261tttaacagtttttttttttttaaatcatgccactacaactgtagctgcgctcatgttaac1321aattaattcctataatcgacatcaaaattatatgaaagaattaacacttggttaccgagt1381taccatatttgaagataaggcgaaaggtaaaaacacaaaaggcaagcatgaccaagcaaa1441caaggtatggacatagattttttttgaatcgggaatggccaaatgggaccgtgaagaggg1501gacaaaggagaaatcaggcattcacggtttccattggatgaaatgagataagatcactgt1561gcttcttccacgtggcaggttgccaaagataaggctttaccattcaagaaaagtttccac1621cctctttgtggtcataatggttgtaatgtcatctgatttaggatccaacggtcacccttt1681ctcccaaaccaatctctaaatgttgtgagcttaggccaaattttatgactatatataggg1741gattgcaccaaggcagtgacactattaagggatcagtgagactcttttgtataactgtag1801catatagtactagtaagcagtaatagcaSEQIDNO：5：ATGGCACAAATTAACAACATGGCTCAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTTCC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